張 舒，于小航，張 樂(lè)，蘇 寧，趙麗麗，段 銘

（吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062）

【研究意義】1976 年Kolakofasky［1］在 植物病毒中首次發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）。circRNA 是一類內(nèi)源性非編碼RNA［2］，由前體 mRNA 反向剪接產(chǎn)生，具有不同于傳統(tǒng)線性RNA的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，無(wú)5′帽子結(jié)構(gòu)和3′poly（A）尾，是一類功能強(qiáng)大的調(diào)控型非編碼RNA［3］。circRNA 在真核生物中廣泛存在，并且大部分進(jìn)化保守，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠避免因核酸擴(kuò)增或外切酶導(dǎo)致的降解，因此在細(xì)胞質(zhì)中存在時(shí)間比線性RNA 更持久［4］。甲型流感病毒（Influenza A Virus，IAV）是單股負(fù)鏈RNA包膜病毒，屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），由于其傳播和變異速度極快，且致病率和致死率高，嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物的健康及生命安全［5-6］。然而，宿主編碼的circRNA 在IAV 感染過(guò)程中的作用及其機(jī)制相關(guān)研究尚處于起步階段。本研究探討IAV 感染過(guò)程中宿主hsa_circ_004389的表達(dá)及其表達(dá)對(duì)IAV 復(fù)制的影響，研究結(jié)果豐富了我們對(duì)circRNA 在IAV 和宿主中互作、功能的認(rèn)識(shí)。

【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)數(shù)千種circRNA。circRNA 在不同種類的細(xì)胞中數(shù)量不同，尤其在腦細(xì)胞中極其豐富［7-11］。circRNA 是由mRNA 外顯子或內(nèi)含子反向剪接構(gòu)成的共價(jià)閉合環(huán)狀RNA［12］，具有復(fù)雜的生物學(xué)作用機(jī)制。作為一種新型的非編碼RNA，circRNA 在許多致病過(guò)程中都發(fā)揮重要功能［13］，參與宿主的免疫應(yīng)答［14-17］。例如，在漢坦病毒（Hantaan Virus，HTNV）的復(fù)制中，宿 主circ_0000479 通過(guò)間接調(diào)節(jié)RIG-I的表達(dá)阻礙病毒復(fù)制［18］。病毒編碼的circRNA 在疾病發(fā)展中同樣也產(chǎn)生非常重要的影響［19］；皰疹病毒（Epstein Barr Virus，EBV）編碼的circLMP2A 在SNU-4th 細(xì)胞系中表達(dá)增加，并通過(guò)靶向miR-3908/TRIM59/p53 軸在誘導(dǎo)和維持干細(xì)胞表型中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，在卡西波肉瘤相關(guān)皰疹病毒、乳頭瘤病毒、腦心肌炎病毒、人巨細(xì)胞病毒等的感染中發(fā)現(xiàn)，circRNA 對(duì)病毒的復(fù)制也起著一定作用［20］。IAV 傳染是一種相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程，現(xiàn)有的研究成果指出IAV 在傳播至肺部后，會(huì)促進(jìn)肺部釋放大量的促炎細(xì)胞激素和趨化因子，從而導(dǎo)致機(jī)體的免疫反應(yīng)［21］。

【本研究切入點(diǎn)】宿主編碼的circRNA 在IAV 感染復(fù)制過(guò)程中功能及機(jī)理目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)室前期基于基因芯片技術(shù)檢測(cè)了IAV 感染的A549 細(xì)胞中差異表達(dá)的circRNA，其中hsa_circ_004389的表達(dá)顯著上調(diào)?！緮M解決的問(wèn)題】為進(jìn)一步探究circ_004389 在流感病毒復(fù)制中的功能，本研究在IAV 病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)和不同感染復(fù)數(shù)條件下，采用熒光定量PCR 等方法對(duì)hsa circ 004389的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探索circ_004389 和IAV 感染之間的關(guān)系。經(jīng) Poly I∶C和 LPS 處理A549 細(xì)胞后，采用熒光定量PCR 等方法檢測(cè)circ_004389的表達(dá)情況，探索在IAV感染中誘導(dǎo)circ_004389 表達(dá)變化的誘因。然后用IFNβ 和JAK的抑制劑處理細(xì)胞后用qPCR 檢測(cè)circ_004389的表達(dá)情況，探索circ_004389的表達(dá)變化和JAK-STAT 信號(hào)通路之間的關(guān)聯(lián)。circ_004389 過(guò)表達(dá)和敲低后，用qPCR 和Western blot 在mRNA 和蛋白水平上檢測(cè)該環(huán)狀RNA 對(duì)IAV 復(fù)制的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試IAV毒株、11日齡無(wú)特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）雞胚由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室提供，A549、THP-1、A172、Caco-2 和SY5Y 細(xì)胞由人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存。

