王片片，康樺華，劉振興，王 芳，劉 春

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站，廣東 廣州 510640；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510225）

【研究意義】免疫系統(tǒng)是機體執(zhí)行免疫應(yīng)答及免疫功能的重要系統(tǒng)。機體受到抗原刺激后，淋巴細胞發(fā)生分化增殖，在B 淋巴細胞的介導(dǎo)下產(chǎn)生免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）。根據(jù)Ig重鏈恒定區(qū)（Constant region，C 區(qū)）肽鏈氨基酸組成的不同，免疫球蛋白被劃分為多種類型，哺乳動物中的Ig 類型主要有IgM、IgD、IgG、IgE和IgA［1］。相比于哺乳動物，魚類Ig 研究起步較晚，目前在硬骨魚類中已發(fā)現(xiàn)的Ig 主要有IgM、IgD、IgZ、IgT、IgM-Z 等［2］。其中，IgD在人類免疫系統(tǒng)中兼具受體和配體的雙重身份，可以在B 細胞發(fā)育早期替代IgM的作用，同時在調(diào)劑免疫應(yīng)答和維持免疫系統(tǒng)的平衡中也發(fā)揮重要作用［3］。目前對魚類IgD的研究較少，探究魚類IgD的功能與作用，對于完善魚類免疫蛋白功能研究具有重要意義。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種嚴重影響水產(chǎn)動物健康生長的病原菌，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成很大威脅，疫苗免疫是動物疫病有效防控的手段之一，也是魚病防治中的首選方式［4-5］。研究嗜水氣單胞菌疫苗免疫魚類后IgD的表達變化，對于進一步認識魚類免疫應(yīng)答機制具有重要意義。

【前人研究進展】Wilson 等［6］在斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）中第一次報道了一種類似于哺乳動物IgD重鏈的嵌合基因，隨后在牙鲆（Paralichthys olivaceus）［7］、鱖（Siniperca chuatsi）［8］、斜 帶石斑魚（Epinephelus coioides）［9］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［10］等魚類中均發(fā)現(xiàn)了IgD的存在。目前IgD 在除鳥類外的其他脊索動物中均有報道，但對于IgD 免疫學(xué)功能方面的研究較少。有研究顯示，IgD 可能在魚類系統(tǒng)免疫監(jiān)視以及免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起重要作用，且其免疫應(yīng)答表現(xiàn)一定的組織特異性［4］。

【本研究切入點】劍尾魚（Xiphophorus helleri）屬鳉形目（Cyprinodontiformes）花鳉科（Cyprinodontidae）劍尾魚屬，是我國首個通過審定的魚類實驗動物，多年來被應(yīng)用于動物疾病檢驗?zāi)Ｐ?、水環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域［11］。作為實驗動物，劍尾魚具備均質(zhì)化和標準化的優(yōu)勢，從而保證實驗的可重復(fù)性、結(jié)果的精確度和可比性。目前在劍尾魚免疫球蛋白研究方面，IgM 和IgZ 均已得到克隆并進行免疫相關(guān)研究，但IgD 還未有相關(guān)研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬對劍尾魚IgD 進行基因克隆，并研究其在劍尾魚中的組織表達分布以及在嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）疫苗免疫后的表達變化，初步探討IgD 在劍尾魚免疫系統(tǒng)中的功能作用，豐富其在實驗動物領(lǐng)域中對免疫球蛋白基因的研究，進一步認識魚類免疫應(yīng)答分子機制，為劍尾魚作為魚類疾病研究的模式動物和疫苗免疫評價模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物 供試魚為5～6 月齡劍尾魚（RR-B 系），體長5～8 cm，體重3.5～4.8 g，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所培育，已通過全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定。本試驗于2015 年在珠江水產(chǎn)研究所開展。試驗開始前，劍尾魚暫養(yǎng)水產(chǎn)動物房，14 d 后免疫，免疫后取11 d 內(nèi)各時期樣品。養(yǎng)殖玻璃缸體積為100 L，水溫28（± 2）℃，每天用經(jīng)24 h 曝氣的自來水換水1/4，實驗魚房間上午8：00 開啟照明，以14 h/10 h 進行晝夜明暗交替。

