曹騰飛 孫中新 張俊

(1.成都市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，四川 成都 610016；2.成都市第三人民醫(yī)院，四川 成都 610012)

心室肥厚性重構(gòu)是心力衰竭病理進(jìn)展中的重要環(huán)節(jié)之一[1-2]，諸多信號通路及分子蛋白參與其中。β腎上腺素能受體通路在心臟生理及病理中均發(fā)揮重要作用[3]，其通過激活第二信使cAMP促進(jìn)PKA活性增加[4]，進(jìn)而磷酸化其下游底物，直接影響心肌舒縮力[5]。磷酸二酯酶(Phosphodiesterases, PDEs)能夠直接降解cAMP而參與心臟功能調(diào)控[6]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PDEs共有11個亞型，其廣泛參與機(jī)體生理功能調(diào)控，其中PED3和PDE4為心臟主要亞型[7]。PDE4活性被抑制與心律失常、心肌肥厚均有相關(guān)性[8]。有文獻(xiàn)報道PDE4b基因敲除可致模型動物出現(xiàn)心律失常、心肌細(xì)胞肥厚及心力衰竭[9]。PDE4b在心衰心肌細(xì)胞中存在低表達(dá)情況[8-9]。然而其在心肌肥厚中的具體調(diào)控機(jī)制仍不完全清楚。基因啟動子區(qū)域組蛋白乙?；绊懭旧|(zhì)構(gòu)象，其是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要方式[10-11]。乙?；揎椨山M蛋白乙?；?Histone acetylase, HATs)和組蛋白去乙?；?Histone deacetylase, HDACs)共同參與，動態(tài)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[12]，HDACs酶影響靶基因啟動子區(qū)域組蛋白乙?；剑M(jìn)而抑制基因轉(zhuǎn)錄。心臟HDAC4、5、9為心臟中最為重要的幾種組HDAC亞型[13]。已有心衰研究提示心臟總體HDACs表達(dá)及活性均有升高[13]，結(jié)合PDE4b在心衰中表達(dá)下調(diào)，因此本研究推測PDE4b的下調(diào)可能由HDACs調(diào)控介導(dǎo)。本研究以組蛋乙?；{(diào)控為切入點(diǎn)，探討其是否通過影響PDE4b，參與心肌重構(gòu)(肥厚)的調(diào)控，為抗心室重構(gòu)提供潛在治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 8周齡清潔級雄性C57小鼠18只，體重25～28 g，購于四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心，SCXK(川)2015-030。本實(shí)驗(yàn)小鼠的處理符合動物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.2 主要試劑 抗HDAC9抗體(ChIP級)，工作濃度1∶2 000；抗PDE4b，工作濃度1∶2 000；抗β-actin抗體，工作濃度1∶2 000；ChIP試劑盒(Abcam 英國)；HDAC酶活性試劑盒(HDAC Activity Fluorometric Assay kit, BioVision)；山羊抗兔及山羊抗小鼠帶HRP標(biāo)記的IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白測定試劑盒(Pierce公司)；總RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；實(shí)時定量PCR試劑盒(天根生化技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組及處理 利用耳標(biāo)形式將其編號，將編號錄入SPSS軟件中，利用軟件將編號隨機(jī)分為TAC組和對照組(SHAM組)，每組9只。TAC組給予主動脈弓縮窄術(shù)(Transverse aortic constriction,TAC術(shù))。予以4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。小鼠取仰臥位。清潔手術(shù)區(qū)域，經(jīng)胸骨正中切口，暴露胸腔，分離主動脈弓，6.0絲線打活結(jié)備用，將外徑0.4 mm的27-G的平頭針與動脈平行放置，穿入活結(jié)內(nèi)，縫合絲線扎緊后移去針頭。關(guān)閉胸腔。術(shù)中有2只小鼠出現(xiàn)死亡。SHAM組給予假手術(shù)，將絲線放置于相同位置，但不做結(jié)扎。術(shù)后4周利用二氧化碳處死小鼠，取心臟組織備用。

1.3.2 檢測小鼠心臟/體重指數(shù) 術(shù)后4周利用METTLER TOLEDO電子秤進(jìn)行體重稱重，單位以克(g)計；利用二氧化碳窒息處死小鼠后，立刻開胸取心臟組織，PBS溶液中充分?jǐn)D壓，將心腔內(nèi)血液排出。剔除心房組織，將心室置于干燥滅菌紗布上，來回滾動至無水印后對心室進(jìn)行稱重，單位以毫克(mg)計。心臟體重指數(shù)即為心室重量/體重(mg/g)。

1.3.3 H&E染色 心臟組織取出后放入4%多聚甲醛中固定過夜，沖水后利用梯度乙醇進(jìn)行脫水，石蠟包埋后進(jìn)行切片，切片厚度5 μm。切片后進(jìn)行H&E染色。染色封片后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行拍照。H&E染色詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法參照馬恒輝等[14]文獻(xiàn)報道。