pHB-circBasic 載體購(gòu)自漢恒生物科技有限公司Trizol（TaKaRa）和反轉(zhuǎn)錄試劑（MonScriptTMRTlll All-in-one Mix with dsDNase）購(gòu)自武漢Monad 生物科技有限公司；qPCR 反應(yīng)試劑（PowerUPTMSYBRTMGreen Master Mix）購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；聚肌苷酸胞苷酸（Polyinosinic:polycytidylic acid，poly I∶C）、脂多糖（大腸桿菌O55∶B5來(lái)源）和TPCK 胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公 司；Lipofectamine LTX ＆ PLUSTMReagent、Lipofectamine RNAiMAX 試劑、超純瓊脂糖凝膠購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；抗IAV-M1 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 有限公司；抗β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling 有限公司；辣根酶標(biāo)志山羊抗小鼠IgG（H+L）購(gòu)自美國(guó)Santa 有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含100 mg/L 青霉素、100 U/mL 鏈霉素和10%（V/V）胎牛血清（Hyclone）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Corning）培育A549 細(xì)胞和THP-1 細(xì)胞；用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（Corning）培育A172、Caco-2 和SY5Y 細(xì)胞，并且將細(xì)胞置于4% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.3 病毒感染

將IAV 毒株于11 日齡SPF 雞胚中培育，在生長(zhǎng)48、72 h 后，將雞胚置于4 ℃過(guò)夜并采集尿囊液。細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%后，用PBS 溶液洗滌細(xì)胞，用含有1 mg/L TPCK 胰蛋白酶的培養(yǎng)基和感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of Infection，MOI）=2的病毒混勻后感作，吸附1 h 后換成正常細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞處理

用Poly I∶C 和LPS 分別處理A549 細(xì)胞：以24 孔板為例，將A549 細(xì)胞鋪板，次日細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)，分別加入poly I∶C 和LPS。設(shè)置poly I∶C 終濃度分別為0.1、1、10 μg/mL，LPS 終濃度為1μg/mL，24 h 后提取總RNA。

IFNβ和信號(hào)通路抑制劑Ruxolitinib處理細(xì)胞：以24 孔板為例，將A549 細(xì)胞鋪板，次日細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%。分別加入FNβ 和Ruxolitinib。設(shè) 置IFNβ 終濃度分別為1、1、100 ng/mL，Ruxolitinib 終濃度分別為5、10 μmol/L。分別處理2 h 后感染IAV，方法同1.3。病毒感染24 h 后提取總RNA。

1.5 質(zhì)粒、siRNA 和poly I∶C 轉(zhuǎn)染

利用pHB-circBasic 載體構(gòu)建hsa_circ_004389的真核表達(dá)質(zhì)粒。抑制hsa_circ_004389 表達(dá)的siRNA 序列為5＇-CAGGAUUCGAUGAGAUUGA-3＇，由上海吉瑪公司制備合成。按照Lipofectamine LTX＆ PLUSTMReagent 和Lipofectamine RNAiMAX試劑說(shuō)明書分別進(jìn)行質(zhì)粒、siRNA 和poly I∶C 轉(zhuǎn)染。

1.6 RNA 提取、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）和半定量PCR 檢測(cè)

將經(jīng)poly I∶C、LPS、IFNβ 和Ruxolitinib 不同處理后的A549 細(xì)胞使用Trizol 試劑按照說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。提取的RNA 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄前在PCR 儀中于37 ℃下反應(yīng) 2 min，去除基因組DNA。RNA 反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件如下：85 ℃ 15 min，42 ℃ 5 min。取5 μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用 StepOne PlusTM進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。對(duì)于半定量PCR，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)。qPCR 和半定量PCR 檢測(cè)均利用管家基因GAPDH為內(nèi)參基因。引物序列如表1 所示。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，電壓 120 V，電泳15 min，在凝膠成像儀（UVP EC3 Imaging System）上觀察結(jié)果。