1.1.2 主要試劑與儀器 DNA 提取試劑盒Tissue DNA Kit Ⅱ、總RNA 提取試劑盒Total RNA Kit Ⅱ和膠回收試劑盒Gel Extraction Kit 為OMEGA 公司（美國）產(chǎn)品，M-MLV Reverse Transcriptase購自Promega 公司（美國），pMD-18T vector、PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Prefect Real Time）和熒光定量試劑盒SYBR?Premix EX TapTM Ⅱ（Tli RNaseH plus）、DNA 消化酶DNase I 均購自TaKaRa 公司（日本），大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品，PCR 引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。嗜水氣單胞菌株（GYK1）由魚病實驗室保存，嗜水氣單胞菌疫苗來自廣州普麟生物制品有限公司。

主要儀器：ABI 7500 實時熒光定量PCR 檢測儀（Applied Biosystems，美國）、GelDoc 凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RAd，美國）、DYY-7C 電泳儀器（北京六一儀器廠）、BPH-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、I-4 離心機（Sigma，德國）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 脾臟總DNA 和RNA的提取 選取6 尾健康劍尾魚腹腔注射嗜水氣單胞菌株（GYK1）60～80 μL（菌懸液濃度104cfu/mL），2 d 后取脾臟提取DNA 和RNA。于冰上剪開腹腔取出脾臟放入EP 管，液氮凍存，按照OMEGA 公司試劑盒說明書提取DNA 與RNA 用于IgD基因DNA及cDNA的克隆。取5 μL 總RNA 樣品用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量和完整性，用核酸蛋白測定儀測定RNA 樣品的濃度和純度。

1.2.2 IgD 基因DNA 及cDNA 克隆 將提取的總RNA 按照逆轉(zhuǎn)錄M-MLV 說明書合成cDNA 第一鏈。參照實驗室已建立的劍尾魚EST 庫的基因序列和已知魚類IgD基因序列，設(shè)計DNA 擴增引物（表1），以劍尾魚DNA 為模板進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)過1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，將目的條帶切下用膠回收試劑盒純化，純化產(chǎn)物連接pMD18-T 載體后轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細胞，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜（12 h），挑取陽性克隆測序。對獲得的片段進行拼接得到基因全長，對拼接的全長DNA 序列分析，預(yù)測其cDNA 序列。根據(jù)預(yù)測序列設(shè)計引物（表1），以cDNA 第一鏈為模板進行PCR 擴增，經(jīng)測序和拼接后獲得其全長cDNA 序列。

表1 供試引物信息及用途Table 1 Information and application of tested primers

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用DNAstar 分析軟件對獲得的片段進行全長拼接。用DNAman 5.1分析劍尾魚IgD基因DNA 序列以及開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），通過與其他種類的核苷酸和氨基酸序列比對，最終確定ORF。應(yīng)用Clustalx 進行多序列比對，根據(jù)氨基酸序列，用MEGA4.0 中的鄰位相聯(lián)法（Neighborjoining，NJ）構(gòu)建進化樹。

1.2.4 IgD 基因組織表達分析 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測IgD基因在不同組織中的相對表達量。根據(jù)已知劍尾魚β-actin序列（登錄號：DQ060278）和獲得的IgD基因cDNA 序列設(shè)計內(nèi)參引物β-actinF、β-actinR 和檢測引物IgD-F、IgD-R（表1）。選取3 尾健康的劍尾魚，分別取其鰓、腦、心臟、肝、脾、頭腎、腸、肌肉和表皮組織，按照1.2.2 中方法提取RNA，用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit 進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA 第一鏈。以合成的cDNA 第一鏈為模板，按照熒光定量試劑盒步驟在ABI 7500實時熒光定量PCR 儀進行熒光定量PCR 檢測。反應(yīng)體系為：SYBR?Premix ExTaq ? Ⅱ（2×）10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，10 μmol/L 上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，加去離子水補足反應(yīng)總體積至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，40 個循環(huán)；60 ℃延伸時采集熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后對擴增產(chǎn)物進行溶解曲線分析，以確保特異性擴增。采用2?ΔΔCt法計算樣品中IgD基因mRNA的相對表達量。

