◎ 朱偉珍，李慶香，巫熙凌

（廣東省汕頭市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測所，廣東 汕頭 515041）

沙門氏菌是最常見的人畜共患食源性致病菌之一，屬腸桿菌科，革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于自然界，易污染水源、各類食品和禽畜產(chǎn)品等，嚴(yán)重危害人類健康，易引起諸如傷寒、急性腸胃炎、敗血病等疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界各國的種類細(xì)菌性食物中毒，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。沙門氏菌的感染問題已經(jīng)成為一個(gè)備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，沙門氏菌的預(yù)防和有效控制也受到越來越多的重視。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）也明確規(guī)定在各類食品中沙門氏菌均不得檢出，沙門氏菌的檢測已作為食品檢測的常規(guī)項(xiàng)目[2-4]。

實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對來確定實(shí)驗(yàn)室檢測能力的活動(dòng)，是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢測水平的一項(xiàng)重要手段。通過能力驗(yàn)證項(xiàng)目的實(shí)施，可以加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室間的技術(shù)交流，提高檢驗(yàn)檢測的質(zhì)量和水平。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室是否具備檢測沙門氏菌的技術(shù)能力，確保檢測活動(dòng)的有效性，本實(shí)驗(yàn)室參加了由大連中食國實(shí)檢測技術(shù)公司組織的《CFAPA-1186 食品中沙門氏菌的測定能力驗(yàn)證計(jì)劃》，按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）的檢測要求對盲樣進(jìn)行檢測，同時(shí)對能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的過程與結(jié)果進(jìn)行分析討論，總結(jié)出沙門氏菌能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和日常檢驗(yàn)的注意事項(xiàng)，以期為相關(guān)檢測提供參考[5]。

1 材料與方法

1.1 樣品

編號分別為沙門定性019、沙門定性390、沙門定性418樣品（以下簡稱019、390、418），采用真空西林瓶密閉包裝，購自大連中食國實(shí)檢測技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株：鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，CMCC（B）50115，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、腦心浸出液肉湯（Brain Heart Infusion Broth，BHI）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（Tetrathionate Brilliant Green Enrichment Medium Base，TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（Selenite Cystine Broth，SC）、亞硫酸鉍瓊脂（Bisulfite Sulfite Agar，BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（Xylose Lysine Deoxycholate Agar，XLD）、HE瓊脂（Hektoen Enteric Agar，HE）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（Chromogenic Salmonella Agar，SA）、三糖鐵瓊脂（Triple Sugar Iron Agar，TSI）、營養(yǎng)瓊脂（Nutrient Agar，NA）、革蘭氏染色液及沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒，以上培養(yǎng)基和試劑均購自廣東陸橋技術(shù)股份有限公司并通過驗(yàn)證合格且在有效期內(nèi)。

1.3 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；生物安全柜（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；電恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 檢測依據(jù)

依據(jù)能力驗(yàn)證組織單位提供的作業(yè)指導(dǎo)書和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016），對編號019、390、418的樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，另外增設(shè)一組以腦心浸出液肉湯（BHI）代替緩沖蛋白胨水（BPW）作為預(yù)增菌液，其余選擇性增菌、分離、生化鑒定試驗(yàn)步驟按國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，同時(shí)設(shè)置陽性對照和空白對照。

1.4.2 樣品處理

收到的樣品為西林瓶包裝，樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，按參試作業(yè)指導(dǎo)書要求對樣品進(jìn)行處理，于生物安全柜內(nèi)，無菌開啟西林瓶，用40 mL稀釋液對樣品進(jìn)行再水化。具體操作為先從40 mL無菌生理鹽水稀釋液中吸取4 mL加入西林瓶對樣品進(jìn)行再水化，待凍干粉充分溶解后，用無菌吸管轉(zhuǎn)移至無菌瓶中，再反復(fù)5次，每次以4 mL稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁，將清洗液全部收集于上述無菌瓶中，再將剩余稀釋液吸出合并到無菌瓶中，此為樣品待測原液，共40 mL。以此方法分別對另外2個(gè)樣品進(jìn)行前處理。