表1 PCR 引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences and length of PCR products

1.7 蛋白免疫印跡（Western blot）

A549 細(xì)胞感染IAV36 h 后，裂解細(xì)胞并獲得總蛋白質(zhì)，采用10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)進(jìn)行電泳，每孔加入等量的蛋白質(zhì)樣品，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶溶液室溫下封閉2 h。加入一抗β-actin（1︰4 000倍稀釋）和IAV-M1（1︰1 000 倍稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜。辣根酶標(biāo)志山羊抗小鼠IgG（H+L）和辣根酶標(biāo)志山羊抗兔IgG 1︰2 000 稀釋后，在室溫下孵育2 h后，用ECL顯影液在凝膠成像系統(tǒng)顯影，并利用ImageJ 軟件對(duì)電泳圖進(jìn)行灰度值解析。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad 軟件進(jìn)行分析，通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IAV 感染后宿主的hsa_circ_004389 表達(dá)顯著上調(diào)

前期circRNA 組學(xué)數(shù)據(jù)提示宿主hsa_circ_004389的表達(dá)與IAV 感染相關(guān)。采用qPCR方法檢測(cè)IAV 感染A549 細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后hsa_circ_004389的表達(dá)，結(jié)果（圖1A）顯示，hsa_circ_004389的表達(dá)隨感染進(jìn)程逐漸增加，并且在感染后24 h 表達(dá)量最高。同時(shí)，Ifnb1與IAVM基因的表達(dá)變化趨勢(shì)和hsa_circ_004389 基本一致，不僅說(shuō)明IAV 感染細(xì)胞模型的成功，而且提示hsa_circ_004389的表達(dá)上調(diào)可能與病毒復(fù)制及宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答存在潛在聯(lián)系。不同MOI的IAV 感染試驗(yàn)表明，hsa_circ_004389的表達(dá)與病毒感染劑量呈顯著正相關(guān)（圖1B）。IAV感染來(lái)源于不同器官（肺、腸、腦和血液）或組織的人源細(xì)胞系，應(yīng)用半定量RT-PCR 檢測(cè)hsa_circ_004389的表達(dá)水平，結(jié)果（圖1C）顯示，hsa_circ_004389 在5 種人源細(xì)胞系中均有表達(dá)，但是只在病毒適應(yīng)并易感的A549 細(xì)胞中，其表達(dá)量高低與IAV 感染呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明，hsa_circ_004389的表達(dá)呈現(xiàn)出細(xì)胞類型的廣泛性，也兼具特異性，且其表達(dá)與IAV的感染復(fù)制密切相關(guān)。

圖1 IAV 感染誘導(dǎo) hsa_circ_004389的表達(dá)情況Fig.1 Expression of hsa_circ_004389 induced by IAV infection

2.2 poly I∶C 有效誘導(dǎo)hsa_circ_004389 表達(dá)

為了研究hsa_circ_004389 表達(dá)的誘因，分別使用poly I∶C 和LPS 處理A549 細(xì)胞。qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，poly I∶C 處理A549 細(xì)胞后，hsa_circ_004389 和Ifnb1的表達(dá)均與poly I∶C劑量成正相關(guān)（圖2A）。與對(duì)照相比，處理后6 h時(shí)hsa_circ_004389 和Ifnb1的表達(dá)已被顯著誘導(dǎo)（圖2B），說(shuō)明poly I∶C 有效激活下游的信號(hào)通路且能夠誘導(dǎo)hsa_circ_004389 表達(dá)。LPS 處理細(xì)胞后，hsa_circ_0043891 表達(dá)未見顯著改變（圖2C），說(shuō)明hsa_circ_004389的表達(dá)上調(diào)與Toll 樣受體4（Toll Like Receptor 4，TLR4）或細(xì)菌感染無(wú)關(guān)。研究結(jié)果提示，hsa_circ_004389的表達(dá)是細(xì)胞特異性應(yīng)答RNA 病毒感染的結(jié)果，并且在IAV 復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的大量病毒RNA 可能是hsa_circ_004389 表達(dá)的主要誘因之一。