1.2.5 嗜水氣單胞菌疫苗免疫 選取120 尾健康的劍尾魚，分為3 個平行試驗組和1 個對照組，每組30 尾（水溫保持在28 ℃±2 ℃）。試驗組每尾劍尾魚按說明書腹腔注射嗜水氣單胞菌疫苗進行免疫，對照組注射等量0.65%生理鹽水。免疫后分別在6 h、12 h、1 d、2 d、4 d、7 d、11 d，每組各取3 尾魚的脾、頭腎和腸組織，采用qRTPCR 檢測各組織不同時間IgD基因mRNA的相對表達量。

采用SPSS 26 軟件單因素方差分析對IgD相對表達量進行差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 劍尾魚IgD 基因擴增結(jié)果

本研究對劍尾魚IgD基因進行擴增，測序獲得的DNA 片段用DNAstar 進行拼接后獲得長為6 970 bp的序列。通過RT-PCR，得到IgD基因的完整ORF，長為3 897 bp的cDNA 序列，該序列編碼1 298 個氨基酸（圖1），預(yù)測其編碼蛋白質(zhì)分子量為145.5 ku，等電點pI 為7.23。氨基酸序列分析結(jié)果（圖1）顯示，劍尾魚IgD基因結(jié)構(gòu)由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，恒定區(qū)由CH1-CH2-CH3-CH4-CH5-CH6-CH7 和1 個跨膜區(qū)（TM）組成。

圖1 劍尾魚IgD 基因ORF 序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 ORF sequence and deduced amino acid sequence of IgD from Xiphophorus helleri

2.2 劍尾魚與不同魚類IgD 基因的進化關(guān)系

將劍尾魚與其他魚類IgD基因ORF 核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進行一致性比較，結(jié)果（表2）顯示，劍尾魚與鱖、紅笛鯛、牙鲆、斜帶石斑魚、紅旗東方鲀和虹鱒的IgD核苷酸序列和氨基酸序列相似性稍高，核苷酸序列一致性為65～70%，氨基酸序列一致性為43～49%；與大西洋鱈和斑點叉尾鮰的一致性較低，核苷酸序列一致性分別為49%和50%，氨基酸序列一致性為30%和33%。構(gòu)建劍尾魚IgD 氨基酸序列與其他魚類IgD 氨基酸序列系統(tǒng)進化樹（圖2）發(fā)現(xiàn)，劍尾魚與鱖、紅笛鯛、斜帶石斑魚、牙鲆、紅旗東方鲀聚為一支，然后與虹鱒和大西洋鱈魚聚為一大支，與斑點叉尾鮰分屬兩支，其中劍尾魚與鲀形目的紅旗東方鲀親緣關(guān)系最近，其分子分類地位與生物學(xué)分類一致。

圖2 劍尾魚與其他魚類IgD 氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenic tree of IgD amino acid sequence from Xiphophorus helleri and other species of fishes

表2 劍尾魚與其他魚類IgD 基因ORF的一致性比較Table 2 Identity comparison of IgD ORFfrom Xiphophorus helleriand those of other species of fishes

2.3 劍尾魚IgD 基因的組織表達分析

應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)，以β-actin 為內(nèi)參基因，用設(shè)計的熒光定量檢測引物檢測劍尾魚鰓、腦、心臟、肝、脾、頭腎、腸、肌肉和表皮9 個組織中IgD基因的組織表達分布特征。結(jié)果（圖3）表明，IgD 在脾中分布最高，其次是頭腎、腸和肌肉，在肝臟、皮膚、心、鰓和腦中表達較低。

