常 虹，高 燕，王思威，王瀟楠，劉艷萍，孫海濱

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】黃地老虎（Agrotis segetumDenis and Schiffermüller）是一種重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲，隸屬于鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），廣泛分布于亞洲、歐洲和非洲等地。黃地老虎主要為害棉花、馬鈴薯、玉米和十字花科蔬菜等作物，可對我國農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)造成較大損失［1-2］。同時，它也是一種重要的遷飛害蟲，已有研究表明其在我國進(jìn)行季節(jié)性遷飛［3-4］。遷飛可促進(jìn)種群間的基因交流，極大降低不同地理種群間遺傳分化的程度。對黃地老虎種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，有助于探討不同地理種群間的遺傳分化關(guān)系，揭示其遷飛路徑及起源，進(jìn)而為明確該蟲的種群發(fā)生動態(tài)及成災(zāi)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微衛(wèi)星又稱簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR），是一類由1～6 個核苷酸簡單串聯(lián)重復(fù)組合而形成的核苷酸序列，一般由中心的重復(fù)序列和兩端的保守序列構(gòu)成。微衛(wèi)星具有共顯性遺傳、多態(tài)性信息含量高、具有很高的突變速率及穩(wěn)定性高、實驗重復(fù)性好等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于種群遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳分化等種群遺傳學(xué)的研究［5-8］。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要是指在基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA 序列多態(tài)性，具有分布廣泛、數(shù)量豐富、遺傳穩(wěn)定性高、較高DNA 降解耐受性等特點，被用于群體遺傳分析及品種鑒定等研究［9-12］。傳統(tǒng)的SSR 和SNP分子標(biāo)記的開發(fā)需要構(gòu)建基因組文庫進(jìn)行克隆測序，檢測過程繁瑣且費時費力。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)為非模式生物SSR 和SNP 位點的挖掘提供了一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的途徑。因此，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選SSR 和SNP 位點被廣泛應(yīng)用于動植物的研究中［13-16］。黎東海等［13］基于齒緣刺獵蝽Sclomina erinacea轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出的SSR 位點設(shè)計出54 對SSR引物，對其9 個不同地理種群進(jìn)行驗證，有16 對引物能較好擴(kuò)增出目的片段。桑迪等［14］基于意大利蝗Calliptamus italicus轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計出6對可用于擴(kuò)增10 個不同地理種群目的片段的SSR引物。目前，有關(guān)黃地老虎的研究，主要集中在人工飼養(yǎng)、生物學(xué)特性、預(yù)測預(yù)報和防治技術(shù)等方面［17-19］，而對其種群遺傳結(jié)構(gòu)方面的研究甚少。Wu 等［20］僅對黃地老虎線粒體基因組進(jìn)行簡單分析，并未利用線粒體基因?qū)ζ湎到y(tǒng)發(fā)育和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究?！颈狙芯壳腥朦c】對害蟲種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，不僅能夠分析出害蟲在我國現(xiàn)有地理分布格局的形成機(jī)制，而且能夠了解該蟲在不同地理種群間的遺傳分化與基因流，結(jié)合該蟲在我國的遷飛與氣象資料，還能夠推測該蟲在我國的遷飛規(guī)律及各發(fā)生危害區(qū)間的蟲源關(guān)系。黃地老虎作為一種重要的遷飛性農(nóng)業(yè)害蟲，缺少對其種群遺傳結(jié)構(gòu)方面的研究，明確黃地老虎SSR和SNP 位點信息可為研究該蟲種群遺傳結(jié)構(gòu)提供數(shù)據(jù)支撐?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對黃地老虎轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，對其SSR 和SNP 位點的組成和特征進(jìn)行研究，初步建立黃地老虎的分子標(biāo)記，為今后研究黃地老虎的種群遺傳結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及RNA 提取

黃地老虎成蟲采自山東省煙臺市蓬萊區(qū)北隍城鄉(xiāng)長島試驗基地（站）（38°23.20′N，120°54.50′E）。選取鱗片完整且活力充沛的個體放在1.5 mL的離心管內(nèi)，迅速置于液氮中致死，將樣品存放于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)直至使用。

