張 靖 軒， 叢 麗 娜， 陳 清 平， 何 媛 媛， 趙 金， 關(guān) 長 城

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

植物乳桿菌為一類革蘭氏陽性菌，在自然界廣泛存在，尤其是分布在海洋生物體和各類發(fā)酵食品中，同時也是動物胃腸道的優(yōu)勢菌群，具有調(diào)節(jié)動物胃腸道菌群平衡、改善腸道內(nèi)環(huán)境、增強免疫力和抵抗力等多種功能[1-3]。此外，許多植物乳桿菌在代謝過程中除了會產(chǎn)生乳酸、乙酸、過氧化氫外，還會產(chǎn)生一些具有抑菌活性的物質(zhì)，稱為的植物乳桿菌素。它是植物乳桿菌代謝過程中合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的殺菌蛋白或多肽物質(zhì)[4-5]。田雪嬌等[6]從泡菜中分離出一株植物乳桿菌LY-78，研究表明它能明顯抑制致病菌的生長，延長牛肉保存時間。Wang等[7]從西藏牦牛糞便中分離出兩株植物乳桿菌，它們對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌表現(xiàn)出很強的抑制作用。Agbankpe等[8]從動物體內(nèi)分離出來一株植物乳桿菌，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)其在體外能明顯抑制沙門氏菌的生長。由于植物乳桿菌素?zé)o毒副作用、無殘留、無抗藥性，并且可以抑制或殺死多種食品中常見的致病菌，具有熱穩(wěn)定性且易被人體腸道消化降解，因而作為一種生物防腐劑受到食品工業(yè)青睞[9]。

科學(xué)的培養(yǎng)基組分和配比不僅促進菌體的快速生長繁殖，增強微生物代謝性能，也能提高資源利用率，降低生產(chǎn)成本[10-11]。在提高菌種生長方面，高玉榮等[12]利用正交試驗優(yōu)化植物乳桿菌G1-28培養(yǎng)基，活細胞數(shù)最多可達1.98×1010CFU/mL；在提高抑菌活性方面，王瑤等[13]利用響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌LPL-1培養(yǎng)基成分，使細菌素相對抑菌效價提高了1.62倍。以往實驗室利用培養(yǎng)乳酸菌的通用MRS培養(yǎng)基進行植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，但使用該培養(yǎng)基所分泌活性物質(zhì)的產(chǎn)量較低，無法滿足實際生產(chǎn)要求。

本實驗以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，使用單因素試驗和響應(yīng)面法對培養(yǎng)基組分進行系統(tǒng)優(yōu)化，以期提高植物乳桿菌的發(fā)酵轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

實驗菌株：植物乳桿菌HS-R9，本實驗室從大連海域的海參腸道中篩選得到。

指示菌株：副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

原始培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，乙酸鈉2 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，磷酸二氫鉀2 g，檸檬酸銨2 g，七水硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳0.05 g；加蒸餾水至1 000 mL，pH調(diào)至6.3，121 ℃滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g；加蒸餾水至1 000 mL，pH調(diào)至7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 菌株活化與發(fā)酵

一級活化：將植物乳桿菌HS-R9接入10 mL的MRS液體培養(yǎng)基之中，接種量1%，在37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

二級活化：將一級活化后的菌液接種于50 mL 的MRS培養(yǎng)基，接種量2%，在37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將二級活化后的菌液接種于100 mL 的MRS培養(yǎng)基中，接種量5%，在37 ℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h。

1.2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.2.1 單因素試驗

以MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別選擇不同組分作為培養(yǎng)基的碳源、氮源和緩沖溶劑。碳源包括乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉；氮源包括牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨；緩沖溶劑包括檸檬酸銨、檸檬酸氫二銨、硫酸銨、碳酸銨。分別將各個培養(yǎng)基在37 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)植物乳桿菌48 h，取發(fā)酵液在4 ℃、12 000 r/min 下離心10 min得到上清液。以副溶血性弧菌為指示菌，利用牛津杯法進行抑菌圈測定。