1.3.4 實(shí)時定量PCR 按照RNA提取試劑盒說明書操作進(jìn)行RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。后進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。BNP的上游引物序列為5′-AC TCTTGGCTAACTG-3′，下游引物序列為5′-CAGTT AGCCAAGAGT-3′，產(chǎn)物長度為116 bp；PDE4b的上游引物序列為5′-TAACCTTCCCTGGGTAGC-3′，下游引物序列為5′-GCTACCCAGGGAAGGTTA-3′，產(chǎn)物長度為152 bp；HDAC4的上游引物序列為5′-T ACCGCCTCTCCAAGACA-3′，下游引物序列為5′-T GTCTTGGAGAGGCGGTA-3′，產(chǎn)物長度為139 bp；HDAC5的上游引物序列為5′-AATCGTCTGGGTA GATTCG-3′,下游引物序列為5′-CGAATCTACCC AGACGATT-3′，產(chǎn)物長度144 bp；HDAC9的上游引物序列為5′-CCGTAGATTGGCCATTGC-3′, 下游引物序列為5′-GCAATGGCCAATCTACGG-3′，產(chǎn)物長度124 bp；選取β-actin作為內(nèi)參基因。所得數(shù)據(jù)用Bio-RadCFX96 熒光定量PCR 儀自帶基于Pfaffl 原理的相對定量數(shù)據(jù)分析軟件分析。

1.3.5 檢測HDAC酶活性 利用BioVision的HDAC酶活性檢測試劑盒對HDACs總體活性進(jìn)行檢測，操作按說明書進(jìn)行。

1.3.6 Western blot檢測PDE4b和HDAC9蛋白 小鼠冰浴下迅速取出胎盤組織，放入PBS中清洗，盡量除去殘留血液，存于液氮中備用。收集胎盤組織后，利用全蛋白提取試劑盒，24 h內(nèi)提取全蛋白，BCA蛋白濃度測定后調(diào)整上樣量為40 μg，點(diǎn)樣在10%的SDS-聚丙酰胺凝膠上進(jìn)行電泳后電轉(zhuǎn)至0.22 μm的PVDF膜上，用封閉液稀釋Ⅰ抗(1∶500)后4℃過夜，洗膜后再孵育Ⅱ抗(1∶2000稀釋)，室溫下孵育2 h后再洗膜后用化學(xué)發(fā)光成像，將條帶輸入Quantity one軟件獲得其吸光度，以目的蛋白/β-actin(吸光度值)來反映蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.7 染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)實(shí)驗(yàn) 按照ChIP試劑盒操作進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀操作。

1.3.8 ChIP-qPCR檢測HDAC9與PDE4b啟動子結(jié)合水平 選取PDE4b 基因外顯子5′端前1000 bp 序列，針對該序列設(shè)計特異性引物。引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，由寶生物公司合成。PDE4b的上游引物序列為5′-ATGGTACGACGCTTCACTT CGCA-3′，下游引物序列為5′-TGCGAAGTGAAGC GTCGTACCTA-3′，產(chǎn)物大小為139 bp。所得數(shù)據(jù)用Bio-RadCFX96 熒光定量PCR 儀自帶基于Pfaffl 原理的相對定量數(shù)據(jù)分析軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠心室/體質(zhì)量比 分別稱取小鼠心室重量及體重后，計算心室/體質(zhì)量比(mg/g)。TAC組術(shù)后4周小鼠心室/體質(zhì)量比(5.50±0.23)明顯高于SHAM組(4.48±0.18)，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 TAC組與SHAM組小鼠心室/體質(zhì)量比(n =5)

2.2 心臟組織結(jié)構(gòu) 利用H&E染色后對比TAC術(shù)及SHAM術(shù)后4周心臟大體形態(tài)。左室后壁、室間隔明顯增厚(圖2A、2B)。200倍視野下，心肌細(xì)胞明顯肥大，見圖2C、2D。

圖2 TAC及SHAM術(shù)后小鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大

2.3 HDACs酶活性檢測 HDACs酶總活性在TAC組(5.03±0.58)中明顯高于SHAM組(3.24±0.32)(P<0.05)，見圖3。

圖3 TAC及SHAM組心臟組織中HDACs總體活性(n=5)

2.4 MYH7、PDE4b、HDAC4、HDAC5及HDAC9 mRNA 表達(dá)水平 q-PCR檢測顯示，與SHAM組比較，TAC組術(shù)后4周心肌肥厚標(biāo)志物MYH7表達(dá)明顯升高(0.91±0.04vs1.44±0.07 )(P<0.05，圖4A)；PDE4b表達(dá)明顯下降(0.75±0.09vs0.27±0.06)(P<0.01，圖4B)；HDAC9明顯升高( 0.85±0.08vs1.35±0.07)(P<0.05，圖4C)；HDAC4(1.29±0.12vs1.29±0.17)及HDAC5(1.92±0.33vs2.02±0.36 ) mRNA水平兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4D、4E。

