胡 蓉,易徐徐，徐 敏，佟兆國(guó)，徐貴芝，曲繼鵬*

(1.西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院,四川 西昌 615013；2.廳州共建攀西特色作物研究與應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 西昌 615013)

油橄欖(OleaeuropaeaL.)屬于木犀科、木犀欖屬，是著名的木本油料樹(shù)種之一。其果實(shí)主要用來(lái)生產(chǎn)有“液體黃金”之稱的橄欖油，橄欖油具有多種藥用與保健功效，油橄欖會(huì)提供人體所需的纖維素和微量元素。隨著人們對(duì)健康的日益關(guān)注，近幾十年來(lái)，油橄欖產(chǎn)品消費(fèi)呈現(xiàn)節(jié)節(jié)攀升的景象。橄欖油所含的黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗自由基，改善心血管系統(tǒng)與防癌等多種藥理作用。油橄欖主要產(chǎn)地集中在地中海沿岸地區(qū)，如：西班牙、意大利、希臘、土耳其、敘利亞、以色列等國(guó)家。我國(guó)油橄欖產(chǎn)地主要分布在甘肅、云南、四川等省區(qū)。

油橄欖為圓錐花序腋生，花序的長(zhǎng)短因品種不同而異，一般長(zhǎng)20～40mm，每一個(gè)小花序著生15～20朵小花。兩性花，白色，花整齊為合瓣花，花柄頂端膨大，形成花托，萼片4裂，花瓣4～6片。下部膨大為子房，花柱頂端具有兩裂倒心形的柱頭。子房共有4個(gè)胚珠，僅有一個(gè)形成種子。每個(gè)花序開(kāi)花順序是頂生花先開(kāi)，基部花后開(kāi)，花期短，由初花期至末花期僅15～25d，其小花朵的壽命很短，花期僅4～6d。

在中國(guó)大部分油橄欖品種都從國(guó)外引種，普遍出現(xiàn)栽培面積大但產(chǎn)量低的現(xiàn)象。很多品種出現(xiàn)植株能正常生長(zhǎng)卻只開(kāi)花不結(jié)果、結(jié)實(shí)率低、果實(shí)發(fā)育不良導(dǎo)致落果[1]，這些現(xiàn)象嚴(yán)重影響油橄欖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。中國(guó)的油橄欖品種極少，迫切需要通過(guò)雜交育種選育優(yōu)良品種。在雜交過(guò)程中，油橄欖各品種開(kāi)花習(xí)性不同導(dǎo)致花期不遇，花粉貯藏可以在一定時(shí)間內(nèi)保持花粉的生活力，對(duì)解決時(shí)空障礙、親本選配及種質(zhì)資源的保存具有重大意義。

花粉的萌發(fā)率直接關(guān)系到雜交授粉的成功率，這對(duì)于選育優(yōu)良品種，提供抗病、豐產(chǎn)的優(yōu)良繁殖材料，提高豐產(chǎn)潛能，保護(hù)現(xiàn)有的種質(zhì)基因資源，加快良種化進(jìn)程等都有重要意義[2]。本試驗(yàn)選擇中澤油橄欖莊園的2個(gè)油用品種“克羅萊卡”“阿布桑娜”，2個(gè)油果兼用“小蘋(píng)果”“歐卡爾”，1個(gè)果用“科比多”共5個(gè)品種分別測(cè)定花粉量、花粉活力、貯藏時(shí)間與溫度對(duì)花粉生活力的影響。為油橄欖雜交技術(shù)提供理論依據(jù)，從而推動(dòng)油橄欖品種選育加快發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自中澤油橄欖莊園北河基地5個(gè)品種油橄欖品種，在晴天上午8∶00，采集“克羅萊卡”(Koroneiki)、“科比多”(Codovil)、“小蘋(píng)果”(Sevilla)、“阿布桑娜”(Arbosans)、“歐卡爾”(Ocal)剛開(kāi)裂的花蕾，剝?nèi)』ㄋ幏鸥稍锏?0mL青霉素瓶中，等待散粉。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 花粉量的測(cè)定 選擇較飽滿未開(kāi)裂花藥20粒，放置于干燥的15mL青霉素瓶中，自然光照下開(kāi)裂散粉后，加入蒸餾水1mL，加蓋振蕩，使花粉呈懸浮液狀態(tài)，吸取少量懸浮液后滴1滴至XB-K-25血球計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，在10×10倍顯微鏡下共觀察400個(gè)小格，利用公式計(jì)算每一?；ㄋ幹械幕ǚ蹟?shù)，取其平均值[3]。

N=2×(A×1×10000)/20//式中：A為400個(gè)小格中的花粉數(shù)，N為每花藥中的花粉數(shù)

