曾倩倩，劉 巖，朱 墨，邱宗波

（河南師范大學生命科學學院/河南省農業(yè)微生物生態(tài)與技術國際聯合實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453007）

【研究意義】小麥（Triticum aestivumL.）在世界范圍內廣泛種植，除水稻外，其種植面積和產量最高，屬于我國主要的商品糧和儲藏糧，對推動國家糧食安全、生態(tài)環(huán)境保護和社會經濟發(fā)展有重要作用［1］。伴隨全球氣候變化和水資源缺乏問題突出，干旱已成為目前制約小麥生長和發(fā)育的主要非生物脅迫因素之一。干旱脅迫可使植物葉片干枯萎縮、降低相對含水量、增加活性氧自由基和丙二醛含量等，進而發(fā)生膜脂過氧化，導致植物氧化損傷甚至死亡，嚴重阻礙了小麥的高產穩(wěn)產及品質［2-3］。因此，研究小麥響應干旱脅迫的分子機理對提高小麥耐旱能力具有重要的理論和實踐意義。

【前人研究進展】干旱脅迫會導致植物生理指標產生改變，其基因表達類型及表達水平也會在轉錄水平上發(fā)生變化。近年來，轉錄組測序（RNA-Seq）已成為研究植物在某一特定環(huán)境和時間下基因表達情況的重要手段，利用該技術可以獲得大量逆境脅迫下植物細胞的基因表達模式信息，能夠深入研究植物在分子水平對逆境脅迫的響應［4］。利用RNA-Seq 技術，已在玉米、向日葵和水稻等植物中鑒定了多種響應逆境脅迫（如低溫、干旱和病菌等）的相關基因。李武等［5］利用RNA-Seq 技術，對耐低溫發(fā)芽差異的母本及其自交系后代進行分析，從不同玉米材料中獲得410 個差異表達基因（Differentially Expressed Genes,DEGs），從中進一步篩選出20 個可能與低溫萌發(fā)密切相關的基因，為后續(xù)玉米種質資源的研究奠定基礎。田雪慧等［6］利用RNA-Seq 技術在低溫處理百合中發(fā)現了大量響應冷害的相關基因，為揭示蘭州百合抗凍分子機制奠定基礎。Liang 等［7］使用聚乙二醇6000 對苗期向日葵進行模擬干旱脅迫處理，之后對根系及葉片進行測序，發(fā)現9 個可能的抗旱相關基因，為研究向日葵干旱響應機制提供了新資源。

【本研究切入點】RNA-Seq 技術的迅猛發(fā)展和生物信息學分析方法的快速改進，使得更快速高效地從各種生物中獲取大量基因信息成為可能。此外，小麥基因組圖譜注釋信息的不斷完善，為運用轉錄組分析方法探索小麥抗旱分子機制提供了研究基礎?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用高通量RNA-Seq 技術，對自然干旱處理的小麥幼苗葉片進行測序分析，挖掘小麥干旱脅迫應答的關鍵基因，解析小麥干旱脅迫的分子機制，豐富植物抗旱基因組數據，為后續(xù)研究提供更多的遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種為黃淮麥區(qū)大面積推廣的鄭麥366號，由河南省農業(yè)科學院提供。試驗在河南師范大學生命科學學院的光照培養(yǎng)室進行。2021年9 月，選取形態(tài)飽滿、大小均勻的小麥種子，用0.1%HgCl2消毒2 min 后用去離子水沖洗干凈，播種在鋪有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽。待出芽后，選取長勢一致的小麥幼苗分別移栽至營養(yǎng)土和蛭石混合的塑料花盆中（40 棵/盆，10 盆），培養(yǎng)于人工氣候室中，生長溫度25 ℃/18 ℃（晝/夜），相對濕度75%，光照周期12 h/12 h，光照強度400 μmol/m2·s，澆以自來水。待幼苗長至二葉一心時，5 盆幼苗繼續(xù)澆以自來水（對照），另5 盆幼苗停止?jié)菜ㄗ匀桓珊堤幚恚?。在停止?jié)菜? d（土壤相對含水量為50%），分別取對照和自然干旱處理小麥幼苗的葉片，用液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 丙二醛和相對含水量的測定 參照Niu等［8］的方法測定小麥幼苗葉片的丙二醛（MDA）含量，參照Wasaya 等［9］的方法檢測葉片相對含水量。