1.4.3 預(yù)增菌

在生物安全柜中吸取25 mL待測樣品原液至225 mL滅菌BPW中，另吸取10 mL加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的90 mL滅菌的BHI中，同時(shí)吸取250 μL、100 μL鼠傷寒沙門氏菌（CMCC（B）50115）菌液分別加入到225 mL已滅菌的BPW和90 mL已滅菌的BHI作為陽性對照，并設(shè)置空白對照。將所有樣品和陽性對照、空白對照一起放進(jìn)（36±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)18～24 h。

1.4.4 選擇性增菌

輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)后的樣品混合液，分別吸取1 mL轉(zhuǎn)接到10 mL的亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）和四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）中，SC混合液于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)18～24 h，TTB混合液于（42±1）℃恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)18～24 h。以此方法，分別對另外2個(gè)樣品及陽性對照和空白對照進(jìn)行預(yù)增菌與增菌。

1.4.5 選擇性分離

用接種環(huán)各取1環(huán)增菌液，劃線接種于BS、XLD、HE瓊脂平板和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板各2個(gè)，BS瓊脂平板置于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24～48 h，HE、XLD瓊脂平板、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板置于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)18～24 h。以此方法，分別對另外2個(gè)樣品及陽性對照和空白對照進(jìn)行劃線分離。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察各個(gè)平板上有無可疑沙門氏菌菌落生長。

1.4.6 生化鑒定試驗(yàn)

自BS、XLD、HE瓊脂平板、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板上挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落于營養(yǎng)瓊脂平板上純化，接種三糖鐵瓊脂，在斜面劃線，于底層穿刺。取營養(yǎng)瓊脂平板上面純化的適量菌落到生理鹽水稀釋液中，制成與沙門氏菌干制生化試劑盒里面提供的比濁管相當(dāng)濁度的菌懸液，接種于沙門氏菌干制生化試劑。三糖鐵瓊脂和沙門氏菌干制生化試劑（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24～48 h。陽性對照在以上4種分離鑒定平板上面挑取典型菌落采用同樣操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)增菌與增菌結(jié)果

由表1知，019、390、418及陽性對照通過增菌培養(yǎng)后，BPW增菌液和BHI增菌液均變?yōu)闇啙?；TTB變渾濁，稍變黃色，SC變渾濁、呈紅色。空白對照的BPW增菌液和BHI增菌液清澈，TTB、SC不變色。

2.2 選擇性分離培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

019、390、418 、陽性對照在BS、XLD、HE瓊脂平板上面均有可疑或典型菌落，019、390在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板上面沒有可疑菌落，418和陽性對照在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板上面為紫紅色典型菌落，詳見表1。

表1 樣品增菌結(jié)果及選擇性分離平板菌落特征表

2.3 生化培養(yǎng)結(jié)果

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）中的表3，019、390 2個(gè)樣品在BS、HE瓊脂平板上面挑取的可疑菌落（分別以019-1、390-1、019-2、390-2標(biāo)記），尿素、賴氨酸脫羧酶2項(xiàng)生化反應(yīng)不符合A1典型反應(yīng)，判定非沙門氏菌；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中表2，在XLD瓊脂平板上面挑取的可疑菌落（分別以019-3、390-3標(biāo)記），三糖鐵、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)結(jié)果與沙門氏菌屬的生化反應(yīng)不同，綜合判定2個(gè)樣品未檢出沙門氏菌。418在XLD瓊脂平板和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板上面挑取的典型菌落（分別以418-1、418-2表示）和陽性對照在XLD、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板上面挑取的典型菌落（分別以陽-1、陽-2表示）的生化反應(yīng)均符合標(biāo)準(zhǔn)中表3中的A1典型反應(yīng)，判定檢出沙門氏菌，詳見表2。