1.2.2 不同培養(yǎng)基選擇 試驗(yàn)采用培養(yǎng)基萌發(fā)試驗(yàn)法測(cè)定花粉萌發(fā)率[3-6]，培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基、蘇瑾等人的培養(yǎng)基(150mg/L蔗糖、200mg/L硼酸和40mg/L鈣配制而成)[1]，清水做對(duì)照。上述培養(yǎng)基加入8%的瓊脂，pH=6.0。用玻璃棒蘸取少量培養(yǎng)基于蓋玻片上，待凝固后，用毛筆蘸取花粉均勻的涂抹在培養(yǎng)基上，用凡士林在載玻片上涂1圈，留一缺口，將2～3滴蒸餾水滴入凡士林圈內(nèi)，將已經(jīng)播種好的蓋玻片(有培養(yǎng)基的一面)輕輕蓋在凡士林圈上，放置在濕潤(rùn)的培養(yǎng)皿上，記錄時(shí)間。在室溫下25(±3)℃，培養(yǎng)24h后鏡檢，花粉管的伸長(zhǎng)長(zhǎng)度大于或等于花粉粒的直徑為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[4]。

花粉萌發(fā)率(%)=(萌發(fā)花粉數(shù)/總花粉數(shù))×100

1.2.3 不同蔗糖濃度對(duì)油橄欖花粉萌發(fā)率的影響 該試驗(yàn)在1.2.2選擇培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)的基礎(chǔ)上添加3個(gè)濃度的蔗糖[7]：3%、5%、10%。方法同1.2.2。

1.2.4 不同散粉條件下萌發(fā)率測(cè)定 試驗(yàn)在1.2.2和1.2.3對(duì)培養(yǎng)基的確定和蔗糖濃度確定的基礎(chǔ)上，測(cè)定5個(gè)品種在不同散粉條件下的萌發(fā)率。散粉條件為：室溫下陰干、自然光照。方法與1.2.2相同，培養(yǎng)3h后在顯微鏡下觀察萌發(fā)情況，每次觀察不少于3個(gè)視野，分別在3、6、12、18、24、48h后觀察油橄欖花粉萌發(fā)情況。

1.2.5 不同貯藏條件對(duì)萌發(fā)率的影響 參試“克羅萊卡”“科比多”“小蘋(píng)果”“阿布桑娜”“歐卡爾”5個(gè)油橄欖品種的花藥，平均分成2份放置在青霉素小瓶中，一份在室溫下進(jìn)行2、4、6、12h萌發(fā)率測(cè)定，另一份在4℃下進(jìn)行12h、24h、3d、5d、7d萌發(fā)率測(cè)定，測(cè)定方法同1.2.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同油橄欖品種的花粉量

經(jīng)計(jì)算，“克羅萊卡”“科比多”“小蘋(píng)果”“阿布桑娜”“歐卡爾”5個(gè)油橄欖品種單個(gè)花藥的花粉量分別為101000、51000、143000、52000、33000粒。不同品種之間花粉數(shù)量差異較大，“克羅萊卡”和“小蘋(píng)果”的花粉數(shù)量較高，單個(gè)花藥的花粉量均在100000粒以上?！翱票榷唷焙汀鞍⒉忌Ｄ取被ǚ哿烤又?，單個(gè)花藥的花粉量為50000左右?！皻W卡爾”花粉量最低。方差分析表明(表1)，5個(gè)油橄欖品種花粉量之間差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明油橄欖的花粉量的多少因品種不同而不同。

表1 5個(gè)油橄欖品種花粉量的方差分析

2.2 培養(yǎng)基確定

2.2.1 不同培養(yǎng)基選擇結(jié)果 由圖1可知，MS培養(yǎng)基和蘇瑾培養(yǎng)基對(duì)油橄欖“小蘋(píng)果”花粉萌發(fā)率差異較大，蘇瑾培養(yǎng)基萌發(fā)率呈起伏變化，在6h，花粉萌發(fā)率達(dá)到最高。MS培養(yǎng)基花粉萌發(fā)率先下降后上升，在24h達(dá)到最高，之后急劇下降。MS培養(yǎng)基最高花粉萌發(fā)率比蘇瑾培養(yǎng)基高出1.99倍，因此本試驗(yàn)所用培養(yǎng)基選擇MS培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)基油橄欖花粉萌發(fā)率

2.2.2 不同蔗糖濃度對(duì)油橄欖花粉萌發(fā)率影響試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加3個(gè)蔗糖濃度，“小蘋(píng)果”在不同蔗糖濃度下花粉萌發(fā)率表現(xiàn)不同，添加了蔗糖的MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率均高于對(duì)照，在3%蔗糖濃度下花粉萌發(fā)率最高，達(dá)到58.11%。以上試驗(yàn)說(shuō)明，培養(yǎng)基中添加蔗糖可有效提高油橄欖花粉萌發(fā)率，其中添加3%蔗糖處理的花粉萌發(fā)率最高。

