周璐煒 王娟 陳旭

中圖分類號 R73-3;R96 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）05-0548-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.07

摘 要 目的 研究莪術(shù)醇抗T47D乳腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。方法 采用MTT法檢測不同劑量莪術(shù)醇（0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）對T47D乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。以莪術(shù)醇（12.5、25、50、100 μg/mL）干預(yù)T47D乳腺癌細(xì)胞后，采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及活性氧（ROS）水平;采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、細(xì)胞周期調(diào)控因子p21和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）的mRNA表達(dá)水平;采用Western blot法檢測CDK2、CDK6、細(xì)胞周期蛋白D（Cyclin D）、PCNA、核轉(zhuǎn)錄因子E2-相關(guān)因子（Nrf2）、Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Keap1）的蛋白表達(dá)水平。另將細(xì)胞分為2組，其中一組加入不同劑量莪術(shù)醇，另外一組加入33 μg/mL莪術(shù)醇干預(yù)6、12、24、48 h，根據(jù)以上2組結(jié)果確定最佳氧化時(shí)間和給藥濃度后，另設(shè)空白對照組、N-乙酰半胱氨酸（NAC）組（單用ROS抗氧化劑NAC）、莪術(shù)醇組（單用莪術(shù)醇）、莪術(shù)醇聯(lián)合NAC組（采用ROS抗氧化劑NAC預(yù)處理，再加入莪術(shù)醇），檢測細(xì)胞周期及ROS熒光強(qiáng)度。結(jié)果 莪術(shù)醇能使T47D乳腺癌細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P<0.05或P<0.01），并呈一定的劑量和時(shí)間依賴趨勢。莪術(shù)醇能將T47D乳腺癌細(xì)胞周期阻滯于G1期，并使ROS水平顯著增加（P<0.05或P<0.01）;ROS抗氧化劑NAC能夠逆轉(zhuǎn)莪術(shù)醇的上述誘導(dǎo)作用（P<0.01）。qRT-PCR結(jié)果顯示，莪術(shù)醇能下調(diào)PCNA和CDK2 mRNA的表達(dá)，并上調(diào)p21 mRNA的表達(dá)（P<0.05或P<0.01）。Western blot結(jié)果顯示，莪術(shù)醇能顯著下調(diào)Keap1、Nrf2、CDK2、CDK6和Cyclin D的蛋白表達(dá)（P<0.05或P<0.01）;ROS抗氧化劑NAC能夠逆轉(zhuǎn)莪術(shù)醇對上述蛋白表達(dá)的下調(diào)作用（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 莪術(shù)醇可能通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞周期阻滯，發(fā)揮抑制T47D乳腺癌細(xì)胞增殖的作用。

關(guān)鍵詞 莪術(shù)醇;T47D乳腺癌細(xì)胞;細(xì)胞周期阻滯;細(xì)胞增殖;氧化應(yīng)激;作用機(jī)制

Study on the mechanism of curcumol inhibiting the proliferation of breast cancer cells T47D