圖3 劍尾魚不同組織中IgD 基因的組織特異性表達Fig.3 Tissue-specific expression of IgD gene in different tissues of Xiphophorus helleri

2.4 嗜水氣單胞菌疫苗免疫后IgD 基因的表達規(guī)律

通過RT-PCR 檢測嗜水氣單胞菌疫苗免疫劍尾魚6 h、12 h、1 d、2 d、4 d、7 d 和11 d 后IgD在其脾臟、頭腎和腸中的表達變化。結(jié)果（圖4）顯示，劍尾魚頭腎、脾臟和腸中的IgDmRNA 表達量在嗜水氣單胞菌疫苗免疫后均發(fā)生明顯變化，其中頭腎中IgD在免疫后6 h 時表達量顯著上調(diào)后開始下調(diào)，并在免疫后2 d 時達到最低值；脾臟中IgD在免疫后12 h 表達量顯著下調(diào)，并一直持續(xù)至第2 天，至免疫后11 d 表達量仍然顯著低于對照；與脾臟IgD不同的是，腸道中IgD在免疫后12 h 顯著上調(diào)，為對照的4 倍，并在第2天達到峰值，為對照的5.2 倍，隨后表達量下調(diào)，至第11 天時逐漸恢復(fù)至正常水平。

圖4 嗜水氣單胞菌疫苗免疫后IgD 在各器官中的表達變化Fig.4 Expression of IgD mRNA in different organs after vaccination with Aeromonas hydrophilavaccine

3 討論

本研究通過基因克隆獲得劍尾魚IgDcDNA，其ORF 序列3 897 bp，編碼1 298 個氨基酸。該序列具有魚類IgD的經(jīng)典結(jié)構(gòu)域，包含可變區(qū)和恒定區(qū)域，恒定區(qū)包含魚類IgD典型的CH1-CH2-CH3-CH4-CH5-CH6-CH7 和1 個跨膜區(qū)，其ORF 與斜帶石斑魚、牙鲆紅笛鯛和鱖的一致性為67%～70%，表明本試驗成功克隆到劍尾魚IgDcDNA 序列。

本研究發(fā)現(xiàn)，劍尾魚IgD基因主要在頭腎、脾臟中高表達。這種現(xiàn)象在牙鲆［7］、鱖魚［8］、斜帶石斑魚［9］、大菱鲆［10］、團頭魴［12］等魚類中也有類似報道。頭腎和脾臟是魚類重要的免疫器官，是免疫應(yīng)答的主要場所。IgD 在劍尾魚頭腎和脾臟中大量分布，表明其作為魚類重要的免疫球蛋白，在魚類的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。魚類IgD表達具有一定的組織特異性，不同魚體之間也有一定差異。牙鲆IgD基因在心臟和肝臟內(nèi)未檢測到表達［7］，鱖IgD基因在心臟、腸、肝臟、鰓和腦中未檢測到表達［8］，大菱鲆IgD基因在鰓、腸道和心臟中有檢測到表達［10］，歐洲海鱸（Dicentrarchus labraxL.）IgD嵌合體在鰓、腸和頭腎中有較高表達［13］。本試驗中，劍尾魚IgD基因在腸、肌肉、肝、心臟、鰓和腦中均檢測到表達，且在腸中的表達量僅低于頭脾臟和頭腎。腸是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，也是重要的免疫組織，IgD在劍尾魚腸道中有較高表達，表明其可能參與腸道相關(guān)免疫反應(yīng)。