在已滅菌的研缽中加入液氮預(yù)冷，將黃地老虎樣品倒入預(yù)冷的研缽中，迅速研磨直至研磨成粉末狀，期間不斷補(bǔ)充液氮。將約80 mg 粉末狀樣品轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管內(nèi)，加入1 mL TransZol Up（北京全式金公司）溶液后，采用RNA 提取試劑盒（TransZol Up Plus RNA Kit，北京全式金公司）提取總RNA。對總RNA 質(zhì)量采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測；Nanodrop 分光光度計（IMPLEN，CA，USA）對總RNA 濃度和純度進(jìn)行檢測；利用Agilent 2 100（Agilent Technologies，CA，USA）檢測RNA的完整性。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序及序列拼接

將檢測質(zhì)量合格的總RNA，委托深圳市恒創(chuàng)基因科技有限公司用Illumina HiSeq 2500 進(jìn)行測序，共3 個生物學(xué)重復(fù)，測序深度為10 Gb。對測序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除包含接頭的序列及低質(zhì)量序列，使用Trinity 軟件對去重復(fù)的clean reads 進(jìn)行De novo 組裝，獲得Unigene 序列。

1.3 SSR 和SNP 信息分析

對測序獲得的黃地老虎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用MicroSAtellite（MISA）軟件對Unigene 進(jìn)行檢測，得到SSR 位點信息［21］。此外，利用GATK 軟件對黃地老虎SNP 信息進(jìn)行分析［22］。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

黃地老虎轉(zhuǎn)錄組經(jīng)Illumina 測序后，共得到74 067 260 條原始數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)過濾后，得到73 724 516 條clean reads，其中，Q20 為93.52%，Q30 為85.81%，表明測序質(zhì)量較好。組裝后共得到66 469 條Unigene 序列，序列長度主要分布于200～2 000 bp 之間，占總序列的89.88%，平均長度868 bp。隨著Unigene 序列長度的逐漸增加，所含序列數(shù)量呈階梯式下降（圖1），該結(jié)果同生物的序列長度分布規(guī)律相一致，說明該轉(zhuǎn)錄組組裝質(zhì)量較好。

圖1 Unigene 序列長度分布Fig.1 Unigene Distribution of length in Unigene distribution

2.2 SSR 位點分析

對獲得的66 469 條Unigene 序列利用MISA軟件進(jìn)行搜索，共得到SSR 位點4 438 個。分布于4 048 條Unigene 序列上，占總序列的6.09%；其中包含多個微衛(wèi)星位點的序列有345 條，復(fù)合型SSR 有125 條。

對SSR 位點的核苷酸重復(fù)類型進(jìn)行分類，共得到6 種重復(fù)類型，各重復(fù)類型間所包含的SSR 位點的數(shù)目相差較大；其中，重復(fù)類型最多的是單核苷酸重復(fù)（2 429 個），占總位點的54.73%；六核苷酸重復(fù)類型的位點數(shù)最少，占比0.95%（表1）。黃地老虎SSR 總長度為67 966 bp，其中單核苷酸重復(fù)序列總長度最長，為37 215 bp，平均每1 552 bp 出現(xiàn)1 個單核苷酸重復(fù)，其平均長度為15.32 bp；六核苷酸重復(fù)SSR 位點總長度最短，為1 056 bp，其平均長度為25.14 bp。6 種重復(fù)類型序列總長度為67 966 bp，平均每850 bp 出現(xiàn)1 個重復(fù)序列，其平均長度為15.31 bp（表1）。

