王爽爽，史冊，劉蒼維，胡月，周怡君，閆廣興，孫宏晨

（1.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院·附屬口腔醫(yī)院口腔病理科，遼寧省口腔疾病重點實驗室，沈陽 110002；2.吉林大學口腔醫(yī)院病理科，長春 130021；3.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院·附屬口腔醫(yī)院口腔修復科，遼寧省口腔疾病重點實驗室，沈陽 110002；4.吉林大學口腔醫(yī)院修復科，長春 130021）

牙本質是牙齒的主體結構，是由分化成熟的成牙本質細胞分泌的基質礦化形成。在成牙本質細胞分化過程中，細胞的極化是成牙本質細胞成熟并發(fā)揮功能不可缺少的環(huán)節(jié)。因此，研究成牙本質細胞的極化或極性建立的過程及調控機制對進一步理解牙本質的形成過程具有重要意義。細胞極性是指細胞在結構和功能上的不對稱性，包括頂?shù)准毎麡O性（apico-basal cell polarity，ABP）、平面細胞極性、前后細胞極性和不對稱細胞分裂［1］。成牙本質細胞具有典型的ABP特征，但目前對該細胞的頂?shù)讟O性所知甚少。已有對ABP的研究多集中于上皮細胞，由于成牙本質細胞與上皮細胞在形態(tài)、功能、成分及發(fā)育過程中存在很多相似之處［2］，因此，本研究擬基于對上皮細胞極性的了解探討成牙本質細胞的極性特征。

成牙本質細胞的分化過程有多種信號通路參與，其中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP） 信號通路在此過程中必不可少［3］。本研究組已證明在小鼠牙源性間充質中敲除BMP受體活化素A受體1（activin A receptor type 1，Acvr1） 基因后，形成骨樣牙本質［4］，且前期牙本質增厚［5］，但具體的細胞學機制尚不明確。因此，本研究通過在小鼠牙源性間充質細胞中敲除Acvr1基因，用組織學和免疫熒光（immunofluorescence，IF） 染色等方法進一步探索ACVR1在成牙本質細胞極性和牙本質形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：利用基因型為Acvr1 fx/fx和Acvr1 +/-；Osterix-Cre（+）/（-） 的基因修飾小鼠配對合籠［5］，收集子代小鼠。敲除組小鼠基因型為Osterix-Cre（+）/（-）；Acvr1fx/-，對照組小鼠基因型為Osterix-Cre（+）/（-）；Acvr1fx/+。收集出生后21 d（postnatal day 21，PN21） 小鼠下頜骨用于本研究。

1.1.2 儀器及試劑：熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；包埋機、切片機（德國Leica公司）；小鼠抗GM130抗體（美國B&D公司）；小鼠抗頂端極性蛋白激酶C zeta（protein kinases C Zeta，PKCζ） 抗體（美國Santa Cruze公司）；兔抗ZO-1抗體、FITC標記親和純化山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 594標記的山羊抗小鼠IgG（美國Proteintech公司）；DAPI溶液、天狼星紅試劑盒（中國Solarbio公司）。

1.2 方法

1.2.1 標本制備：收集對照組及敲除組PN21小鼠，分離下頜骨，4%多聚甲醛4 ℃固定過夜，次日15%EDTA脫鈣，脫鈣3周后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。3 μm厚度連續(xù)切片，于4 ℃保存。

1.2.2 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE） 染色：烤片，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色5 min，沖洗，分化10 s，返藍10 s，伊紅染色10 min。常規(guī)梯度脫水、透明，中性樹膠封片，觀察拍照，常溫保存。

1.2.3 IF染色：將切片常規(guī)脫蠟至水后，置于PBS緩沖液中，95 ℃檸檬酸水浴修復5 min，冷卻至室溫，PBS沖洗5 min 3次，BSA室溫封閉1 h，加入一抗（ZO-1，1∶100；GM130，1∶200；PKCζ，1∶200），37 ℃孵育2 h，PBS沖洗5 min 3次，熒光二抗（羊抗兔或羊抗鼠） 室溫避光孵育2 h，PBS沖洗5 min 3次，水溶性防淬滅DAPI封片后拍照。

1.2.4 天狼星紅染色：將切片常規(guī)脫蠟至水，鐵蘇木素染色液weigert A和B染液按1∶1混合，用移液槍吸取100 μL（取液量以能完全覆蓋組織面為準） 混合液滴于組織上，濕盒內染色20 min，水洗5 min后，將天狼星紅染色液100 μL滴于組織上，濕盒內37 ℃染色1 h，流水稍微沖洗，去除切片表面染液。常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封固。明場和偏光鏡下拍照，染色后的切片常溫保存。

