關(guān)天博，崔曉東，陳愷宏，劉瓊光

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

【研究意義】劍麻（Agave sisalanaPerr.ex Engelm.）也稱為菠蘿麻、龍舌蘭麻，屬于龍舌蘭科龍舌蘭屬的多年生硬質(zhì)纖維作物，主要分布在熱帶地區(qū)［1］，我國主要在廣東、廣西和海南等地種植［2］。劍麻纖維及其劍麻汁液提取物被廣泛應(yīng)用于國防、石油、交通運輸、冶金、工礦、捕撈和農(nóng)林牧業(yè)、食品、制藥等領(lǐng)域，具有較大的綜合利用價值和較廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景［3-7］。在我國廣東、廣西兩大優(yōu)勢劍麻種植區(qū)，其產(chǎn)量和種植面積均占全國95%以上。近年來，在廣東湛江地區(qū)劍麻上嚴(yán)重發(fā)生一種葉斑病，其癥狀為：在劍麻葉片產(chǎn)生近圓形、橢圓形黑色病斑，病部凹陷，病健交界明顯，后期病斑可變?yōu)榛野咨瑢?dǎo)致劍麻葉片大面積壞死，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。明確該葉斑病的病原菌種類以及測定該病原菌對化學(xué)藥劑的敏感性，對該劍麻葉斑病的有效防治具有實際意義。【前人研究進(jìn)展】目前，我國劍麻主栽品種為H.11648，該品種特點是產(chǎn)量較高，但易感病［2］。由于劍麻生產(chǎn)種植規(guī)模較為集中，長期栽種品種較為單一，導(dǎo)致病蟲害問題比較突出。劍麻主要病害有斑馬紋?。≒hytophthora nicotianae）、莖腐病（Aspergillus niger）、紫色尖端卷葉病、葉斑?。―othiorella sisalanae.）、褐斑?。―iplodia natalensis）、炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）和潰瘍?。∟eoscytalidium dimidiatum）等［2,8-11］。其中，劍麻斑馬紋病在劍麻生產(chǎn)中是為害最為嚴(yán)重、發(fā)生規(guī)模最大的病害，其病原菌可侵害劍麻各個部位，嚴(yán)重者可導(dǎo)致劍麻植株死亡［8］。莖腐病是劍麻另一種常發(fā)病害，病原菌主要通過傷口侵入，使侵染部位腐爛發(fā)臭［9］。劍麻紫色尖端卷葉病最初于2001 年在海南省發(fā)現(xiàn)，近年來在各劍麻產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生。該病的發(fā)生可能與一種蠟蚧有關(guān)，導(dǎo)致劍麻植株頂部尖端葉片邊緣變紫，并向內(nèi)卷曲，同時產(chǎn)生大量褪綠黃斑，嚴(yán)重時可導(dǎo)致植株根部枯死甚至植株死亡。除上述3 種病害外，近年來劍麻葉斑病、炭疽病也逐漸上升為主要發(fā)生病害，它們嚴(yán)重為害植株葉片，導(dǎo)致劍麻葉片失去利用價值［2,9］?！颈狙芯壳腥朦c】2019 年，在廣東省湛江市的劍麻種植基地中，發(fā)生一種劍麻葉斑病，該病害在劍麻種植區(qū)時有發(fā)生，對當(dāng)?shù)貏β楫a(chǎn)業(yè)構(gòu)成威脅，然而，迄今引起該劍麻葉斑病的病原尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對劍麻葉斑病病原進(jìn)行分離鑒定及其室內(nèi)藥劑篩選，以期為該病的防治提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 病害標(biāo)本采集

2019 年6－12 月，在湛江地區(qū)劍麻種植產(chǎn)區(qū)采集葉片近圓形、橢圓形或不規(guī)則形黑色斑點、病部內(nèi)陷、邊緣無暈圈等明顯癥狀的劍麻病葉，裝入密封袋，對樣品進(jìn)行拍照記錄，帶回華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室，進(jìn)行病原菌的分離和純化。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)及純化