ZHOU Luwei1，WANG Juan1，2，CHEN Xu1（1. Key Laboratory of Pharmacognosy， College of Pharmacy， Guilin Medical University， Guangxi Guilin 541100， China; 2. School of Basic Medicine， Guilin Medical University， Guangxi Guilin 541100， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the mechanism of curcumol inhibiting the proliferation of breast cancer cells T47D. METHODS MTT assay was used to detect the inhibitory effects of different doses of curcumol（0， 6.25， 12.5， 25， 50， 100? ? ? ? ?μg/mL）on the proliferation of T47D cells. After treated with curcumol （12.5， 25， 50， 100 μg/mL）， the morphology of T47D cells was observed by inverted phase contrast microscope. The cell cycle and the levels of reactive oxygen species （ROS） were detected by flow cytometry. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to detect the expressions of proliferating cell nuclear antigen （PCNA）， cell cycle regular p21 and cyclin-dependent kinase 2 （CDK2） mRNA. Western blot assay was used to detect the protein expression of CDK2， CDK6， Cyclin D， PCNA， nucler transcription factor E2-related factor （Nrf2） and Kelch-like ECH associated protein 1 （Keap1）. Breast cancer cells T47D were divided into 2 groups， one group was given different doses of curcumol， and another group was given curcumol 33 μg/mL for 6， 12， 24， 48 h. After the optimal oxidation time and administration concentration were determined according to the results of the above two groups， the blank control group， N-acetylcysteine （NAC） group （ROS antioxidant NAC alone）， curcumol group （curcumol alone）， curcumol combined with NAC group （pretreatment with ROS antioxidant NAC， and then adding into curcumol）. Cell cycle and fluorescence intensity of ROS were detected. RESULTS Curcumol could significantly increase the inhibitory rate of the proliferation of T47D cells （P<0.05 or P<0.01）， and showed a certain dose and time dependent trend. Curcumol blocked the cycle in the G1 phase and significantly increased the level of ROS （P<0.05 or P<0.01）; ROS antioxidant NAC could significantly reverse above inductive effect of curcumol （P<0.01）. qRT-PCR showed that curcumol down-regulated the expression of PCNA and CDK2 mRNA and up-regulated the expression of p21 mRNA （P<0.05 or P<0.01）. Western blot assay showed that curcumol significantly down-regulated the protein expression of Keap1， Nrf2， CDK2， CDK6 and Cyclin D （P<0.05， P<0.01）; ROS antioxidant NAC could reverse the down-regulation effects of curcumol on the expression of these proteins （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS Curcumol may induce oxidative stress and cell arrest in G1 phase to inhibit the proliferation of T47D cells.

KEYWORDS? ?curcumol; breast cancer cells T47D; cell cycle arrest; cell proliferation; oxidative stress; mechanism

乳腺癌是最常見的惡性婦科腫瘤，且患病呈年輕化趨勢，嚴(yán)重影響女性健康[1-2]。乳腺組織形成惡性細(xì)胞是乳腺癌的特征，遺傳基因突變、藥物使用、飲食習(xí)慣及環(huán)境因素均可誘發(fā)或加劇乳腺癌[1]。乳腺癌分子分型包括luminal A型、luminal B型、Her-2陽性、基底細(xì)胞樣4種亞型，主要采取化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等策略，其中化療和靶向治療是晚期乳腺癌的主要治療方法，但藥物產(chǎn)生的不良反應(yīng)和耐藥性嚴(yán)重影響治療效果和患者的生存質(zhì)量[1]。中藥因其低毒性、多靶點(diǎn)的特性，被廣泛用作抗腫瘤增敏劑及耐藥逆轉(zhuǎn)劑[3-4]。很多從天然植物中分離得到的提取物具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，為臨床防治腫瘤提供了新的選擇，也為天然產(chǎn)物開發(fā)及道地藥材現(xiàn)代化提供了新的思路[5]。

莪術(shù)Curcuma zedoaria Rosc.是常用的中藥，具有行氣解郁、破瘀、止痛的功效，常用于治療血?dú)庑耐?、食積脹痛、瘀血經(jīng)閉[6]。莪術(shù)醇是從莪術(shù)揮發(fā)油中提取的倍半萜類化合物，具有良好的抗腫瘤活性。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究表明，莪術(shù)醇對肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞均有良好的抑制效果[7-10]，但其抗乳腺癌機(jī)制尚未闡明。因此，本研究以人T47D乳腺癌細(xì)胞為研究對象，探討莪術(shù)醇影響T47D乳腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，為莪術(shù)醇的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Infinite M200 PRO型酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司;CKX 31型倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司;ClassⅡ BSC型生物安全柜購自新加坡Esco科技有限公司;AccuriTM C6 Plus型流式細(xì)胞儀購自美國BD公司;CFX Manager 3.0軟件、Power PacTM Basic型蛋白電泳系統(tǒng)、Western blot系統(tǒng)、Chemi DocTM XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司;Biofuge Stratos型低溫高速離心機(jī)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 藥物與試劑