圖4 TAC組及SHAM組心臟組織中各基因表達(dá)(n=5)

2.5 HDAC9和PDE4b蛋白表達(dá)水平 Western blot檢測顯示，與SHAM組比較，TAC組心臟中HDAC9蛋白顯著升高(0.77±0.10vs1.25±0.05)(P<0.05，圖5A)；PDE4b蛋白明顯降低(0.67±0.11vsTAC 0.34±0.05)(P<0.05)，見圖5B。

圖5 TAC及SHAM組心臟組織中HDAC9及PDE4b蛋白表達(dá)量(n=5)

2.6 HDAC9與PDE4b啟動子結(jié)合水平 與SHAM組比較，HDAC9與PDE4b啟動子結(jié)合區(qū)域水平在TAC組中顯著升高(1.67±0.1vs2.47±0.20，P<0.05)，見圖6。

圖6 HDAC9與PDE4b啟動子結(jié)合水平(n=5)

3 討論

心肌肥厚是心室肌重構(gòu)的重要表現(xiàn)，其涉及眾多信號通路紊亂及分子蛋白表達(dá)異常[15]，為心力衰竭的重要病理過程之一。其顯著特點(diǎn)為心室，尤其是左室后壁及室間隔增厚，心肌細(xì)胞肥大。TAC是構(gòu)建心肌肥厚及心力衰竭模式動物的常用技術(shù)方法，本研究結(jié)果與經(jīng)典TAC小鼠術(shù)后數(shù)據(jù)相似，術(shù)后4周心臟出現(xiàn)明顯肥厚[16]，心室/體質(zhì)量指數(shù)也出現(xiàn)明顯升高，同時心肌肥厚的重要標(biāo)志物MYH7也出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)[17]，提示模型構(gòu)建成功。

PDE在心臟生理及病理中均發(fā)揮重要作用，由于其不同亞型的底物有所不同，因此對PDE的研究應(yīng)盡可能細(xì)化。西地那非，即為PDE5抑制劑，其已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于部分心血管疾病的治療[18]。然而PDE4b作為心臟中PDE的另一個重要亞型，其在病理狀態(tài)下表達(dá)與PDE5有著顯著區(qū)別，有研究發(fā)現(xiàn)PDE4b在心肌肥厚及心衰小鼠心肌細(xì)胞中均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)[19]，最近研究在心力衰竭的人體心臟組織中也發(fā)現(xiàn)了其表達(dá)下降[20]。然而其在心肌肥厚及心衰中低表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。本研究也發(fā)現(xiàn)在肥厚的小鼠心肌組織中，PDE4b表達(dá)明顯下降。接下來，本研究將切入點(diǎn)放在了組蛋白乙?；揎椛厦妗?/p>

作為影響基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)重要表觀遺傳調(diào)控手段，組蛋白乙酰化調(diào)控已經(jīng)為學(xué)者所熟知[21]。同時近些年不斷有研究發(fā)現(xiàn)HDAC酶在心肌肥厚、心力衰竭發(fā)生、發(fā)展中的重要作用[22-23]。因此，本研究首先檢測了HDACs酶在肥厚心肌組織中的總體活性，本研究發(fā)現(xiàn)HDACs酶總體活性明顯升高。利用q-PCR本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在肥厚心肌組織中HDAC9顯著上調(diào)。提示其參與心肌肥厚發(fā)生。本研究繼續(xù)利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，探討HDAC9上調(diào)是否參與PDE4b表達(dá)的下調(diào)。數(shù)據(jù)提示，心肌肥厚中HDAC9可直接結(jié)合于PDE4b啟動子區(qū)域，進(jìn)而下調(diào)其表達(dá)，然而并沒有進(jìn)一步利用熒光素酶報告系統(tǒng)設(shè)計細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討HDAC9與PDE4b啟動子結(jié)合的具體區(qū)域，以及是否具有特異性，此為研究的局限性之一。

本研究解釋了心肌肥厚中PDE4b下調(diào)的可能分子機(jī)制。組蛋白乙?；揎検且粋€可逆的過程，目前HDAC抑制劑也是心血管疾病研究的熱點(diǎn)之一。因此，本研究結(jié)果將為心肌肥厚的干預(yù)提供潛在干預(yù)靶點(diǎn)。然而在這一病理過程中，是否伴隨其他如PDE4a、PDE4d等亞型的變化，以及利用HDAC酶抑制劑是否能實(shí)現(xiàn)以PDE4b為靶點(diǎn)的挽救實(shí)驗(yàn)，仍值得我們后續(xù)關(guān)注。

4 結(jié)論

在心臟后負(fù)荷應(yīng)激增加誘導(dǎo)的心肌肥厚中，組蛋白去乙?；窰DAC9可能通過調(diào)控PDE4b啟動子組蛋白乙酰化水平，可能參與調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而參與心肌肥厚病理進(jìn)展。