2 結果

2.1 Acvr1敲除后形成骨樣牙本質，成牙本質細胞形態(tài)異常

PN21小鼠下頜切牙標本HE染色可見，對照組小鼠切牙礦化牙本質和前期牙本質分界清晰平坦，且厚度均勻（圖1B），成牙本質細胞呈高柱狀，細胞排列整齊有序（圖1C），并可見細胞核遠離牙本質側，位于細胞的基底端（圖1C放大圖）。與對照組相比，敲除組小鼠切牙礦化牙本質和前期牙本質分界線曲折不平，厚度不均，前期牙本質層明顯增厚（圖1F），牙尖處有細胞埋在牙本質內形成骨樣牙本質（圖1E箭頭處），成牙本質細胞排列散亂不規(guī)則（圖1F），細胞喪失高柱狀形態(tài)，變?yōu)榘鶢罨蛄⒎綘?，細胞核排列不?guī)律（圖1F放大圖）。說明ACVR1通過影響成牙本質細胞的極性促進了成牙本質細胞的分化，從而影響牙本質的形成。

圖1 PN21小鼠下頜切牙HE染色Fig.1 HE staining of mandibular incisors in mice at PN21

2.2 Acvr1基因敲除后成牙本質細胞內極性相關蛋白定位異常

IF染色結果顯示，對照組小鼠成牙本質細胞內緊密連接蛋白ZO-1（圖2B、2D） 和PKCζ（圖3B、3D）均勻有序表達于細胞頂端，而在敲除組小鼠切牙成牙本質細胞內，上述蛋白表達位置由細胞頂端轉移至細胞基底側，且排列不規(guī)則（圖2F、2H、3F、3H）。同樣，GM130 IF染色可見高爾基體相對細胞核的位置發(fā)生改變，對照組高爾基體位于胞核的頂端側（圖4B、4D），而敲除組小鼠成牙本質細胞內高爾基體與細胞核的位置不固定，大部分高爾基體位于細胞核的牙髓側即細胞底端，有些則位于細胞側面（圖4F、4H）。說明ACVR1參與調節(jié)細胞內緊密連接蛋白、極性蛋白和高爾基體的定位，從而促進成牙本質細胞的極化。

圖2 PN21小鼠下頜切牙ZO-1免疫熒光染色Fig.2 IF staining of ZO-1 in mandibular incisors at PN21

圖3 PN21小鼠下頜切牙PKCζ免疫熒光染色Fig.3 IF staining of PKCζ in mandibular incisors at PN21

圖4 PN21小鼠下頜切牙GM130免疫熒光染色Fig.4 IF staining of GM130 in mandibular incisors at PN21

2.3 Acvr1基因敲除后牙本質膠原纖維無序排列且成熟度降低

對PN21小鼠切牙行HE染色和IF染色，結果表明，Acvr1基因敲除后成牙本質細胞喪失極性形態(tài)，推測成牙本質細胞功能可能受到影響。因此，利用天狼星紅染色檢測牙本質膠原的排列和成熟程度。偏振光顯微鏡下可見對照組切牙牙本質膠原染色呈鮮亮的橙紅色（圖5B），膠原纖維束有序排列（圖5E、5F、5G），而敲除組小鼠牙本質膠原染色呈黃綠色（圖5D），成熟程度較低，且可見膠原纖維排列稀疏不規(guī)則（圖5H、5I、5J）。說明ACVR1促進了牙本質膠原的有序排列和成熟。

圖5 PN21小鼠下頜切牙天狼星紅染色Fig.5 Sirius red staining of mandibular incisors at PN21

3 討論

上皮細胞頂?shù)讟O性具有以下特征：（1） 相鄰兩極性上皮細胞之間形成緊密連接、黏附連接、縫隙連接和橋粒，其中緊密連接分隔細胞頂端面和基底側面；（2） 極性上皮細胞內有3種極性復合體，包括PAR（PAR3/PAR6/aPKC） 復合體、Crumbs（CRB/PALS1/PATJ） 復合體和Scribble（SCRIB/LGL/DLG） 復合體，其中PAR復合體在細胞極化過程中發(fā)揮主要作用［6］；（3） 細胞在建立極性的過程中細胞器發(fā)生重定位。成熟的成牙本質細胞是具有典型頂?shù)讟O性特征的細胞，細胞呈高柱狀緊密平行排列，細胞頂端有成牙本質細胞突突入前期牙本質和牙本質，基底面朝向牙髓側，細胞核整齊排列在細胞基底端。成牙本質細胞的極性建立（也稱極化） 是其正常分化且發(fā)揮功能的關鍵一步。眾所周知，BMP信號通路是成牙本質細胞分化和牙本質形成過程中非常重要的信號通路，本課題組的前期研究［5］表明，Ⅰ型BMP受體Acvr1基因敲除后形成骨樣牙本質，且前期牙本質增厚，為進一步研究ACVR1在成牙本質細胞分化和牙本質形成中的作用，本研究應用Osterix-Cre在小鼠牙源性間充質細胞中敲除Acvr1基因，觀察牙本質的形成及細胞間連接、極性蛋白復合體及高爾基體的定位。