圖2 poly I∶C 誘導(dǎo)hsa_circ_004389 表達(dá)情況Fig.2 Expression of hsa_circ_004389 induced by poly I∶C

2.3 JAK-STAT信號(hào)通路參與調(diào)控hsa_circ_004389的表達(dá)

病毒感染宿主后，宿主細(xì)胞通過(guò)體內(nèi)廣泛表達(dá)的模式識(shí)別受體監(jiān)測(cè)病原相關(guān)分子模式的存在，模式識(shí)別受體被激活后觸發(fā)一系列磷酸化或泛素化介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。為了確定JAKSTAT 信號(hào)通路是否參與hsa_circ_004389的表達(dá)調(diào)控，采用干擾素β（Interferon β，IIFNβ）處 理A549細(xì)胞，qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，hsa_circ_004389的表達(dá)和IFNβ的劑量呈現(xiàn)正相關(guān)（圖3A），說(shuō)明hsa_circ_004389 可能是I 型IFN 相關(guān)JAK-STAT 信號(hào)通路調(diào)控表達(dá)的產(chǎn)物。進(jìn)一步應(yīng)用JAK 抑制劑（Ruxolitinib）有效抑制JAK-STAT信號(hào)通路后，IAV 誘導(dǎo)的hsa_circ_004389的表達(dá)也顯著受到抑制（圖3B）。上述結(jié)果表明JAKSTAT 信號(hào)通路參與調(diào)控hsa_circ_004389的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖3 JAK-STAT 信號(hào)通路參與hsa_circ_004389 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控Fig.3 JAK-STAT signaling pathway participating in hsa_circ_004389 expression regulation

2.4 hsa_circ_004389 抑制IAV 復(fù)制

為了探究hsa_circ_004389 對(duì)IAV 復(fù)制的影響，應(yīng)用hsa_circ_004389的真核表達(dá)質(zhì)粒和siRNA 分別進(jìn)行過(guò)表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)，用qPCR 和Western blot 在病毒mRNA 和蛋白水平上檢測(cè)hsa_circ_004389 對(duì)IAV 復(fù)制的影響。結(jié)果（圖4）顯示，hsa_circ_004389的過(guò)表達(dá)明顯抑制IAV M 基因和M1 蛋白的表達(dá)；反之，應(yīng)用siRNA 抑制內(nèi)源性hsa_circ_004389的表達(dá)則有利于病毒復(fù)制 。研究結(jié)果表明，hsa_circ_004389 具有抑制IAV 復(fù)制的功能。

圖4 hsa_circ_004389 抑制IAV 復(fù)制Fig.4 IAV replication inhibited by hsa_circ_004389

3 討論

circRNA 開始被認(rèn)為是錯(cuò)誤剪接或剪接過(guò)程中形成的副產(chǎn)物［22］，隨著先進(jìn)生物技術(shù)的應(yīng)用，我們對(duì)circRNA 也有了比較全面系統(tǒng)的研究。近年來(lái)，circRNA 復(fù)雜的生物結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能被人們熟知［23］。circRNA可以吸附微小RNA，例如，在新生小鼠中circ_000203 表達(dá)上調(diào)，可以在NMVCs 中特異性吸附miR-26b-5p 和miR-140-3p［24］。circRNA 能夠競(jìng)爭(zhēng)性影響RNA 線性剪接。例如，circMBNL1 可降低MBNL1 pre-mRNA的剪接［25］。circRNA 還可以作為蛋白質(zhì)翻譯的模板，也可以通過(guò)結(jié)合蛋白質(zhì)發(fā)揮功能。