由于劍尾魚IgD 在腸中的水平較高，本研究選取頭腎、脾臟和腸3 類組織來研究疫苗免疫后IgD的表達變化情況。目前關(guān)于魚類IgD的研究較少，初步認為IgD 主要作為成熟B 淋巴細胞膜上的一種特異性抗原受體而存在，可能在細胞發(fā)育和信號傳遞過程以及刺激、誘導(dǎo)其他細胞因子分泌發(fā)揮作用［14］。在用滅活柱狀黃桿菌免疫鱖后，其IgD基因在頭腎和脾臟內(nèi)表達量顯著上升［15］，用滅活的無乳鏈球菌免疫吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）后，其腎、脾臟、胸腺中的IgD基因表達量也上調(diào)［16］。外界病原菌刺激印度淡水鯉魚（Catla catla）后，其腎臟和脾臟中IgD表達也明顯上調(diào)，但其原代細胞培養(yǎng)物經(jīng)抑制劑處理后，腎臟和脾臟中IgD表達出現(xiàn)明顯下調(diào)，表明其可能存在信號傳導(dǎo)作用［17］。在對人體和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，IgD受到免疫原刺激后，其細胞表面IgD出現(xiàn)迅速下調(diào)［12］，類似地，在滅活鰻弧菌免疫大菱鲆后，其頭腎中的IgD也出現(xiàn)迅速下調(diào)，之后逐漸恢復(fù)［10］。牙鲆在注射免疫滅活鰻弧菌后，腎和脾臟中IgD的表達量均出現(xiàn)快速顯著下調(diào)，之后逐漸恢復(fù)到對照水平［1］。類似于以上現(xiàn)象，本研究中，劍尾魚頭腎IgD在嗜水氣單胞菌疫苗免疫后6 h 明顯上調(diào)表達，之后出現(xiàn)下調(diào)并在11 d 時基本恢復(fù)對照水平；脾臟中IgD在免疫后出現(xiàn)明顯下調(diào)，且一直持續(xù)到免疫后第2天。表明劍尾魚IgD參與了免疫應(yīng)答反應(yīng)，并具有免疫組織特異性，IgD 可能在劍尾魚的免疫應(yīng)答中存在某些調(diào)控和補償作用。

反之，劍尾魚腸中IgD在嗜水氣單胞菌疫苗免疫后出現(xiàn)顯著上調(diào)。與在頭腎和脾臟中相比，腸中IgD相對變化最為明顯，第2 天時表達為對照的5.2 倍，且后期表達量一直處于較高水平。魚類腸道除具有消化功能外，也是魚類粘膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其構(gòu)成的局部免疫應(yīng)答環(huán)境可以保護魚類免受病原體感染［19］。腸中的免疫球蛋白，在通過其上皮抵抗?jié)撛诓≡w入侵方面起著重要作用［5,20］。在前人研究中發(fā)現(xiàn)，腸道表面的微生物群大部分被IgT 包裹，但IgM 和IgD 也與部分相似比例的腸道共生細菌進行了結(jié)合［21］。有研究表明，魚類IgD 可以覆蓋粘膜組織中的一部分共生微生物群，包括腸粘膜、鰓粘膜等，表明魚類IgD 可能也參與粘膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)［22-24］。本研究中，IgD 在劍尾魚腸中有較高分布，以及嗜水氣單胞菌疫苗免疫后腸中IgD明顯上調(diào)表達并一直處于較高表達水平，表明IgD可能在劍尾魚腸道粘膜免疫中發(fā)揮一定作用，具體作用及機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究成功克隆獲得劍尾魚IgD基因序列，其cDNA 序列開放讀碼框長為3 897 bp，編碼1 298 個氨基酸，且具有魚類IgD的經(jīng)典結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化分析顯示，劍尾魚IgD基因與鱖IgD基因序列一致性最高，為70%。IgD在劍尾魚的組織器官中均有分布，主要分布于劍尾魚的脾、頭腎和腸中，經(jīng)嗜水氣單胞菌疫苗免疫后，劍尾魚頭腎、脾臟和腸中IgD基因的表達量發(fā)生明顯表達變化，在頭腎和脾臟中先下調(diào)后上升，表明IgD 可能參與了劍尾魚的免疫應(yīng)答，并具有一定的免疫組織特異性。腸道中IgD 高水平分布及在疫苗免疫后顯著上調(diào)表達，表明其可能參與了對抗外來病原入侵的粘膜免疫。本研究結(jié)果為進一步研究魚類IgD的功能及作用機制奠定基礎(chǔ)。