趙 一 睿， 桑 雪， 畢 景 然， 張 公 亮， 郝 洪 順， 侯 紅 漫

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 紡織與材料工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

蜢蝦醬是中國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵水產(chǎn)品，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的風(fēng)味，其使用的蜢蝦主要分布在渤海，即海水與淡水接壤處[1]。用蜢蝦制成的蜢蝦醬比其他蝦醬具有更低的脂肪和膽固醇含量，更高的蝦青素和鈣含量。但在露天環(huán)境中加工容易受到微生物污染，很難控制蜢蝦醬的品質(zhì)。

生物胺是由氨基酸脫羧形成的具有生物活性的小分子量含氮有機(jī)化合物，廣泛存在于蛋白質(zhì)含量豐富的發(fā)酵水產(chǎn)品中[2]。攝入過(guò)量的生物胺會(huì)產(chǎn)生中毒、頭痛、呼吸紊亂、心悸、血壓變化等毒性作用，因此必須控制發(fā)酵水產(chǎn)品中生物胺的含量[3]。目前，利用胺氧化酶來(lái)減少食品中生物胺的積累是較有優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景的方法[4]。

枝芽孢桿菌屬常見(jiàn)于發(fā)酵食品中，它們與組胺、酪胺、腐胺及尸胺無(wú)顯著相關(guān)性，是蜢蝦醬所有細(xì)菌中最豐富的5個(gè)屬之一[1]。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，該物種可以作為發(fā)酵水產(chǎn)品的起始發(fā)酵劑。例如，將Virgibacillussp. SK37接種于魚露樣品中，該發(fā)酵劑具有在揮發(fā)性化合物，谷氨酸含量和總體可接受性方面改善的潛力[5]。從泰國(guó)蝦醬(Kapi)中分離出的V.halodenitrificansMSK-10P表現(xiàn)出了高蛋白酶活性和高鹽環(huán)境的耐受性，該菌株應(yīng)用于Kapi中會(huì)加速發(fā)酵過(guò)程，并提高其營(yíng)養(yǎng)成分[6]。

本研究從蜢蝦醬中篩選出一株不產(chǎn)生物胺的枝芽孢桿菌，通過(guò)安全性分析對(duì)其作為發(fā)酵劑的潛力進(jìn)行評(píng)估，并分析了菌株中胺氧化酶降解生物胺的特性及其在蜢蝦醬產(chǎn)品中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材 料

蜢蝦醬，產(chǎn)自山東威海；鹽反硝化枝芽孢桿菌(Virgibacillushalodenitrificans)，從蜢蝦醬中分離出的脫羧酶陰性耐鹽菌，實(shí)驗(yàn)室保藏；奶酪；納豆。

組胺、酪胺、腐胺及尸胺，阿拉丁試劑有限公司；丹磺酰氯，大連美侖生物技術(shù)有限公司；乙腈和甲醇，色譜純，斯百全化學(xué)有限公司；氯霉素、克林霉素、紅霉素、氨芐西林、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星，索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S6000高效液相色譜儀，華譜(中國(guó))有限公司；Sorvall ST 16R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；M2多功能酶標(biāo)儀，Danaher有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 菌株的生長(zhǎng)條件

菌株在LB肉湯或LB瓊脂培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，在LB肉湯中傳代培養(yǎng)24 h，在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落在LB肉湯中培養(yǎng)24 h后使用。

1.3.2 生物胺降解能力評(píng)價(jià)

將種子液以1%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集菌體，0.05 mol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，然后把菌體重懸到含4種生物胺(組胺、酪胺、腐胺及尸胺)(500 mg/L)的PBS溶液中，調(diào)整菌懸液OD600為0.8，在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)48 h。將不含任何細(xì)菌細(xì)胞的PBS溶液在相同條件下處理作為對(duì)照組。分別測(cè)定對(duì)照組(ρ0)和實(shí)驗(yàn)組(ρ1)上清液中的生物胺質(zhì)量濃度(mg/L)，計(jì)算生物胺的降解率[7]。

降解率=(ρ0-ρ1)/ρ0×100%

1.3.3 生物胺降解酶的類型及分布

1.3.3.1 胺氧化酶活性測(cè)定

用接種環(huán)挑取單菌落到白色潔凈濾紙中，加入200 μL 1%二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽溶液，胺氧化酶陽(yáng)性呈粉紅色，逐漸加深，加入200 μL 1% α-萘酚乙醇溶液，陽(yáng)性0.5 min內(nèi)呈藍(lán)色，陰性2 min 內(nèi)不變色[8]。