莪術(shù)醇（純度>99%，批號C100409）購自貴州迪大科技有限責(zé)任公司;無水乙醇（貨號64-17-5）購自成都市科隆化工試劑廠;DMEM高糖培養(yǎng)基（批號8115027）購自美國Gibco公司;小牛血清（貨號FB15015）購自美國Clark Cooper公司;青鏈霉素混合液（貨號P1400）、制膠劑（貨號A1010）、胰蛋白酶（批號510T0414）和磷酸鹽緩沖液（PBS，批號20200604）購自北京索萊寶科技有限公司;乙二胺四乙酸二鈉（貨號6381-92-6）、異丙醇（批號1912191）購自汕頭市西隴化工股份有限公司;MTT試劑（貨號298-93-1）購自美國Amresco公司;二甲基亞砜（批號50116）購自天津百倫斯生物技術(shù)有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）引物[包括細(xì)胞周期調(diào)控因子p21（貨號HS150827022）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA，貨號HS150827022）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2，CDK2，貨號HS151104006）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin，貨號HXP08271730609）]購自美國Invitrogen公司;BCA蛋白定量檢測試劑盒（批號080919191105）、抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC，批號111015160224）購自上海碧云天生物科技有限公司;ECL發(fā)光試劑盒（批號1824c03）購自美國Affinity公司;吐溫20（批號 20200820）購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;核轉(zhuǎn)錄因子E2-相關(guān)因子（nucler transcription factor E2-related factor，Nrf2，批號333778）、Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Kelch-like ECH associated protein 1，Keap1，批號333865）購自艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司;細(xì)胞周期抗體CDK6、CDK2、細(xì)胞周期蛋白D（Cyclin D）（批號GR3317473-1）購自英國Abcam公司;β-actin抗體（批號17AVO412）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;PCNA抗體（批號AF0239）購自美國Affinity公司;核糖核酸酶A（RNase A，貨號ZS103-L）購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒（批號9057689）購自美國BD公司;DCFH-DA探針（貨號38483-26-0）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;Trizol試劑（批號W9208）購自北京天根生化科技有限公司;三氯甲烷（貨號67-66-3）購自成都市科隆化學(xué)有限公司;丙烯酰胺（批號691259610）購自合肥白鯊生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（批號EM35110-01）購自北京依瑪博科技有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（貨號A27036）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 細(xì)胞株

本研究所用人T47D乳腺癌細(xì)胞株購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

T47D乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2飽和濕度的DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%小牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 g/L）中。在細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶和0.5 mmol/L乙二胺四乙酸的混合液消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞增殖抑制率的檢測

采用MTT法檢測。T47D乳腺癌細(xì)胞消化傳代后，接種于96孔板中，使每個(gè)孔中細(xì)胞量為5×103個(gè)，每孔體積為100 μL。待細(xì)胞貼壁后加入不同劑量的莪術(shù)醇[終質(zhì)量濃度分別為0（空白對照）、6.25、12.5、25、50、100、150 μg/mL，劑量參照文獻(xiàn)[8]設(shè)定]，每個(gè)劑量設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。于給藥24、48、72 h后加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，間隔4 h后加入150 μL二甲基亞砜，待甲瓚晶體溶解后使用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測吸光度（A）值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1- A給藥組/A空白對照組）×100%。

2.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察

將對數(shù)生長期的T47D乳腺癌細(xì)胞接種于6孔板，加入不同劑量的莪術(shù)醇[終質(zhì)量濃度分別為0（空白對照）、12.5、25、50、100 μg/mL，劑量參照文獻(xiàn)[9]設(shè)定]，每個(gè)劑量設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。給藥48 h后于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.4 細(xì)胞周期的檢測