1.2.2 RNA 提取、cDNA 文庫構建及測序 對照和干旱處理小麥幼苗葉片總RNA 由北京諾禾致源生物公司采用TRIzol 法提取并完成質量分析和cDNA 文庫構建，利用Illumina HiSeq 2500 平臺進行RNA-Seq 測序。

1.2.3 數據組裝及DEGs篩選 過濾原始序列（raw reads）得到高質量的干凈序列（clean reads）。利用Trinity 軟件組裝clean reads，之后使用TGICL軟件聚類去冗余得到單基因簇（Unigene）。利用FPKM 值代表基因表達量水平。根據|log2(Fold change)|>1 且FDR＜0.05 篩選DEGs，并進行DEGs的GO 功能分類(http://www.geneontology.org/)與KEGG 代謝通路富集(http://www.kegg.jp/kegg/kaas/)分析。

1.2.4 熒光定量PCR 驗證 為驗證RNA-Seq 測序結果的準確性，挑選5 個與干旱脅迫相關的DEGs，運用Primer 5.0 軟件設計引物（表1）。采用植物總RNA 提取試劑盒（RNAprep Pure Plant Kit，天根生化科技有限公司）獲得小麥葉片總RNA，用反轉錄試劑盒（Takara 公司）合成cDNA。實時熒光定量PCR（quantitative real-tirne PCR,qRT-PCR）采用Rotor-Gene 3000 Real-Time PCR System（美國）進行PCR 擴增，每次試驗設3 個生物學重復。反應體系參照SYBR?Premix Ex Taq? II 試劑盒（Takara 公司）說明書進行。以小麥Tubulin（GenBank 登錄號：HQ171897）為內參基因，擴增結果用2-ΔΔCt方法進行計算。

表1 qRT-PCR 引物Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 干旱處理對小麥幼苗葉片丙二醛含量和相對含水量的影響

從圖1 可以看出，干旱處理后的小麥葉片MDA 含量顯著增加，比對照增加20.36%，相對含水量顯著降低，比對照下降11.41%，說明此時小麥的細胞膜已受到嚴重損傷。

圖1 干旱處理對小麥幼苗丙二醛含量和相對含水量的影響Fig.1 Effects of drought stress on MDA content and relative water content in wheat seedlings

2.2 小麥轉錄組測序與數據組裝

為進一步探索小麥幼苗在轉錄組水平上對干旱脅迫的應答，采用Illumina HiSeq 2500 平臺將對照和干旱處理的小麥葉片進行RNA-Seq。數據經質量控制后，對照獲得45 471 018 個clean reads 片段，包含6.82 Gb 堿基信息。干旱處理獲得45 133 470 個clean reads 片段，包含6.39 Gb堿基信息，GC 含量分別為49.58% 和50.82%，Q30（測序錯誤率小于 0.1%）均在90%以上（表2）。說明Illumina 平臺所得到的小麥轉錄組序列數量和質量均較高，為后續(xù)組裝和分析提供了較好的數據。

表2 小麥轉錄組測序數據統(tǒng)計Table 2 Statistics of sequencing analysis of wheat transcriptome

利用Trinity 軟件對測序所得的數據進行拼接組裝，分別得到188 334 個轉錄本和119 588 個Unigene。轉錄本序列總長度為150 788 752 bp，平均長度為801 bp，N50 為1 320 bp。Unigene 總長度為131 025 642 bp，平均長度為1 096 bp，N50 為1 520 bp，最長的Unigene 為17 700 bp，最短的為201 bp（表3）。Unigene的N50 長度比其平均長度增加約40%，而轉錄本的N50 長度比其平均長度增加65%，說明數據組裝質量較好。