表2 SA、BS、XLD、HE瓊脂平板平板上典型或可疑菌落生化鑒定結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

本次檢驗(yàn)結(jié)果與能力驗(yàn)證組織單位結(jié)果一致，結(jié)果滿意。能力驗(yàn)證是保證實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果質(zhì)量的重要手段，能力驗(yàn)證結(jié)果可以很好地反映檢測實(shí)驗(yàn)室的準(zhǔn)確性和可靠性，各實(shí)驗(yàn)室可以通過參加國家及各省級的能力驗(yàn)證組織單位的實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)行動(dòng)態(tài)和提高實(shí)驗(yàn)室的檢測能力和水平[6-7]。同時(shí)，通過能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的交流和總結(jié)，可以發(fā)現(xiàn)日常檢測工作中容易忽視的問題，并加以改正，從而確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

沙門氏菌的能力驗(yàn)證工作較為復(fù)雜，對檢測人員的操作水平和檢測經(jīng)驗(yàn)要求極高。在檢測過程中，務(wù)必規(guī)范操作，控制好各個(gè)檢測環(huán)節(jié)，提高實(shí)驗(yàn)的成功率。①在收到樣品后，應(yīng)根據(jù)自己的理論知識和工作經(jīng)驗(yàn)，盡快制訂詳細(xì)的檢驗(yàn)方案。②可采用化學(xué)指示測試條對生理鹽水、培養(yǎng)基及其他檢驗(yàn)材料的濕熱滅菌效果進(jìn)行監(jiān)測，防止因?qū)嶒?yàn)樣品被污染而造成無法補(bǔ)救的后果。③在預(yù)增菌、選擇性增菌、分離和生化試驗(yàn)等各個(gè)環(huán)節(jié)，應(yīng)先對樣品進(jìn)行檢測，再處理陽性對照，防止樣品間相互污染，并且防止陽性對照污染到樣品，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。④三糖鐵瓊脂須自制備成高層斜面，不要使用安瓿瓶的三糖鐵，避免生化反應(yīng)產(chǎn)硫化氫嚴(yán)重時(shí)觀察不到底層的反應(yīng)結(jié)果。⑤進(jìn)行生化試驗(yàn)時(shí)，國家標(biāo)準(zhǔn)流程要求從選擇分離平板上挑取2個(gè)以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵、賴氨酸和營養(yǎng)瓊脂，如果三糖鐵和賴氨酸結(jié)果不能排除，那么再做其他生化，實(shí)驗(yàn)時(shí)間是2 d。這里最大的困難是1個(gè)單菌落可能不夠接種3種培養(yǎng)基。而且初篩的作用有限，表中能排除的2項(xiàng)，菌落在平板上都不是最典型的沙門氏菌特征。所以建議第1 d先純化，第2 d用純化后的菌將所有生化用沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒一起做，時(shí)間上與國家標(biāo)準(zhǔn)一樣，都是2 d得到完整的生化結(jié)果。而且菌經(jīng)過純化，排除了選擇分離平板對生化的干擾，又獲得了大量的單菌落，既能滿足生化試驗(yàn)的用菌量，也能為后面可能需要做血清試驗(yàn)做準(zhǔn)備。⑥從選擇性平板挑取可疑菌落進(jìn)行純化時(shí)盡量多挑取幾個(gè)不同形態(tài)的可疑菌落，避免漏檢。