表2 不同蔗糖濃度下油橄欖花粉萌發(fā)率

2.3 不同處理下油橄欖花粉

2.3.1 不同散粉條件下油橄欖花粉萌發(fā)率影響試驗(yàn)結(jié)果 由圖2a可知，在已確定的培養(yǎng)基上，陰干狀態(tài)下5個(gè)油橄欖品種的花粉萌發(fā)率都在24～48h出現(xiàn)最高點(diǎn)，萌發(fā)率范圍為11.06%～23.52%?！翱票榷唷焙汀鞍⒉忌Ｄ取痹?4h時(shí)花粉萌發(fā)率最高，分別是20.76%和11.06%，“克羅萊卡”“小蘋(píng)果”“歐卡爾”在48h時(shí)花粉萌發(fā)率最高，分別是23.52%、20.90%、16.93%。圖2b中，自然光照下5個(gè)油橄欖品種的花粉萌發(fā)率最高范圍為11.86%～36.97%，“阿布桑娜”和“歐卡爾”在12h時(shí)萌發(fā)率最高，分別為11.86%和20.20%，“科比多”在24h時(shí)花粉萌發(fā)率最高為25.53%，“克羅萊卡”和“小蘋(píng)果”在48h時(shí)花粉萌發(fā)率最高，分別為36.97%和16.87%。5個(gè)品種花粉萌發(fā)率自然光照均高于陰干，“克羅萊卡”自然光照下萌發(fā)率最高達(dá)36.97%。

圖2 不同環(huán)境下5品種花粉萌發(fā)變化

2.3.2 不同貯藏條件下貯藏時(shí)間對(duì)油橄欖花粉萌發(fā)率影響試驗(yàn)結(jié)果 常溫貯藏條件下油橄欖花粉萌發(fā)率的測(cè)定情況見(jiàn)圖3a，可以看出，在常溫條件下，5個(gè)品種隨貯藏時(shí)間的不同花粉萌發(fā)率存在很大的差異，但總體趨勢(shì)是隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)萌發(fā)率下降，不同品種間下降的速度存在一定差異。呈現(xiàn)兩種情況，一是剛收集時(shí)花粉萌發(fā)率高，隨著貯藏時(shí)間增加萌發(fā)率下降，主要是“阿布桑娜”“克羅萊卡”和“歐卡爾”3個(gè)品種，尤其“阿布桑娜”在2～4h萌發(fā)率下降程度最大，由13.52%降到5.61%。另一種是剛收集時(shí)萌發(fā)率較高，貯藏一段時(shí)間后萌發(fā)率有一定的上升，隨后逐漸降下來(lái)，主要是“科比多”和“小蘋(píng)果”，這可能由于采收當(dāng)日花器官未發(fā)育完全，而后進(jìn)行了二次發(fā)育[4]。總的來(lái)講，在常溫下隨著貯藏時(shí)間越久油橄欖花粉萌發(fā)率逐漸下降。4℃貯藏條件下油橄欖花粉萌發(fā)率的測(cè)定情況見(jiàn)圖3b?？梢钥闯觯洳貤l件下油橄欖花粉萌發(fā)率隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)總體上呈下降趨勢(shì)，但下降速度比室溫貯藏要緩慢得多，花粉萌發(fā)率的變化趨勢(shì)也是出現(xiàn)兩種情況：一種是萌發(fā)率持續(xù)下降，主要是“阿布桑娜”“科比多”“小蘋(píng)果”“克羅萊卡”4個(gè)品種，另一種是采集后貯藏一段時(shí)間花粉萌發(fā)率升高，隨后逐漸下降，主要是“歐卡爾”。相對(duì)于室溫貯藏，4℃貯藏條件下油橄欖花粉萌發(fā)率較高，而且在12h能保持在10%左右。

圖3 不同貯藏溫度下5種油橄欖花粉萌發(fā)率變化

3 討論

花粉萌發(fā)率是衡量花粉生活力狀況的主要檢測(cè)指標(biāo)之一，而花粉生活力則直接影響著雜交授粉的成功率[8]。花粉的萌發(fā)除了受花粉自身發(fā)育狀況的影響外，在很大程度上還受培養(yǎng)基成分的影響。作為能源物質(zhì)和碳源，蔗糖對(duì)花粉的萌發(fā)和生長(zhǎng)起著重要作用，適宜濃度的蔗糖能較好地維持培養(yǎng)基內(nèi)的低滲環(huán)境并較長(zhǎng)時(shí)間保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，但當(dāng)蔗糖濃度高于一定范圍時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致花粉管破裂，致使花粉不能萌發(fā)[9]。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同油橄欖花粉數(shù)量存在差異，5個(gè)油橄欖品種單個(gè)花藥花粉量在33000～143000粒，而且不同油橄欖品種的花粉活力不同，且耐貯藏能力也有差異?；ǚ刍盍Τ茏陨磉z傳因素影響外，也受到外界環(huán)境條件的影響[10]，同一油橄欖品種在不同散粉和貯藏條件下，花粉活力的差異很大。