1.3.3.2 生物胺降解菌中胺氧化酶的分布

取活化好的生物胺降解菌種子液以1%的接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清液為細(xì)胞外組分；沉淀用預(yù)冷到4 ℃的PBS溶液洗滌細(xì)胞2次，重懸一部分懸浮液被收集為完整細(xì)胞組分；另一部分菌懸液用組織研磨器研磨30 min，將混合物在4 ℃、10 000 r/min離心30 min，收集上清液作為細(xì)胞內(nèi)組分。沉淀用PBS溶液洗滌2次，重懸為細(xì)胞膜組分。測(cè)定各組分生物胺質(zhì)量濃度，并計(jì)算各生物胺的降解率，分析生物胺降解酶的分布[9]。

1.3.3.3 EDTA對(duì)胺氧化酶的影響

取活化好的生物胺降解菌種子液以1%的接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，重懸于終濃度20 mmol/L的EDTA以及4種生物胺(組胺、酪胺、腐胺、尸胺)(500 mg/L)的PBS溶液中，調(diào)整菌懸液OD600為0.8，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。將不含任何細(xì)菌細(xì)胞的PBS溶液在相同條件下處理作為對(duì)照組，測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組上清液中各生物胺質(zhì)量濃度，并計(jì)算各生物胺的降解率，分析EDTA對(duì)生物胺降解菌中胺氧化酶的影響[10]。

1.3.4 生物胺降解菌的安全性能評(píng)價(jià)

1.3.4.1 溶血活性測(cè)定

在血瓊脂(LB固體培養(yǎng)基中加入5%羊血)上劃線檢測(cè)菌株的溶血活性。溶血反應(yīng)通過(guò)在血瓊脂上形成的菌落周圍出現(xiàn)透明區(qū)(β-溶血：紅細(xì)胞完全溶解)、綠色區(qū)(α-溶血：紅細(xì)胞血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白)或無(wú)任何區(qū)域(γ-溶血：無(wú)溶血活性)來(lái)檢測(cè)[11]。

1.3.4.2 抗生素耐藥性檢測(cè)

菌株對(duì)氯霉素、克林霉素、紅霉素、氨芐西林、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星8種臨床上重要抗生素的敏感性。根據(jù)EFSA指南進(jìn)行選擇，測(cè)試枝芽孢桿菌屬的細(xì)菌敏感性。使用基于乳桿菌(ISO 10932—2010)肉湯微量稀釋法進(jìn)行檢測(cè)[12]。

1.3.4.3 生物膜活性的測(cè)定

將菌株種子液與LB液體培養(yǎng)基按體積比1∶100 混合均勻，加入96孔板中，空白對(duì)照為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，用排槍除去浮游細(xì)菌，用0.01 mol/L PBS溶液洗滌，無(wú)水甲醇固定，干燥后加入結(jié)晶紫溶液染色15 min，蒸餾水洗滌3次，將平板吹干，加入冰醋酸進(jìn)行溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD590[13]，每組做6個(gè)平行試驗(yàn)。生物膜形成量的判斷標(biāo)準(zhǔn)：ODC=陰性對(duì)照的平均值+3×陰性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)差。生物膜分類：OD590≤ODC，無(wú)生物膜；ODC4ODC，強(qiáng)生物膜。

1.3.5 生物胺降解菌的應(yīng)用潛力

1.3.5.1 蜢蝦醬中生物胺的降解

將500 μL活化好的生物胺降解菌種子液添加到100 mL錐形燒瓶中，錐形燒瓶中裝有50 g蜢蝦醬樣品，對(duì)照組用500 μL無(wú)菌蒸餾水代替菌液培養(yǎng)，37 ℃孵育10 d。離心收集上清液，測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組上清液中各生物胺質(zhì)量濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。分析生物胺降解菌對(duì)蜢蝦醬中生物胺的影響。

1.3.5.2 其他發(fā)酵產(chǎn)品中生物胺的降解

將500 μL活化好的生物胺降解菌種子液添加到100 mL錐形燒瓶中，錐形燒瓶中分別裝有50 g的奶酪以及納豆樣品，對(duì)照組用500 μL無(wú)菌蒸餾水代替菌液培養(yǎng)，37 ℃孵育10 d。離心收集上清液，測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組上清液中各生物胺質(zhì)量濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次進(jìn)行。分析生物胺降解菌對(duì)奶酪和納豆中生物胺的降解情況。