采用組織分離培養(yǎng)法，所用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA（Potato Dextrose Agar）對劍麻葉斑病菌進(jìn)行分離，步驟為：選取帶有明顯癥狀的劍麻葉片組織，用滅菌水沖洗，在病健交界處用無菌小刀切取大小4～5 mm的組織塊，用75%酒精表面消毒1 min，轉(zhuǎn)置于0.1%次氯酸鈉溶液中消毒3 min，無菌水清洗3～4 次，轉(zhuǎn)移到滅菌濾紙上。將消毒后的病組織均勻擺放到PDA平板上，每皿4～5 塊，放好后輕微按壓，防止病組織掉落，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。待病組織邊緣長出菌絲后，用滅菌牙簽在菌落邊緣挑取一小塊培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到新的PDA 培養(yǎng)基上，多次重復(fù)純化，最終獲得純培養(yǎng)菌。

1.3 病原菌的致病性測定

將分離、純化得到的分離物在PDA 平板上30 ℃培養(yǎng)2～3 d，接種針劃取大小一致的小菌塊，備用。將種植于溫室盆栽中的健康劍麻葉片用70%酒精表面消毒，滅菌水沖洗1～2 次，用消毒針在葉片上輕微刺傷，用打孔器取培養(yǎng)2～3 d的分離物菌絲塊（帶有PDA 培養(yǎng)基）貼于葉片傷口處，每片葉接種2 處，以無菌PDA 培養(yǎng)基作為對照。所有接種處均用雙層紙巾輕微包裹，防止菌餅滑落，對接種好的劍麻葉片表面噴滅菌水保濕24 h，每個分離物接種3 片葉，將所有劍麻植株置于溫室中培養(yǎng)。約1 周后待劍麻葉片表面出現(xiàn)發(fā)病癥狀，觀察并記錄發(fā)病情況，并與所采集到的田間病害癥狀比較。若有發(fā)病，則從發(fā)病處取病健交界組織，對病原菌再次進(jìn)行分離純化，觀察是否獲得與分離相同的致病菌。

1.4 科赫氏法則驗證

從接種劍麻發(fā)病癥狀與田間癥狀相似的部位，重新分離病原菌，參照1.2 方法，通過菌落形態(tài)、菌絲和分生孢子等形態(tài)特征進(jìn)行顯微觀察，確定是否與接種的病原菌一致。

1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

選取科赫氏法則驗證后確定為致病菌的菌株，進(jìn)行ITS 序列分析。采用DNA 提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕，按說明書提取病原菌DNA，進(jìn)行PCR 擴增。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物，ITS1（5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG -3’）和ITS4（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’）［12］。引物合成及PCR 產(chǎn)物序列測定由英駿生物技術(shù)有限公司完成。

PCR擴增體系：10×PCR緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，20 μmol/L 引物各0.5 μL，5 U/μL Taq 酶0.5 μL，模板DNA 1 μL，加滅菌雙蒸水至25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)熱3 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，共35 個循環(huán)；72℃延伸5 min。

將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，選取擴增條帶清晰且長度約為540 bp的目標(biāo)條帶，切膠回收，送英駿生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果，在GenBank 數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行BLAST 比對分析。