表1 SSR 位點重復(fù)類型數(shù)量與分布Table 1 Number and distribution of SSR loci repeats

黃地老虎轉(zhuǎn)錄組SSR 位點信息中共發(fā)現(xiàn)82種重復(fù)基元，其中單核苷酸重復(fù)基元種類最少，為2 種；六核苷酸重復(fù)基元種類最多，為25 種。A/T 為單核苷酸重復(fù)基元中的優(yōu)勢基元，共有SSR 位點2 356 個，分別占單核苷酸重復(fù)基元和總SSR 位點的96.99%和53.09%。二核苷酸重復(fù)基元中的優(yōu)勢基元為AC/GT 和CG/CG；三核苷酸重復(fù)基元中的優(yōu)勢基元是ATC/ATG 和CCG/CGG；四核苷酸重復(fù)基元中的優(yōu)勢基元是AAAT/ATTT 和AAAG/CTTT；五核苷酸重復(fù)基元中的優(yōu)勢基元是AAATC/ATTTG 和AATAG/ATTCT；六核苷酸重復(fù)基元中的優(yōu)勢基元是CCCGCG/CGCGGG（表2）。

表2 優(yōu)勢基元SSR 位點數(shù)量與分布Table 2 Number and distribution of SSR loci with dominant motifs

黃地老虎轉(zhuǎn)錄組中SSR 基元重復(fù)次數(shù)在不同基元類型間存在較大差異，包含4～24 次重復(fù)；且重復(fù)次數(shù)隨著基元核苷酸數(shù)的增加而呈下降趨勢。單核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)類型最多，共有13 種重復(fù)單元長度，為12～24，其中12 次重復(fù)所占比例最高，占單核苷酸SSR 位點的32.24%。六核苷酸重復(fù)基元形成3 種重復(fù)單元長度，其中4 次重復(fù)所占比例最高，占六核苷酸SSR 位點的88.10%（表3）。

表3 不同基元SSR 重復(fù)次數(shù)分布Table 3 Distribution of SSR repeats of different motifs

對黃地老虎轉(zhuǎn)錄組SSR 位點序列長度進(jìn)行分析，SSR 位點序列長度分布在12～127 bp 之間。SSR 位點序列長度在12～19 bp的SSR 位點有3 493 個，其中，SSR 長度為12 bp的位點數(shù)量最多，占總位點的25.39%；長度為15 bp的SSR 位點數(shù)量次之，占總位點的22.49%。SSR 位點序列長度大于等于20 bp的SSR 位點有820 個，占總位點的19.01%（圖2）。

圖2 SSR 位點序列長度分布Fig.2 Distribution of length in SSR loci sequences

2.3 SNP 位點分析

黃地老虎轉(zhuǎn)錄組Unigene 序列共包含SNP 位點371 148 個，包括237 619 個轉(zhuǎn)換類型和133 529 個顛換類型；轉(zhuǎn)換類型（64.02%）顯著大于顛換類型（35.98%）。C/T 在所有變異類型中所占比率最高，占總量的18.61%；G/A 位居其次（18.28%），且這兩種變異均屬于轉(zhuǎn)換類型。在顛換類型中，A/T 所占比例最高，占總量的6.93%；G/C 所占比例最低，占總量的3.29%（圖3）。

圖3 SNP 變異類型統(tǒng)計結(jié)果Fig.3 Statistical results of variation types of SNP

3 討論

本研究基于黃地老虎轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，對其SSR 及SNP 位點信息進(jìn)行分析。黃地老虎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共獲得66 469 條Unigene 序列，共搜索到SNP 位點371 148 個，平均每155 bp 出現(xiàn)一個SNP 位點。黃地老虎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中SNP 變異的轉(zhuǎn)換位點有237 619 個，顛換位點有133 529 個，說明其SNP 變異類型以轉(zhuǎn)換類型為主，該結(jié)果與東方螻蛄Gryllotalpa orientialis［23］、椰心葉甲嚙小蜂Tetrastichus brontispae［24］的研究結(jié)果一致。本研究中轉(zhuǎn)換位點是顛換位點的1.78 倍，小于理論值（轉(zhuǎn)換/顛換=1 ∶2），說明堿基的突變可能不是隨機(jī)的，應(yīng)該與進(jìn)化過程中的選擇機(jī)制相關(guān)［25］。在轉(zhuǎn)換類型中，C/T 所占的比率最高，可能是由于甲基化的C 進(jìn)行脫氨后就可以變成T 有關(guān)［26］。