采用流式細(xì)胞儀檢測。將T47D乳腺癌細(xì)胞接種于70 mm培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/皿，待細(xì)胞貼壁后加入不同劑量的莪術(shù)醇（終質(zhì)量濃度同“2.3”項(xiàng)下）。給藥48 h后用75%冰乙醇固定細(xì)胞，混勻后-20 ℃保存;隔天離心棄上清液，以冰PBS洗滌2次，加入500 μL的RNase A（100 mg/mL），37 ℃水浴30 min;加入25 μL PI避光室溫染色30 min，300目篩網(wǎng)過濾，上機(jī)分析細(xì)胞周期分布。利用Flow Jo軟件分析G1、S、G2期細(xì)胞占比。

2.5 細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的檢測

采用qRT-PCR法檢測。將T47D乳腺癌細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/皿，待細(xì)胞貼壁后加入不同劑量的莪術(shù)醇（終質(zhì)量濃度同“2.3”項(xiàng)下）。給藥48 h后收集細(xì)胞，依次加入Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、乙醇提取總RNA，檢測RNA純度及濃度后，按照試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，PCR引物序列及產(chǎn)物長度見表1。采用Bio-Rad CFX Manager 3.0上機(jī)，以2-ΔΔCt表示細(xì)胞周期相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。

2.6 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測

采用Western blot法檢測。將T47D乳腺癌細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/皿，待細(xì)胞貼壁后加入不同劑量的莪術(shù)醇（終質(zhì)量濃度同“2.3”項(xiàng)下）。收集給藥48 h后的細(xì)胞，加入300 μL RIPA裂解液，4 ℃冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心20 min取上清液。蛋白經(jīng)定量、煮沸處理后，采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，加入對應(yīng)的CDK2、Cyclin D、PCNA、CDK6、β-actin抗體（稀釋度分別為? ? 1 ∶ 2 000、1 ∶ 2 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000、1 ∶ 8 000），4 ℃冰箱過夜;次日用PBST（PBS+吐溫20）洗膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG作為二抗（稀釋度分別為1 ∶ 4 000、1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h;用PBST（PBS+吐溫20）洗膜3次后，加入ECL顯色劑，使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白。利用Image J軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示上述細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

2.7 細(xì)胞中ROS的檢測

當(dāng)T47D乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞生長到融合度為80%～90%時(shí)，重懸并接種細(xì)胞至6孔板中，使每個(gè)孔中細(xì)胞量為4×105個(gè)，待其貼壁后分為2組：其中一組加入不同劑量莪術(shù)醇[終質(zhì)量濃度同“2.3”項(xiàng)下，另依據(jù)MTT結(jié)果添加半數(shù)抑制濃度（IC50）為33 μg/mL的劑量組];另外一組加入33 μg/mL莪術(shù)醇干預(yù)6、12、24、48 h。將兩組細(xì)胞收集至15 mL離心管中，PBS洗滌3次后，用500 μL PBS懸浮細(xì)胞，每個(gè)樣品加入ROS探針DCFH-DA，避光室溫染色30 min;染色完畢，PBS洗滌3次，500 μL PBS重懸細(xì)胞，300目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測ROS水平。根據(jù)結(jié)果確定最佳氧化時(shí)間為24 h、最佳給藥濃度為33 μg/mL。

另取細(xì)胞分為空白對照組、NAC組（單用1 μmol/L的ROS抗氧化劑NAC）、莪術(shù)醇組（單用33 μg/mL的莪術(shù)醇）、莪術(shù)醇聯(lián)合NAC組（采用1 μmol/L的ROS抗氧化劑NAC預(yù)處理細(xì)胞30 min，再加入33 μg/mL的莪術(shù)醇），給藥48 h后于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用流式細(xì)胞儀檢測其ROS表達(dá)水平及周期分布。利用Flow Jo軟件分析G1、S、G2期細(xì)胞占比，DCFH-DA探針檢測ROS的熒光強(qiáng)度（結(jié)果解析：平均熒光強(qiáng)度值越大，細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS越多），同“2.6”項(xiàng)下方法檢測ROS相關(guān)蛋白Nrf2和Keap1（抗體稀釋度分別為1 ∶ 2 000、1 ∶ 4 000）的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測量方差分析。采用Graphpad Prism 8.0作圖工具作圖。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 莪術(shù)醇對T47D乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