本研究結果顯示，Acvr1基因敲除后的小鼠切牙成牙本質細胞喪失高柱狀形態(tài)，細胞核排列雜亂無章，形態(tài)學上提示了成牙本質細胞的極性紊亂。為了進一步明確極性相關蛋白在成牙本質細胞中的定位，進一步行ZO-1、PKCζ和GM130 IF染色。ZO-1是細胞間緊密連接蛋白。研究［7］表明，3D培養(yǎng)的犬腎細胞整齊排列形成單個管狀結構，而敲除緊密連接蛋白ZO-1基因后，細胞緊密連接組裝和極性建立出現(xiàn)延遲，細胞排列雜亂無章，形成多個管腔或無管腔結構。頂端極性蛋白復合物Par6/Par3/aPKC對促進緊密連接的形成具有關鍵作用，其中aPKC是多種細胞建立極性過程中發(fā)揮磷酸化作用的關鍵酶［8］。PKCζ是aPKC的一個亞型［9］，可磷酸化閉合蛋白，以促進緊密連接組裝［10］。在調節(jié)細胞極性所必需的極性蛋白中，有一半以上被鑒定為aPKC的底物。aPKC的缺失會導致果蠅胚胎上皮細胞喪失頂?shù)讟O性［11］。GM130是高爾基復合體的標志物，極性狀態(tài)下，細胞核位于細胞的基底端，高爾基體分布在細胞核的頂端，高爾基體與細胞核的相對位置決定了具有頂?shù)讟O性的細胞的分泌軸方向［8，12］。越來越多的證據(jù)表明高爾基體與細胞極化有關［12］。在小鼠浦肯野神經元中敲除高爾基體基質蛋白GM130會導致高爾基體斷裂和高爾基體定位缺陷，進而使細胞分泌物極化運輸受損，細胞形態(tài)改變，浦肯野細胞樹突萎縮［13］。因此，ZO-1、PKCζ和高爾基復合體的定位決定了細胞的極化狀態(tài)。本研究中，IF染色結果表明這3種蛋白在敲除組中的定位均出現(xiàn)異常，說明Acvr1基因敲除后，可能通過影響PKCζ的定位，導致緊密連接蛋白的組裝異常，成牙本質細胞不能建立極性，高爾基體定位無規(guī)律，進一步影響成牙本質細胞分泌牙本質基質。

此外，HE染色結果還顯示，Acvr1基因敲除后，礦化牙本質和前期牙本質之間以及前期牙本質和成牙本質細胞層之間的分界線曲折不平，前期牙本質和礦化牙本質厚度不均，還可見骨樣牙本質形成，這可能是由于牙本質膠原分泌和（或） 礦化過程受到影響。成牙本質細胞分泌牙本質基質的方向由高爾基體與細胞核的相對位置決定，GM130定位異常提示成牙本質細胞不能正常建立極性，進一步影響細胞器的定位，使細胞分泌軸的方向改變，導致骨樣牙本質的形成，同時也影響細胞的分泌功能［12］，導致礦化牙本質和前期牙本質之間以及前期牙本質和成牙本質細胞層之間分界不清。為了進一步明確Acvr1基因敲除后成牙本質細胞的分泌功能是否受到影響，行天狼星紅染色，結果發(fā)現(xiàn)Acvr1基因敲除后牙本質膠原排列不整齊，且膠原成熟度降低。提示喪失極性的成牙本質細胞由于細胞分泌軸的改變影響了膠原纖維的定向分泌，進而影響了膠原纖維束的有序排列和成熟。

綜上所述，本研究探討了小鼠牙源性間充質中ACVR1在調節(jié)成牙本質細胞極性和促進牙本質形成中的作用，發(fā)現(xiàn)ACVR1可能通過定位PKCζ促進緊密連接蛋白的組裝，高爾基體重定位，使成牙本質細胞建立極性，進而有序分泌牙本質基質并礦化形成牙本質。但ACVR1影響成牙本質細胞極性的具體機制以及對牙本質基質分泌和（或） 礦化階段的影響仍需進一步探討。