1.6 病原菌藥劑毒力測定

采用菌絲生長速率法進(jìn)行殺菌劑室內(nèi)毒力測定。供試殺菌劑為98.5%百菌清原粉、97%甲基硫菌靈原粉、97% 咪鮮胺原粉、95% 己唑醇原粉、97%戊唑醇原粉、96.5%苯醚甲環(huán)唑原粉、90.65% 氟吡菌酰胺原粉、93% 醚菌酯原粉，以上藥劑由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物細(xì)菌和殺菌劑研究室提供。稱取原藥各0.1 g，用10 mL 無水乙醇溶解，配置成母液。在預(yù)實驗及查閱相關(guān)資料［13-16］的基礎(chǔ)上，將8 種藥劑原藥各設(shè)置成5 個對應(yīng)濃度梯度，每個濃度梯度3 個重復(fù)。按照各待測藥劑的不同濃度，分別加入PDA 培養(yǎng)基中，配置好不同藥劑的含毒介質(zhì)PDA平板。各濃度藥劑取1 mL 分別加入49 mL 融化并稍冷卻的PDA 培養(yǎng)基中，充分混勻，以等量無水乙醇的PDA 為對照。待培養(yǎng)基冷卻晾干后，用直徑5 mm的打孔器在培養(yǎng)3 d的待測菌PDA 平板上，獲得均勻一致的菌餅，將菌餅轉(zhuǎn)接到含有不同藥劑的PDA 培養(yǎng)基中央，以接種無水乙醇的PDA 平板為對照。30℃恒溫培養(yǎng)箱3～5 d，待對照平板菌落直徑約85 mm 時，用十字交叉法測量各菌落直徑，計算該濃度藥劑對病菌的抑制率：

抑制率（%）=〔1-（處理菌落直徑-菌餅直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）〕×100

依次求得毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50值［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定

2.1.1 癥狀觀察 觀察田間發(fā)病劍麻植株，發(fā)現(xiàn)病斑主要集中在劍麻葉片前半段，且發(fā)病處病斑較為密集（圖1A）。葉片上病斑近圓形、橢圓形或者不規(guī)則，黑色凹陷，病健交界明顯，外圍無黃暈，后期葉肉組織發(fā)白壞死，部分病斑聯(lián)結(jié)成較大的條狀病斑，葉片邊緣發(fā)病，呈不規(guī)則形大斑，向葉片中部內(nèi)陷，后期變?yōu)榛野咨▓D1B、C），初步判斷該病害為真菌性病害。

圖1 劍麻葉斑病的發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of sisal leaf spot disease

2.1.2 病原菌的分離及純化 選取典型癥狀劍麻病組織，用PDA 培養(yǎng)基分離，經(jīng)多次純化共獲得11 個真菌分離物，進(jìn)一步用科赫氏法則對這11個疑似病原真菌進(jìn)行驗證。

2.1.3 病原菌的致病性測定 將分離獲得的11 個真菌分離物在室內(nèi)進(jìn)行致病性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2 種真菌出現(xiàn)與田間癥狀相似的癥狀（圖2），其余9 個分離物接種均不發(fā)病。接種編號為JMLT06的真菌，其劍麻葉片出現(xiàn)明顯的真菌性葉斑病癥狀，病斑黑色，病部內(nèi)陷，病健交界明顯，組織壞死（圖2A）。接種JMLT08的劍麻葉片出現(xiàn)與JMLT06相同的癥狀，但病部中央顏色變?yōu)榛野咨~片組織壞死更為嚴(yán)重（圖2B）。接種對照劍麻葉片，未見任何發(fā)病癥狀，只有戳刺后留下的針孔（圖2C）。接種JMLT06 和JMLT08 兩個菌株后劍麻的發(fā)病癥狀與田間癥狀（圖2D）相似，表明JMLT06 和JMLT08 兩個真菌為致病菌。

圖2 分離的劍麻葉斑病菌接種劍麻葉片癥狀Fig.2 Symptoms of sisal leaves inoculated with isolates of sisal leaf spot disease

2.1.4 科赫氏法則驗證和病原菌的形態(tài)觀察 從接種后發(fā)病的劍麻葉片組織中再次進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得的純培養(yǎng)菌其菌落形態(tài)特征非常相似，生長迅速，2～3 d 即可鋪滿整個培養(yǎng)皿（D=85 mm）。在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形，放射狀，邊緣不整齊；菌絲生長初期為白色，產(chǎn)生豐富的氣生菌絲，似絨毛狀，隨著生長時間延長，菌絲轉(zhuǎn)變?yōu)榛液谏?，在顯微鏡下觀察出現(xiàn)分隔、分支的情況，菌落背面為藍(lán)灰色或近黑色（圖3）。

圖3 劍麻葉斑病菌在PDA 平板上的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology on PDA plate of pathogen causing sisal leaf spot disease