莪術(shù)醇能使T47D乳腺癌細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P<0.05或P<0.01），并呈一定的劑量和時(shí)間依賴趨勢，其中150 μg/mL莪術(shù)醇處理72 h后細(xì)胞增殖抑制率在80%左右。結(jié)果見表2。

3.2 莪術(shù)醇對T47D乳腺癌細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置相差顯微鏡下可見，空白對照組T47D乳腺癌細(xì)胞形態(tài)正常;給予12.5、25、50、100 μg/mL莪術(shù)醇干預(yù)48 h后，細(xì)胞逐漸皺縮，類圓球形細(xì)胞增多，正常形態(tài)細(xì)胞減少。結(jié)果見圖1。

3.3 莪術(shù)醇對T47D乳腺癌細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，莪術(shù)醇25～100 μg/mL組干預(yù)T47D乳腺癌細(xì)胞48 h后，G1期細(xì)胞占比顯著升高（P<0.01）;且隨著莪術(shù)醇給藥劑量的增加，G1期細(xì)胞占比呈遞增趨勢，其中莪術(shù)醇100? ?μg/mL組G1期細(xì)胞占比達(dá)（65.53±0.25）%。結(jié)果見圖2。

3.4 莪術(shù)醇對T47D乳腺癌細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，不同劑量莪術(shù)醇干預(yù)T47D乳腺癌細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中PCNA和CDK2的mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），莪術(shù)醇100 μg/mL組p21的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見圖3A。

3.5 莪術(shù)醇對T47D乳腺癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，不同劑量莪術(shù)醇干預(yù)T47D乳腺癌細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中CDK2、PCNA、Cyclin D和CDK6的蛋白表達(dá)水平隨莪術(shù)醇劑量的增加而逐漸降低，部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖3B、C。

3.6 莪術(shù)醇對T47D乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，隨著莪術(shù)醇劑量增加，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加（P<0.01），詳見圖4A;給予33 μg/mL莪術(shù)醇干預(yù)6、12、24、48 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平于24 h達(dá)最高，詳見圖4B。因此選取該干預(yù)時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，給予ROS抗氧化劑NAC預(yù)處理T47D乳腺癌細(xì)胞能夠顯著降低ROS水平，詳見圖4C。

3.7 ROS抗氧化劑NAC對莪術(shù)醇干預(yù)T47D乳腺癌細(xì)胞后細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，給予1 μmol/L的ROS抗氧化劑NAC預(yù)處理能夠顯著逆轉(zhuǎn)莪術(shù)醇對T47D乳腺癌細(xì)胞的周期阻滯作用，使G1期細(xì)胞占比顯著下降（P<0.01）。結(jié)果見圖5。

3.8 ROS抗氧化劑NAC對莪術(shù)醇干預(yù)T47D乳腺癌細(xì)胞后Nrf2和Keap1蛋白表達(dá)的影響

倒置相差顯微鏡結(jié)果顯示，給予1 μmol/L的ROS抗氧化劑NAC預(yù)處理能夠逆轉(zhuǎn)莪術(shù)醇對T47D乳腺癌細(xì)胞的損傷（圖6），并逆轉(zhuǎn)莪術(shù)醇誘導(dǎo)的ROS相關(guān)蛋白Nrf2、Keap1表達(dá)的下調(diào)（圖7）。