1.2.2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，將碳源、氮源、緩沖溶劑3個關(guān)鍵因子設(shè)為考察變量。使用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件中Box-Benhnken模塊進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，優(yōu)化由單因素試驗選取的培養(yǎng)基成分的最佳添加量[14]。該3個關(guān)鍵因子按響應(yīng)面設(shè)計不同添加量配制發(fā)酵培養(yǎng)基，共17組，每組做3個平行試驗；在37 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h后，收集發(fā)酵上清液進行抑菌活性檢測。

1.2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果的測定

發(fā)酵液抑菌活性的測定：各組離心后取上清液，以副溶血性弧菌為指示菌進行抑菌試驗，比較抑菌圈直徑。

發(fā)酵產(chǎn)物的測定：取發(fā)酵上清液各100 mL，與乙酸乙酯按體積比1∶1.5混合，20 ℃攪拌萃取12 h，分離發(fā)酵液與萃取液。取萃取液100 mL在40 ℃下真空旋干，測定各組發(fā)酵產(chǎn)物并進行比較。

1.2.4 發(fā)酵液對食品中常見致病菌抑菌活性的測定

利用幾種在食品工業(yè)和養(yǎng)殖行業(yè)中常見的致病菌作為指示菌，包括銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)。將培養(yǎng)后的指示菌液體分別涂布于LB固體平皿上，再取發(fā)酵上清液200 μL加入牛津杯中，將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放置在37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，測定抑菌圈直徑，確定發(fā)酵液對不同菌種的抑菌作用。

1.2.5 溫度和pH對抑菌物質(zhì)活性的影響

發(fā)酵液在4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，取上清液進行試驗。共設(shè)置8組試驗，每組做3個平行。研究溫度對抑菌活物質(zhì)活性的影響，將每個試驗組分別置于37(對照組)、40、50、60、70、80、90、100 ℃的環(huán)境中處理30 min，水平將上清液冷卻至常溫，測定其抑菌活性。研究pH對抑菌活物質(zhì)活性的影響，將上清液pH分別調(diào)至1、2、3、4(對照組)、5、6、7、8，在37 ℃下處理1 h后，測定其抑菌活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

由表1可以看出，在碳源選擇試驗中，各碳源的抑菌圈直徑從大到小依次是乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉，其中乳糖作為碳源時得到的抑菌圈直徑最大，因此選擇乳糖作為碳源。在氮源選擇試驗中，各氮源的抑菌圈直徑從大到小依次是酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨，其中酵母浸粉作為氮源時抑菌圈直徑最大，因此選用酵母浸粉作為氮源。在緩沖溶劑的選擇試驗中，各緩沖溶劑的抑菌圈直徑從大到小依次是檸檬酸銨、檸檬酸氫二銨、碳酸銨、硫酸銨，其中檸檬酸銨作為緩沖溶劑時抑菌圈直徑達到19.1 mm；因此選擇檸檬酸銨作為緩沖溶劑。

表1 單因素試驗結(jié)果Tab.1 The results of single factor experiment

2.2 響應(yīng)面設(shè)計方案和結(jié)果

以乳糖20 g/L、酵母浸粉20 g/L、檸檬酸銨3 g/L 為中心點，設(shè)計響應(yīng)面試驗，Box-Benhnken設(shè)計因素水平見表2。

表2 Box-Benhnken設(shè)計試驗因素水平Tab.2 Box-Benhnken experimental design g/L

各個因素在回歸擬合后，計算得到植物乳桿菌發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑。乳糖(A)、酵母浸粉(B)、檸檬酸銨(C)質(zhì)量濃度的二次多項回歸方程：

Y=22.07-0.34A+0.34B-0.17C-0.28AB+0.12AC-0.21BC-1.85A2-1.71B2-1.36C2

表3 響應(yīng)面方差分析表Tab.3 Response surface analysis of variance

2.3 響應(yīng)面分析及最佳培養(yǎng)基成分的確定

由圖1可看出乳糖、酵母浸粉、檸檬酸銨三因素的交互作用明顯，對抑菌圈直徑影響極為顯著。根據(jù)Box-Benhnken實驗結(jié)果，參數(shù)的最佳水平分別為乳糖19.48 g/L、酵母浸粉21.12 g/L、檸檬酸銨2.92 g/L，在此條件下，經(jīng)系統(tǒng)計算得到抑菌圈直徑的最大理論值為22.0 935 mm。