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其分生孢子橢圓形，單孢，深褐色，中間有一條中橫隔隔開，形似雙胞結(jié)合在一起（圖4）。根據(jù)分生孢子的形態(tài)特征，初步鑒定為毛色二孢屬（Lasiodiplodia）。

圖4 葉斑病菌JMLT08的分生孢子形態(tài)Fig.4 Conidial morphology of JMLT08 leaf spot disease

2.1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 利用ITS 通用引 物ITS1（5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG -3’）和ITS4（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’）分別對JMLT06 和JMLT08 菌株進(jìn)行PCR 擴增，分別得到547 bp 和544 bp 目的片段，純化目的片段后進(jìn)行測序，將測序結(jié)果進(jìn)行同源性對比，發(fā)現(xiàn)致病菌的序列在GenBank 中與可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）（GenBank:MN831966.1）的同源性達(dá)到99%以上，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JMLT06 和JMLT08 均與Lasiodiplodia theobromae聚為一類（圖5）。結(jié)合其形態(tài)特征，可將JMLT06 和JMLT08 初步鑒定為可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。

圖5 JMLT06 和JMLT08 菌株ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of ITS sequences of JMLT06 and JMLT08 strains

2.2 殺菌劑對病原菌的毒力測定

選擇JMLT08 菌株，對其進(jìn)行室內(nèi)平板藥劑篩選試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在供試的8 種殺菌劑中，EC50值存在明顯差異。EC50值反映殺菌劑對病原菌的抑制作用，EC50值越小，表明藥劑對病菌毒力越強。本研究結(jié)果（表1）表明，98.5%百菌清的殺菌毒力最強，EC50值為0.000132 μg/mL。其次為95%己唑醇、97%咪鮮胺、97%戊唑醇、96.5%苯醚甲環(huán)唑等4 種藥劑，均具有較好的殺菌活性，4 種藥劑的EC50值均低于1 μg/mL，分別為0.0246、0.0603、0.0623、0.10 μg/mL。90.65%氟吡菌酰胺和97%甲基硫菌靈對JMLT08毒力稍低，EC50值分別為1.28、1.83 μg/mL。在這8 種藥劑中，毒力最差的為93%醚菌酯，EC50值為60.00 μg/mL。

表1 8 種藥劑對JMLT080 菌株的毒力測定結(jié)果Table 1 Toxicity test results of 8 fungicides to JMLT08 strain

依據(jù)EC50值小于2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)，表明百菌清、己唑醇、咪鮮胺、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、氟吡菌酰胺和甲基硫菌靈等7 種藥劑對可可毛色二孢菌均具有較好的殺菌效果，其中效果最好的為百菌清。

3 討論

以往研究表明，我國劍麻上共發(fā)生有炭疽病、莖腐病、紫色尖端卷葉病、條紋病、斑馬紋病、黑斑病、褐斑病、葉斑病、梢腐病和根結(jié)線蟲病等10 種劍麻病害［2,8-11］，其中5 種劍麻真菌病害，其病原菌分別為黑曲霉（Aspergillus niger）引起的劍麻莖腐病、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的劍麻炭疽病、蒂腐色二孢（Diplodia natalensis）引起的劍麻黑斑病、新暗色柱節(jié)孢(Neoscytalidium dimidiatum)引起的劍麻潰瘍病和交鏈格孢(Alternaria alternata)引起的劍麻葉斑病，莖腐病、葉斑病和炭疽病對劍麻的品質(zhì)和產(chǎn)量影響最大［2,9］。本研究鑒定了劍麻上的一種葉斑病病原菌，通過對病原菌的分離、純化和致病性測定，以及對病原菌的形態(tài)觀察和ITS序列分析，將該劍麻葉斑病病原菌初步鑒定為可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae），由可可毛色二孢菌引起的劍麻葉斑病目前在國內(nèi)還未見報道。