本次能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在預(yù)增菌環(huán)節(jié)，3個(gè)盲樣按參試作業(yè)指導(dǎo)書制備出來的樣品量各有40 mL，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法樣品檢測量只夠各取25 mL各設(shè)一組樣品的預(yù)增菌，本次研究在國家標(biāo)準(zhǔn)法的基礎(chǔ)上，增加一組用BHI作為預(yù)增菌液相當(dāng)于對樣品平行檢測，防止只用BPW增菌達(dá)不到預(yù)期的增菌效果。BHI可用于金黃色葡萄球菌的純培養(yǎng)，也可用于營養(yǎng)苛求菌的培養(yǎng)（陸橋官方網(wǎng)站產(chǎn)品介紹），本實(shí)驗(yàn)室在一次CNAS資質(zhì)認(rèn)定混合菌種盲樣鑒定中用其作為樣品的前增菌液，鑒定出沙門氏菌、單核細(xì)胞李斯特菌和銅綠假單胞菌，是一種可以活化多類標(biāo)準(zhǔn)菌種的增菌液，在本次實(shí)驗(yàn)也再一次驗(yàn)證了其對沙門氏菌預(yù)增菌效果跟BPW相當(dāng)。

沙門氏菌的選擇性分離培養(yǎng)基尤其重要，其選擇性檢出效果均有不同。通常來講，1種培養(yǎng)基不可能適合所有的沙門氏菌，國家標(biāo)準(zhǔn)法也明確對沙門氏菌篩選需要用2種不同分離培養(yǎng)基。在國家標(biāo)準(zhǔn)法提到4種選擇性分離培養(yǎng)基平板中，BS、HE、和XLD瓊脂平板按照GB 4789.4—2016中的表1，沙門氏菌屬在上面的菌落特征典型與非典型加起來最少有3種特征，為防漏檢，當(dāng)分離出來的菌落特征為表征時(shí)，也只能挑取，通過生化試驗(yàn)進(jìn)行區(qū)分，這樣一來工作量也非常大。而沙門氏菌顯色培養(yǎng)基按說明書上面只有紫紅色1種菌落特征，極其直觀。本次能力驗(yàn)證試驗(yàn)采用BS、XLD、HE瓊脂和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基4種培養(yǎng)基對沙門氏菌進(jìn)行分離，由表1和表2可見，2個(gè)未檢出沙門氏菌的樣品019和390，用沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板分離出來均為藍(lán)綠色和無色透明菌落，對照其說明書即明顯為無可疑菌落，也無需再做下一步的生化試驗(yàn)。而用BS和XLD平板分離出來的菌落無法排除可疑菌落，為防漏檢，必須做下一步的生化試驗(yàn)，但生化試驗(yàn)結(jié)果都不是沙門氏菌。再看檢出沙門氏菌的418樣品，采用沙門氏菌顯色培養(yǎng)基平板分離出來的為藍(lán)綠色菌落和紫紅色菌落，按其菌落特征只有一種可疑菌落，而使用BS、XLD和HE平板分離出來的菌落卻有2種可疑菌落。由此可見，沙門氏菌顯色培養(yǎng)基的分離效果最為明顯。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基專門為沙門氏菌設(shè)計(jì)，可以抑制雜菌生長，有研究表明，沙門氏菌顯色培養(yǎng)基的敏感性和特異性明顯高于BS、XLD和HE，在本次能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)同樣得到驗(yàn)證。因此，建議在日常的沙門氏菌檢驗(yàn)中，可以采用沙門氏菌顯色培養(yǎng)基作為首選培養(yǎng)基，更方便高效地把目標(biāo)菌和干擾菌區(qū)分開[8]。

目前，沙門氏菌的檢測方法較多，條件較好的實(shí)驗(yàn)室可以采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PRC）、酶聯(lián)免疫反應(yīng)、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)等方法結(jié)合國家標(biāo)準(zhǔn)法，以提高檢測質(zhì)量和效率，而對于檢測條件有限的基層單位，單純采用傳統(tǒng)國家標(biāo)準(zhǔn)方法，符合食品安全法的強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)，方法成熟可靠，同樣可以完成沙門氏菌的檢測工作。

通過此次能力驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)?zāi)芰Φ玫搅擞行У尿?yàn)證。參加完能力驗(yàn)證之后，實(shí)驗(yàn)室開展了能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，并總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，提高了檢測人員的檢測能力和技術(shù)水平。