4 討論

在細(xì)胞的正常生長過程中，其增殖受細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控。細(xì)胞周期包括4個(gè)連續(xù)的階段：G1期（DNA復(fù)制前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期）[11]。當(dāng)細(xì)胞周期進(jìn)程受阻時(shí)，細(xì)胞的增殖也會被抑制，因此，腫瘤細(xì)胞若發(fā)生周期阻滯可抑制其增殖。有研究顯示，倍半萜類化合物莪術(shù)醇可將腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖[12]。本研究結(jié)果顯示，莪術(shù)醇能夠?qū)47D乳腺癌細(xì)胞阻滯在G1期，且呈一定劑量和時(shí)間依賴趨勢。研究表明，Cyclin與CDK的復(fù)合物對細(xì)胞周期G1期的進(jìn)程起著非常重要的推動(dòng)作用[13]，而p21則是Cyclin-CDK復(fù)合物的抑制劑，能抑制細(xì)胞周期G1期和S期的進(jìn)展[14]。PCNA是評價(jià)細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)，也與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，PCNA的表達(dá)在G1晚期出現(xiàn)，在S期達(dá)到峰值，在G2期下降[15]。本研究結(jié)果顯示，莪術(shù)醇能將T47D乳腺癌細(xì)胞有效阻滯于G1期，上調(diào)細(xì)胞周期進(jìn)程抑制因子p21的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞周期進(jìn)程促進(jìn)因子CDK2、CDK6、Cyclin D和PCNA蛋白的表達(dá)，且呈一定劑量依賴趨勢。以上結(jié)果表明，莪術(shù)醇抑制T47D乳腺癌細(xì)胞增殖與其阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)因子的表達(dá)有關(guān)。

腫瘤細(xì)胞中ROS水平較高，其可通過上調(diào)抗氧化蛋白緩解ROS增多帶來的影響、維持氧化還原平衡，進(jìn)而保持促腫瘤信號傳導(dǎo);而一旦平衡打破致使ROS生成過多，則會促使腫瘤細(xì)胞死亡[16]。這表明ROS是抗腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。研究表明，中藥提取物及有效單體通過調(diào)控ROS的生成，使ROS的生成超過抗氧化系統(tǒng)的還原能力，從而使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期阻滯[17-19]。Nrf2和Keap1作為抗氧化蛋白，是細(xì)胞應(yīng)對氧化應(yīng)激條件不可或缺的介質(zhì)，兩者結(jié)合定位在細(xì)胞質(zhì)中[20-22]，其表達(dá)升高能夠抑制ROS的累積，從而緩解ROS增多對腫瘤細(xì)胞的損傷，因此，抑制二者表達(dá)能使產(chǎn)生的ROS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯及發(fā)生細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，莪術(shù)醇能誘導(dǎo)T47D乳腺癌細(xì)胞中ROS生成增多，而ROS抗氧化劑NAC預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)莪術(shù)醇引起的ROS升高，同時(shí)逆轉(zhuǎn)莪術(shù)醇導(dǎo)致的細(xì)胞G1期阻滯，以及逆轉(zhuǎn)其對ROS相關(guān)蛋白Nrf2和Keap1的抑制，說明莪術(shù)醇誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯與ROS生成增多有關(guān)。筆者推測莪術(shù)醇干預(yù)T47D乳腺癌細(xì)胞后，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)的Keap1蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，使Nrf2與之解離，從而使Nrf2和Keap1表達(dá)減少，而其誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)增多的ROS因此也無法消除，打破了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，進(jìn)而引起T47D乳腺癌細(xì)胞周期阻滯。

綜上所述，莪術(shù)醇可能通過誘導(dǎo)T47D細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平和細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞的增殖。但本研究僅采用單一細(xì)胞系，也未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，莪術(shù)醇抗乳腺癌的具體通路機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] HARBECK N，GNANT M. Breast cancer[J]. Lancet，2017，389（10074）：1134-1150.

[ 2 ] FERLAY J，SOERJOTMATARAM I，ERVIK M，et al. Latest world cancer statistics：global cancer burden rises to 14.1 million new cases in 2012：marked increase in breast cancers must be addressed[EB/OL].（2013-12-12）[2021- 08-11].https：//xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show？paperid=94829eeeb760f2c31779841be6a59650.

[ 3 ] YU J Q，LIU H B，LEI J C，et al. Antitumor activity of chloroform fraction of scutellaria barbata and its active constituents[J]. Phytother Res，2007，21（9）：817-822.

[ 4 ] MCCULLOCH M，SEE C，SHU X J，et al. Astragalus- based Chinese herbs and platinum-based chemotherapy for advanced non-small-cell lung cancer：meta-analysis of randomized trials[J]. J Clin Oncol，2006，24（3）：419-430.