1.3.6 高效液相色譜法的測(cè)定

1.3.6.1 生物胺的柱前衍生

參照盧士玲等[14]的方法，取400 μL生物胺提取液，加入80 μL 2 mol/L NaOH使之呈堿性，再加入120 μL飽和NaHCO3溶液緩沖，加入800 μL 10 mg/mL丹磺酰氯丙酮溶液，混合溶液在45 ℃黑暗中反應(yīng)45 min，加入50 μL氨水終止反應(yīng)，在室溫下反應(yīng)30 min除去殘留的丹磺酰氯溶液，加入550 μL乙腈，在4 ℃、3 000 r/min離心5 min，衍生處理后0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.3.6.2 色譜條件

色譜柱C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，體積流量1 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈，采用梯度洗脫程序，洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 The procedure of gradient elution

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)的形式表示，所有統(tǒng)計(jì)分析均基于重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，使用SPSS 19.0軟件包分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)確定菌株之間的差異是否顯著，使用鄧肯式多重比較在5%水平評(píng)估處理樣品之間差異的顯著性，以P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物胺降解能力的評(píng)價(jià)

由圖1可知，鹽反硝化枝芽孢桿菌生物胺降解率分別為組胺13.60%、酪胺15.81%、腐胺18.87%和尸胺10.02%。因此，從蜢蝦醬中分離出的鹽反硝化枝芽孢桿菌，由于其脫羧酶活性呈陰性，并且具有降解生物胺的能力，故可作為控制食品中生物胺形成的潛在候選菌株。

圖1 鹽反硝化枝芽孢桿菌降解生物胺的能力Fig.1 The ability of Virgibacillus halodenitrificansto degrade biogenic amines

2.2 生物胺降解酶的類型及分布

利用某些微生物產(chǎn)生的胺氧化酶將生成的生物胺降解，是目前去除食品中生物胺最有前景的方式。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵香腸中接種具有胺氧化酶活性的葡萄球菌R11，有助于減少組胺的積累。將生物胺降解菌進(jìn)行胺氧化酶活性分析。圖2(a)表明，鹽反硝化枝芽孢桿菌呈胺氧化酶陽(yáng)性，即其降解生物胺起作用的酶為胺氧化酶。

胺氧化酶主要分布在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)上[16]，為了確定胺氧化酶的位置，制備了鹽反硝化枝芽孢桿菌培養(yǎng)后的不同組分，并分別與其完整細(xì)胞的生物胺降解能力進(jìn)行比較。如圖2(b)所示，這株生物胺降解菌在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)組分生物胺降解活性均較低，降解率均低于3%，在細(xì)胞膜組分顯示出較高降解活性，但是降解率略低于完整細(xì)胞，這可能歸因于細(xì)胞組織研磨器在破碎過(guò)程中造成了部分胺氧化酶的失活。因此，可以推斷胺氧化酶位于鹽反硝化枝芽孢桿菌的細(xì)胞膜上。

分析EDTA對(duì)生物胺降解菌中胺氧化酶的影響，以初步分析判斷胺氧化酶的類型。如圖2(c)所示，對(duì)于鹽反硝化枝芽孢桿菌，未加EDTA組的組胺、酪胺、腐胺和尸胺降解率分別為13.2%、14.7%、15.8%和7.4%，而加EDTA組僅降解了3.0%的腐胺，而對(duì)其他生物胺不具備降解活性。有報(bào)道表明，含銅的生物胺氧化酶的活性會(huì)被EDTA顯著抑制[8]，因此可以推斷出鹽反硝化枝芽孢桿菌含有銅胺氧化酶，但是否還存在其他胺氧化酶無(wú)法判斷，要得到確切的結(jié)果需要對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)、氨基酸序列以及輔酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

(a) 胺氧化酶試驗(yàn)

2.3 生物胺降解菌的安全性能評(píng)價(jià)