黃地老虎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中共搜索到SSR 位點4 438 個，分布于4 048 條Unigene 序列上，發(fā)生頻率為6.09%，比已報道的部分昆蟲如扶桑綿粉蚧Phenacoccus solenopsis（5.79%）［27］、桔小實蠅Bactrocera dorsalis（4.23%）［28］、麥紅吸漿蟲Sitodiplosis mosellana（3.49%）［29］的發(fā)生頻率高；而比東方黏蟲Mythimna separate（9.85%）［30］、荔枝蒂蛀蟲Conopomorpha sinensis（15.25%）［31］、意大利蝗（17.58%）［14］和沙棘木蠹蛾Eogystia hippophaecolus（35.14%）［32］等昆蟲的發(fā)生頻率低，不同昆蟲間SSR 發(fā)生頻率差異較大，造成該結(jié)果的原因可能與物種自身進(jìn)化有關(guān)，也可能同用于建庫的總RNA 質(zhì)量、測序深度以及數(shù)據(jù)分析時參數(shù)設(shè)置有關(guān)［15］。

黃地老虎轉(zhuǎn)錄組中的SSR 包括6 種重復(fù)類型，其中單堿基重復(fù)是含量最高的重復(fù)類型，該結(jié)果與東方黏蟲［30］、荔枝蒂蛀蟲［31］、椰心葉甲嚙小蜂［24］、梨小食心蟲Grapholitha molesta［16］等的研究結(jié)果相一致。其次，三堿基重復(fù)的含量也較高，在桔小實蠅［28］、二點委夜蛾Athetis lepigone［33］、黏蟲Mythimna separata［34］等昆蟲中，三堿基重復(fù)是含量最高的重復(fù)類型，導(dǎo)致三堿基重復(fù)含量較高的原因可能在于其較其他重復(fù)類型更加穩(wěn)定，每3 個核苷酸翻譯1 個氨基酸，為保證蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能不產(chǎn)生變化，使得其極少產(chǎn)生移碼突變［35］。

前人研究表明，由于C 易于甲基化突變成T，推測在動植物體內(nèi)GC/CG的含量會很低，有些甚至不含該重復(fù)基元［36-37］。然而，本研究中CG/CG 含量是除AC/GT 外含量最高的二堿基重復(fù)，該結(jié)果同一些鱗翅目昆蟲如二點委夜蛾［33］、東方黏蟲［30］和細(xì)梢小卷蛾Rhyacionia leptotubula［38］的研究結(jié)果相一致，可能是由于鱗翅目昆蟲自身的進(jìn)化導(dǎo)致其含量較高，需要進(jìn)一步研究。

SSR 多態(tài)性是判斷序列能否作為分子標(biāo)記的重要依據(jù)，而SSR 序列長度是影響SSR 多態(tài)性的主要因素，且序列長度與多態(tài)性成正比［36,39］。研究結(jié)果表明，SSR 多態(tài)性極低的序列其長度小于12 bp，SSR 多態(tài)性中等的序列其長度在12～20 bp 之間，而SSR 多態(tài)性較高的序列其長度大于等于20 bp［39］。本研究中，黃地老虎SSR 位點序列長度在12～19 bp的SSR 位點有3 493 個，屬于SSR 中度多態(tài)性位點；大于等于20 bp的SSR 位點有820 個，屬于SSR 高度多態(tài)性位點?？傮w來說，黃地老虎具有相對較高的遺傳多態(tài)性。

4 結(jié)論

本研究基于黃地老虎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，對黃地老虎SSR 和SNP 位點信息進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該蟲轉(zhuǎn)錄組中包含SNP 位點371 148 個和SSR 位點4 438 個；SNP 以轉(zhuǎn)換類型（64.02%）為主；SSR位點共存在6 種重復(fù)類型，以5 次重復(fù)（21.67%）為主，其序列長度為12～127 bp，包含3 493 個中等多態(tài)性位點和820 個高度多態(tài)性位點。研究結(jié)果表明該蟲SNP 和SSR 位點數(shù)較多，SSR 重復(fù)類型豐富，且序列長度較長，具有較高的遺傳多態(tài)性，可為研究黃地老虎遺傳多樣性提供充分的遺傳信息，用于黃地老虎種群遺傳分化的研究。