(a) 乳糖與酵母浸粉

(b) 酵母浸粉與檸檬酸銨

(c) 乳糖與檸檬酸銨

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化水平的判定

將優(yōu)化后的培養(yǎng)基與MRS培養(yǎng)基進行發(fā)酵對比，結(jié)果如圖2所示。MRS培養(yǎng)基的抑菌圈直徑為17.84 mm，優(yōu)化后培養(yǎng)基的抑菌圈直徑為21.46 mm，比優(yōu)化前提高了20.29%。

利用乙酸乙酯分別萃取對照組(MRS培養(yǎng)基)和實驗組(優(yōu)化培養(yǎng)基)的抑菌活性物質(zhì)，各取100 mL萃取液在40 ℃真空旋干后測定產(chǎn)物質(zhì)量。結(jié)果顯示，對照組中提取得到的產(chǎn)物質(zhì)量為

(a) MRS培養(yǎng)基

0.184 g，實驗組為0.292 g，比對照組提高了58.42%。

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物對常見致病菌抑菌活性的測定

由表4可見，植物乳桿菌HS-R9所產(chǎn)活性物質(zhì)的抑菌范圍較廣，對食品中常見的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有較高的活性，其中對副溶血性弧菌和單增李斯特菌的抑制作用最明顯。副溶血性弧菌是目前首要的食源性致病菌，而單增李斯特菌也是食物中常見的一種污染菌，能造成人嚴重的食物中毒。對常見致病菌抑菌活性的測定說明植物乳桿菌HS-R9所產(chǎn)的活性物質(zhì)在食品工業(yè)中的具有潛在的應(yīng)用價值。

表4 發(fā)酵產(chǎn)物對常見病菌抑菌活性的測定Tab.4 Determination of antibacterial activity offermentation products

2.6 溫度和pH對抑菌物質(zhì)活性的影響

如表5所示，植物乳桿菌HS-R9產(chǎn)的活性物質(zhì)在40～70 ℃可以保持較高的抑菌活性，而在高于70 ℃時抑菌活性略有下降。經(jīng)過高溫處理后，發(fā)酵液內(nèi)并未產(chǎn)生沉淀物質(zhì)。因此可推斷，植物乳桿菌HS-R9所產(chǎn)的活性物質(zhì)具有較強的熱穩(wěn)定性。同時，該活性物質(zhì)在pH為4時具有較高的抑菌活性，但當(dāng)pH大于或者小于4時，抑菌活性有一定幅度下降，特別是當(dāng)pH大于7，抑菌活性完全消失。

表5 溫度和pH對抑菌活性物質(zhì)的影響Tab.5 Effect of temperature and pH on the antibacterialactive substances

3 結(jié) 論

以發(fā)酵液抑菌圈直徑為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法對培養(yǎng)基主要成分進行優(yōu)化。結(jié)果表明，培養(yǎng)植物乳桿菌HS-R9的最佳培養(yǎng)基碳源、氮源和緩沖溶劑分別為乳糖19.48 g/L、酵母浸粉21.12 g/L和檸檬酸銨2.92 g/L，方差分析結(jié)果表明擬合程度較好。對比試驗結(jié)果顯示，優(yōu)化后培養(yǎng)基發(fā)酵液抑菌活性提高了20.29%，其單位體積發(fā)酵液中產(chǎn)物質(zhì)量增加了58.42%。測定發(fā)酵產(chǎn)物對食品中致病菌抑菌活性，表明植物乳桿菌HS-R9所產(chǎn)的活性物質(zhì)對常見致病菌有較強的抑制作用。溫度和pH對抑菌活性的影響結(jié)果表明，植物乳桿菌HS-R9所產(chǎn)活性物質(zhì)具有耐酸耐高溫能力，但對堿性環(huán)境的抵抗能力較弱。