近幾年，研究人員對(duì)宿主編碼circRNA 在病毒感染宿主細(xì)胞過(guò)程中的作用也展開了相關(guān)研究，如恒河猴淋巴濾泡病毒、艾滋病毒、馬立克病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒等［26-28］。轉(zhuǎn)移性鼻咽癌組織中的皰疹病毒（Epstein-Barr virus，EBV）編碼的環(huán)狀RNA circRPMS1的表達(dá)顯著增加。敲低circRPMS1的表達(dá)可以誘導(dǎo)EBV 陽(yáng)性鼻咽癌的細(xì)胞凋亡，對(duì)抗細(xì)胞侵襲和抑制細(xì)胞增殖。circRPMS1 功能的發(fā)揮可能是通過(guò)吸附miR-203、miR-31 和miR-451 來(lái)實(shí)現(xiàn)［29］?？ㄥa波肉瘤相關(guān)皰疹病毒（Kaposi’s sarcoma herpesvirus，KSHV）和EBV 編碼的circRNA，在這兩種病毒相關(guān)的腫瘤中均有高表達(dá)，說(shuō)明這些circRNA 促進(jìn)這兩種腫瘤病毒的致病作用，但其功能及作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究［30］。已有的研究表明，circRNA 既可以參與宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)，也可以參與病毒復(fù)制［31-32］。hsa_circ _ 004389是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的circRNA，在甲型流感病毒中的表達(dá)和作用機(jī)制尚不明確。上述差異表達(dá)circRNA 在病毒感染致病或宿主抗病毒應(yīng)答中的功能及其分子機(jī)制的研究尚未廣泛展，亟待探究。

這些組學(xué)數(shù)據(jù)不僅證實(shí)病毒感染能改變宿主circRNA的表達(dá)模式，而且說(shuō)明circRNA 在病毒與宿主的相互作用中扮演重要角色，既有可能是宿主抗病毒染的工具，也有可能成為病毒重塑有利于自身復(fù)制的細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的利器。實(shí)驗(yàn)室基于IAV 感染A549 細(xì)胞的芯片分析篩選到眾多差異表達(dá)的circRNA,hsa_circ_004389 是明顯差異表達(dá)的circRNAs 之一。在本部分研究中，我們擬充分驗(yàn)證表達(dá)hsa_circ_004389 與IAV 感染之間的關(guān)聯(lián)，研究其表達(dá)的誘因，探究其表達(dá)與轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路之間的關(guān)系。hsa_circ_004389與IAV 感染劑量和感染時(shí)間呈正相關(guān)，在5 種細(xì)胞系中檢測(cè)了hsa_circ_004389的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_004389 表達(dá)量增加具有細(xì)胞特異性。用poly I∶C 和LPS 處理A549 細(xì)胞，驗(yàn)證了hsa_circ_004389 表達(dá)量的改變是機(jī)體特異性應(yīng)答IAV感染的反應(yīng)。用JAK 抑制劑Ruxolitinib 和IFNβ處理細(xì)胞，hsa_circ_004389 被進(jìn)一步鑒定為宿主抗IAV 因子，其表達(dá)受JAK/STAT 信號(hào)調(diào)節(jié)。功能學(xué)試驗(yàn)顯示hsa_circ_004389 能夠抑制IAV 復(fù)制和增殖，更好地佐證了其參與宿主天然抗病毒免疫應(yīng)答，但其抗病毒的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在IAV 感染A549 細(xì)胞中circ_004389的表達(dá)顯著上調(diào)。RT-qPCR 檢測(cè)在IAV 誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中circ_004389的表達(dá)顯著增加并且其表達(dá)水平和poly I∶C 呈現(xiàn)顯著劑量依賴性；LPS 處理細(xì)胞后circ_004389的表達(dá)沒(méi)有明顯變化，證明circ_004389 水平的增加與復(fù)制過(guò)程中病毒RNA的積累有關(guān)，是細(xì)胞特異性應(yīng)答IAV 感染的產(chǎn)物。IFNβ 和Ruxolitinib 處理的A549細(xì)胞中，circ_0050463的表達(dá)降低，證明JAK-STAT信號(hào)通路參與其表達(dá)。應(yīng)用siRNA 抑制內(nèi)源性circ_004389的表達(dá)能促進(jìn)IAV的感染；反之，circ_004389的過(guò)表達(dá)明顯抑制IAV M 基因和M1蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果表明，circ_004389 具有抑制IAV 復(fù)制的功能。本研究結(jié)果表明，hsa_circ_004389 是宿主應(yīng)答IAV 感染的產(chǎn)物，為潛在的細(xì)胞Ⅰ型IFN 應(yīng)答IAV的拮抗因子，研究結(jié)果豐富了對(duì)circRNA 功能的理解，為探究IAV 與宿主相互作用提供了新視角。