可可毛色二孢菌是一種在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛分布的土傳病原真菌，其寄主范圍廣泛，可侵染500 多種植物，引起葉斑、潰瘍、梢枯、枝枯、根腐、果腐、流膠、壞死等癥狀［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，劍麻也是可可毛色二孢菌的寄主之一。據(jù)報道，可可毛色二孢菌在海南為害菠蘿［19］，在廣西可為害芒果［13］，此外，茶樹、桉樹、橡膠樹、朱槿等作物上也發(fā)現(xiàn)該真菌侵染［15,16,20,21］?？煽擅呔秩静铇浜?，可在葉片上產(chǎn)生褐色或黑色點狀病斑，隨后逐漸擴大為不規(guī)則病斑，最后導(dǎo)致葉片壞死［20］；侵染橡膠樹可引起葉斑病，且橡膠樹葉片邊緣向上卷曲［16］；而侵染桉樹和朱瑾則分別產(chǎn)生枝枯和莖腐癥狀，嚴(yán)重可致植株死亡［15,21］。據(jù)報道，可可毛色二孢菌還可引起春芋葉斑病［22］、獼猴桃葉斑?。?3］和樟樹潰瘍?。?4］等，由此可見，可可毛色二孢菌的寄主范圍非常廣，且癥狀類型不一，但本研究中侵染劍麻的可可毛色二孢菌是否侵染其他植物，有待于進(jìn)一步研究。

為有效防治可可毛色二孢菌引起的劍麻葉斑病，進(jìn)行了室內(nèi)藥劑毒力篩選試驗。結(jié)果表明，百菌清、己唑醇、咪鮮胺、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、氟吡菌酰胺和甲基硫菌靈等7 種藥劑對可可毛色二孢菌均具有顯著的抑菌效果。相關(guān)研究表明，咪鮮胺、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、甲基硫菌靈等藥劑對可可毛色二孢菌引起的桉樹、芒果、大葉傘和橡膠樹病害有較好的防治效果［13,15-16,25］，其中25%咪鮮胺對引起桉樹枝枯病的可可毛色二孢菌的EC50值為0.03 mg/L［15］，戊唑醇懸浮劑對引起芒果流膠病的可可毛色二孢菌的EC50值為0.1662 μg/mL［13］，10% 苯醚甲環(huán)唑水分散性粒劑對引起大葉傘干腐病的可可毛色二孢菌的EC50值為0.10 μg/mL［25］，70% 甲基硫菌靈對引起橡樹葉斑病的可可毛色二孢菌的EC50值為0.2019 μg/mL［16］。本研究結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑?qū)β榭煽擅呔腅C50值與前人研究結(jié)果相符，戊唑醇的EC50值明顯低于前人研究，而咪鮮胺和甲基硫菌靈的EC50值明顯高于前人研究結(jié)果，其原因可能是：（1）侵染劍麻的可可毛色二孢菌與侵染其他植物的可可毛色二孢菌對同一藥劑的敏感性不同；（2）藥劑的劑型和含量不同，本研究所用的藥劑均為原藥粉劑，均比前人所用的藥劑含量高。此外，百菌清、氟吡菌酰胺和己唑醇對可可毛色二孢菌的毒力作用以往未見報道，本研究發(fā)現(xiàn)百菌清對劍麻可可毛色二孢菌的毒力最強，其EC50值為0.000132 μg/mL，進(jìn)一步豐富了前人研究結(jié)果，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)上劍麻可可毛色二孢葉斑病的化學(xué)防治。

4 結(jié)論

廣東湛江地區(qū)發(fā)生的一種劍麻葉斑病，初步鑒定是由可可毛色二孢真菌（Lasiodiplodia theobromae）引起，病菌侵入劍麻葉片，產(chǎn)生大量近圓形、橢圓形黑色病斑，病部凹陷，病健交界明顯，導(dǎo)致劍麻葉片大面積壞死，嚴(yán)重影響產(chǎn)量，生產(chǎn)上需要警惕該葉斑病的防治。該病原菌對百菌清、己唑醇、咪鮮胺、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、氟吡菌酰胺和甲基硫菌靈等藥劑敏感，這些藥劑可用于劍麻可可毛色二孢葉斑病的化學(xué)防治。