表3 轉錄本和單基因簇統(tǒng)計Table 3 Statistics of assembled transcripts and unigenes

2.3 干旱處理對小麥葉片差異表達基因的影響

以FDR＜ 0.05 且|log2Fold change|>1 作為篩選條件，對獲得的對照和干旱脅迫處理小麥葉片的DEGs 分析結果用火山圖展示。結果（圖2）表明，對照與干旱脅迫處理相比，共獲得1 207個DEGs，其中752 個上調、455 個下調，上調基因在數量上高于下調基因。

圖2 對照與干旱處理小麥葉片DEGs的火山圖Fig.2 Volcano plots of DEGs in wheat leaves between control and drought treatment groups

2.4 小麥葉片差異表達基因的GO 與KEGG 富集分析

本研究中1 207 個DEGs 獲得GO 功能分類，DEGs 上、下調統(tǒng)計結果見圖3。由圖3 可知，上調的DEGs 中，主要歸類為代謝過程和甘油代謝過程（生物過程類別）、膜和細胞部分（細胞組分）、水解酶活性和催化活性（分子功能）；下調的DEGs 中，主要歸類為代謝過程和主要代謝過程（生物過程）、細胞器和細胞（細胞組分）、催化活性和氧化還原酶活性（分子功能）。整體上來看，GO 富集分析在絕大部分同一條目下富集的DEGs 中上調基因數量多于下調基因數量，但在細胞器和細胞條目中下調基因數量高于上調基因數量。

圖3 小麥葉片DEGs的GO 功能分類Fig.3 GO classification of DEGs in wheat leaves

經KEGG 富集顯示，兩組樣品的1 207 個DEGs 共富集得到65 條信號通路，其中有9 條信號通路富集顯著（P＜ 0.05），主要包括淀粉和蔗糖代謝（富集的DEGs 數最多）、卟啉和葉綠素代謝、光合作用-天線蛋白、光合作用、苯丙烷生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸代謝、光合生物中的碳固定等（圖4）。

圖4 小麥葉片DEGs的KEGG 富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of DEGs in wheat leaves

2.5 小麥葉片差異表達基因的熒光定量驗證

為了驗證RNA-seq 結果的準確性，選擇5 個抗氧化酶基因進行qRT-PCR 檢測。由圖5 可見，5 個基因的表達變化情況與RNA-Seq 一致，表明測序結果較為準確、可靠。此外，5 個抗氧化酶基因均上調表達，且POD和CAT基因的表達變化水平高于SOD、GST和GSH-Px，說明干旱脅迫可以誘導抗氧化酶基因及相關物質的表達，且POD和CAT基因可能起主導作用，促進小麥對活性氧的清除，降低活性氧對細胞的膜系統(tǒng)傷害。

圖5 干旱處理小麥葉片DEGs的qRT-PCR 表達分析Fig.5 qRT-PCR analysis of DEGs in wheat leaves under drought stress

3 討論

干旱對植物的生長發(fā)育、生理代謝、生殖發(fā)育等多種生物過程均會造成不利影響，是限制糧食作物品質和產量的主要逆境災害之一［10-11］。研究發(fā)現，干旱脅迫后，植物可在生理生化和分子水平方面作出脅迫響應以抵御逆境損傷，降低環(huán)境傷害［12-13］。植物受到干旱刺激后，能夠誘導體內的滲透調節(jié)系統(tǒng)調控逆境脅迫應答，相對含水量在滲透調節(jié)過程中具有重要作用，可以反映植物對干旱的耐受性［14］。Meher 等［14］用不同濃度的PEG6000 處理花生24 h，結果表明，隨著PEG6000 濃度的增加，葉片和根中相對含水量均顯著降低。此外，胡艷等［15］研究發(fā)現，隨著土壤干旱脅迫的逐漸加劇，黑果腺肋花楸葉片相對

含水量逐漸降低。本研究結果與該結果一致，間接反映了植物的氣孔狀況和光合功能受到影響。植物在逆境脅迫下會誘導生成活性氧，這些活性氧與生物大分子（脂質和蛋白質等）發(fā)生反應，最終生成MDA，造成膜傷害，進而影響植物代謝過程［14］。本研究中，小麥在干旱脅迫下葉片的MDA 含量顯著高于對照，說明小麥細胞膜損傷嚴重。