由圖3可知，鹽反硝化枝芽孢桿菌不會(huì)誘導(dǎo)溶血(γ溶血)；根據(jù)EFSA(2012)規(guī)定，如果需要將細(xì)菌產(chǎn)品用作添加劑，則應(yīng)評(píng)估該菌株對(duì)一定范圍的人類和獸醫(yī)學(xué)重要性抗生素的敏感性，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，胺氧化酶位于鹽反硝化芽孢桿菌的細(xì)胞膜上，說(shuō)明該菌對(duì)常見(jiàn)抗生素敏感。根據(jù)MIC數(shù)據(jù)，所有值均低于EFSA(2012)中提到的斷點(diǎn)極限值。生物膜是一個(gè)有組織的功能性細(xì)菌種群，當(dāng)細(xì)菌形成生物膜時(shí)，它們對(duì)抗生素的抗性將增強(qiáng)。鹽反硝化枝芽孢桿菌的OD590為0.006 1，低于ODC(0.046 4)，不具有生物膜形成能力。

表2 抗生素對(duì)生物胺降解菌的最低抑菌濃度Tab.2 Minimum inhibitory concentration of antibioticsagainst biogenic amine degrading bacteria mg/L

2.4 生物胺降解菌的應(yīng)用潛力

鹽反硝化枝芽孢桿菌由于其不產(chǎn)生物胺且具有生物胺降解能力而可能成為控制生物胺的潛在候選者。為了評(píng)估其對(duì)蜢蝦醬中生物胺的降解能力，將500 μL接種物添加到含有50 g蜢蝦醬樣品的錐形瓶中，在37 ℃培養(yǎng)10 d。經(jīng)測(cè)定，蜢蝦醬樣品的食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(23.47±1.68)%，pH為(6.98±0.14)。未接種菌株的對(duì)照組樣品顯示出較高的生物胺質(zhì)量濃度，這是由于蜢蝦醬中的天然微生物發(fā)酵所致。由表3可知，4種生物胺在接入鹽反硝化枝芽孢桿菌后都有所降解。表明這株生物胺降解菌可有效降解蜢蝦醬中的生物胺，然而復(fù)雜的發(fā)酵環(huán)境，尤其是鹽濃度較高的條件下會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)還會(huì)降低大多數(shù)胺氧化酶的活性[17]。

表3 鹽反硝化枝芽孢桿菌降解蜢蝦醬中生物胺的能力

2.4.2 鹽反硝化枝芽孢桿菌對(duì)其他發(fā)酵產(chǎn)品中生物胺的降解

為了評(píng)估生物胺降解菌對(duì)其他發(fā)酵產(chǎn)品中生物胺的降解率，選擇了生物胺含量較高的奶酪和納豆作為研究對(duì)象，將500 μL接種物分別添加到含有50 g奶酪或納豆樣品中，在37 ℃培養(yǎng)10 d。測(cè)定奶酪樣品的食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(9.25±0.87)%，pH為(6.98±0.14)。納豆在加工過(guò)程中不添加氯化鈉，pH為(7.06±0.27)。如表4所示，4種生物胺在接入鹽反硝化枝芽孢桿菌后都有所降解，表明該菌作為發(fā)酵劑接種于其他發(fā)酵產(chǎn)品中，對(duì)生物胺仍然有很高的降解能力，故可以應(yīng)用于蜢蝦醬以外的發(fā)酵產(chǎn)品。

表4 鹽反硝化枝芽孢桿菌對(duì)奶酪和納豆中生物胺的降解能力Tab.4 The ability of Virgibacillus halodenitrificans to degrade biogenic amines in cheese and natto mg/L

3 結(jié) 論

鹽反硝化枝芽孢桿菌呈脫羧酶陰性(不具備產(chǎn)生生物胺的能力)，能降解發(fā)酵產(chǎn)品生物胺，將該菌接種于蜢蝦醬，組胺、酪胺、腐胺和尸胺的降解率分別為11.1%、11.3%、15.5%和4.1%。該菌降解生物胺的酶主要是位于細(xì)胞膜上的胺氧化酶，利用胺氧化酶來(lái)降低發(fā)酵產(chǎn)品中的生物胺是目前最為有效的手段。對(duì)鹽反硝化枝芽孢桿菌進(jìn)行安全性能評(píng)估，發(fā)現(xiàn)其滿足相關(guān)的安全標(biāo)準(zhǔn)，可以降解產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中有害生物胺，作為發(fā)酵產(chǎn)品中有效的生物控制劑。將該菌應(yīng)用于其他發(fā)酵產(chǎn)品，奶酪中組胺、酪胺和腐胺降解分別為37.03%、15.67%和23.70%；納豆中組胺、酪胺、腐胺和尸胺降解率分別為26.47%、14.23%、10.50%和10.40%。