[ 5 ] XIA Q M，MAO W M. Anti-tumor effects of traditional Chinese medicine give a promising perspective[J]. J Cancer Res Ther，2014，10（Suppl 1）：1-2.

[ 6 ] 肖鳴，趙海，晏子友.中藥莪術(shù)及其有效成分的藥理研究概況[J].中醫(yī)藥信息，2004，21（2）：29-30.

[ 7 ] 陳旭，王娟，蔣曉山，等.莪術(shù)醇對肺癌A549細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子、聚ADP核糖聚合酶及Caspase-3表達(dá)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（19）：157-159.

[ 8 ] 王娟，陳旭，曾建紅.莪術(shù)醇對鼻咽癌細(xì)胞CEN-2增殖與凋亡的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（7）：790-792.

[ 9 ] 刁珂，陳旭，王娟，等.莪術(shù)醇對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231侵襲能力的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)，2013，34（12）：1804-1808.

[10] 黃嵐珍，王娟，盧菲婷，等.莪術(shù)醇抑制人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的機(jī)制[J].中國中藥雜志，2013，38（11）：1812-1815.

[11] SCHWARTZ G K，SHAH M A. Targeting the cell cycle：a new approach to cancer therapy[J]. J Clin Oncol，2005，23（36）：9408-9421.

[12] 馬春蘭，張寶亮，張常虹.莪術(shù)醇對乳腺癌細(xì)胞增殖凋亡及JAK2/STAT3信號通路的影響[J].腫瘤學(xué)雜志，2020，26（7）：616-620.

[13] DE GROOT A F，KUIJPERS C J，KROEP J R. CDK4/6 inhibition in early and metastatic breast cancer：a review[J]. Cancer Treat Rev，2017，60：130-138.

[14] HARPER J W，ADAMI G R，WEI N，et al. The p21 Cdk- interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin- dependent kinases[J]. Cell，1993，75（4）：805-816.

[15] 張承玉，富澤龍，鄭學(xué)芝，等.蘆薈大黃素抑制人胃癌細(xì)胞株SGC-7901增殖研究[J].中國藥師，2008，11（12）：1431-1433.

[16] 余祖胤，毛秉智，從玉文.活性氧與細(xì)胞周期調(diào)控[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2007，31（6）：576-578.

[17] KOPUSTINSKIENE D M，JAKSTAS V，SAVICKAS A，et al. Flavonoids as anticancer agents[J]. Nutrients，2020，12（2）：457.

[18] CHAO C C，HOU S M，HUANG C C，et al. Plumbagin? induces apoptosis in human osteosarcoma through ROS generation，endoplasmic reticulum stress and mitochondrial apoptosis pathway[J]. Mol Med Rep，2017，16（4）：5480- 5488.

[19] BISHAYEE K，GHOSH S，MUKHERJEE A，et al. Quercetin induces cytochrome-C release and ROS accumulation to promote apoptosis and arrest the cell cycle in G2/M，in cervical carcinoma：signal cascade and drug-DNA interaction[J]. Cell Prolif，2013，46（2）：153-163.

[20] HAYES J D，DINKOVA-KOSTOVA A T. The Nrf2 regulatory network provides an interface between redox and intermediary metabolism[J]. Trends Biochem Sci，2014，39（4）：199-218.

[21] KORIYAMA Y，CHIBA K，YAMAZAKI M，et al. Long- acting genipin derivative protects retinal ganglion cells from oxidative stress models in vitro and in vivo through the Nrf2/antioxidant response element signaling pathway[J]. J Neurochem，2010，115（1）：79-91.

[22] FOURQUET S，GUEROIS R，BIARD D，et al. Activation of Nrf2 by nitrosative agents and H2O2 involves Keap1 disulfide formation[J]. J Biol Chem，2010，285（11）：8463- 8471.

（收稿日期：2021-09-01 修回日期：2021-12-12）

（編輯：舒安琴）

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