當植物受到脅迫時，基因的表達模式和表達水平會發(fā)生顯著變化，通過挖掘和篩選調控干旱的基因，可以為研究植物適應逆境提供新的思路和方法。RNA-Seq 是近年發(fā)展起來的用來鑒定差異表達基因的技術，是篩選抗逆基因的重要研究手段［16-17］。本研究采用Illumina Hiseq? 2500高通量測序平臺對干旱處理和對照的小麥葉片進行了RNA-Seq，獲得的平均樣本數據量為6.82 Gb，通過Trinity 拼接組裝得到18 334 個轉錄本和119 588 個Unigene，共篩選獲得1 207 個DEGs，其中752 個上調，455 個下調，上調基因在數量上高于下調基因，可見，差異基因主要以上調表達為主。

植物響應干旱脅迫是一個受多個基因控制，涉及多種途徑和多種代謝產物合成的復雜過程［18］。本研究中，GO 富集發(fā)現，小麥中檢測到的1 207 個DEGs 富集到3 個GO 本體的34 個條目下，整體來看，主要富集在水解酶活性、催化活性、代謝過程、甘油代謝過程、膜和細胞部分等，GO 分析在絕大部分同一條目下富集的DEGs 中上調基因數多于下調基因，說明小麥主要通過上調基因表達來響應干旱脅迫，同時也說明干旱環(huán)境對小麥的脅迫作用是多方面、復雜的。KEGG 通路富集發(fā)現，DEGs 顯著富集在淀粉和蔗糖代謝、卟啉和葉綠素代謝、光合作用-天線蛋白、光合作用、苯丙烷生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸代謝、光合生物中的碳固定等通路。在干旱條件下，植物光合作用-天線蛋白、葉綠體組分、氨基酸代謝和碳代謝等通路受到影響，使得光合作用和物質積累受到抑制，這可能是小麥葉片相對含水量降低及MDA 含量增加的主要原因。

研究表明，植物在逆境脅迫下體內會產生對自身有害的活性氧，一些抗氧化酶（如SOD 和CAT 等）及抗氧化劑具有清除活性氧的功能，能夠使其產生與清除達到平衡狀態(tài)，使之抵抗逆境脅迫，維持植物的正常生長［19-20］。RNA-Seq 結果顯示，干旱條件下，富集在POD 和CAT 活性等功能組的多個DEGs 表達上調，可以促進抗氧化酶及相關物質的產生，提高小麥對活性氧的清除能力，從而降低活性氧對細胞的膜系統(tǒng)傷害。作為一種非酶促活性氧清除劑，谷胱甘肽類似于抗氧化酶，可以清除干旱脅迫誘導的自由基和過氧化物［21］。本研究中，編碼GST和GSH-Px的DEGs 在干旱脅迫下表達均上調，進而調控谷胱甘肽的代謝過程，對于清除細胞代謝過程中累積的自由基，減輕細胞所受的干旱脅迫損傷具有重要作用。

4 結論

本研究對正常生長與自然干旱處理下鄭麥366號的葉片進行轉錄組分析，共獲得1 207 個差異表達基因，其中752 個表達上調，455 個表達下調。GO 功能富集分析顯示，DEGs 主要富集在水解酶活性、催化活性、代謝過程、甘油代謝過程、膜和細胞部分、細胞和氧化還原酶活性等。KEGG 途徑富集分析發(fā)現，DEGs 顯著富集于淀粉和蔗糖代謝、卟啉和葉綠素代謝、光合作用-天線蛋白、光合作用、苯丙烷生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸代謝和光合生物中的碳固定等代謝通路。qRT-PCR 分析結果表明，5 個抗氧化酶基因的表達趨勢和RNA-Seq測序結果一致。此外，還候選了POD、POD、CAT及GST基因作為小麥自然干旱脅迫響應相關的應答候選基因。