賈 樂 劉瑞玲 房祥軍 陳杭君,* 郜海燕,*

(1 浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321000；2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

蓮藕(NelumbonuciferaGaertn.)屬睡蓮科蓮屬植物，在我國(guó)種植歷史悠久，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是國(guó)內(nèi)外廣受歡迎的水生根莖類蔬菜[1]。蓮藕富含鉀、鐵、銅、維生素和膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)維持心臟及健康、降低血壓、提高免疫力等有一定的功效[2-3]，具有抗肥胖、保肝、抗菌、利尿和清熱生津等藥用功能[4-6]，深受消費(fèi)者喜愛，市場(chǎng)份額逐年增加[7]。蓮藕已成為人們?nèi)粘Ｉ铒嬍持兄匾慕M成部分[8]。但由于蓮藕組織嬌嫩，含水量高，極易受微生物侵染，常溫下貯藏5～7 d便會(huì)出現(xiàn)褐變、干縮、霉?fàn)€等問題[9]，在很大程度上影響蓮藕的可食用品質(zhì)，縮短蓮藕貨架期，造成資源浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失。

果蔬采后腐爛的原因主要有生理衰老、機(jī)械損傷和侵染性病害，其中大部分采后腐爛損失由病原菌侵染引起[10]，在病原微生物中，真菌對(duì)果蔬貯藏期間的危害最為嚴(yán)重且種類數(shù)量最多[11]。目前對(duì)蓮藕采后貯藏方面的報(bào)道主要集中在保鮮技術(shù)方面，在微生物病害方面的研究較少，且大部分研究是從田間直接采集病株進(jìn)行致病微生物的分離鑒定。目前國(guó)內(nèi)已報(bào)道的尖孢鐮刀菌引起的蓮藕腐敗病[12]、膠孢炭疽菌引起的蓮藕炭疽病[13]、睡蓮假尾孢菌引起的黑斑病[14]等均為真菌引起的蓮藕采前病害。也有報(bào)道對(duì)低溫貯藏條件下的腐敗蓮藕進(jìn)行病原菌分離，羅海莉[15]對(duì)采后4～10℃貯藏的蓮藕腐爛病原菌進(jìn)行分離發(fā)現(xiàn)，其主要病原菌為芽枝孢霉、交鏈孢霉和鐮刀菌；李慧[16]進(jìn)一步研究確定低溫下引起蓮藕采后腐爛的主要致腐病原菌為茄病鐮刀菌和尖孢鐮刀菌。但針對(duì)蓮藕采后常溫貯藏過程中的致腐微生物相關(guān)研究較少。蓮藕采收于高溫季節(jié)，在常溫下極易被微生物侵染而發(fā)生腐敗，因此新鮮蓮藕采后在常溫條件下最多能貯藏7 d。本研究對(duì)25℃常溫貯藏條件下發(fā)生腐敗的蓮藕進(jìn)行病原菌分離鑒定，并研究其主要致腐真菌的生物學(xué)特性，以期為后續(xù)采取針對(duì)性的防腐保鮮措施提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

以鄂蓮五號(hào)蓮藕為試驗(yàn)材料，樣品采自浙江省杭州市余杭區(qū)灣里塘蓮藕合作社。于采摘當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選50根大小均一、色澤亮白、無機(jī)械損傷和病蟲害的蓮藕，隨機(jī)分成10組，用紫外照射過的聚乙烯PE袋進(jìn)行包裝，每袋約5 kg，模擬常溫下自然貯藏條件，將包裝好的蓮藕挽口放置于濕度40%～50%，溫度25℃的條件下貯藏，每天定期觀察其發(fā)病情況。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)、平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)(plate count agar, PCA)、孟加拉紅培養(yǎng)基，上海盛思生物科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒，上海生物工程股份有限公司；葡萄糖、D-果糖、麥芽糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨、尿素，上海生物工程科技有限公司；硫酸銨，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；酵母浸出粉，上海盛思生化科技有限公司；甘露醇，上海源葉生物科技有限公司；乳糖，上海伯奧生物科技有限公司；麥芽糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器，松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社；MJX-160B-Z霉菌培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；BSC-130011A2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)科技有限公司；Peltier Thermal Cycler MG48 PCR儀，美國(guó)BioRad公司；Axio Vert A1蔡司倒置熒光顯微鏡，德國(guó)卡爾蔡司股份公司；WD9413C凝膠成像分析系統(tǒng)，北京六一生物科技有限公司；MIR-254恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋電器股份有限公司。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 腐敗菌的分離純化及致病性測(cè)定 采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離，參照杜小琴等[17]的方法并略作修改，將常溫下自然發(fā)病的蓮藕按照病癥進(jìn)行分組，切取4～5 mm病健交界處組織，在酒精中浸泡20 s，再用無菌水洗滌3次后置于PDA培養(yǎng)基中，每一病癥設(shè)置5個(gè)平行，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。以上操作均在無菌環(huán)境下進(jìn)行。每天觀察其菌絲生長(zhǎng)情況，用無菌接種環(huán)挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基上，重復(fù)操作3～5次，直至菌落形態(tài)穩(wěn)定。獲得的純培養(yǎng)物于4℃冰箱保存。病原菌致病性的測(cè)定采用針刺法。選取健康無機(jī)械損傷的蓮藕，清水沖去表面污泥，75%酒精表面消毒30 s，再用無菌水清洗3次，置于超凈工作臺(tái)上晾干備用。將菌株活化后用無菌打孔器打取直徑約6 mm的菌餅，用無菌針刺破處理好的蓮藕，將病原菌接種至傷口內(nèi)，以接種同體積的無菌PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。將接種好的蓮藕置于經(jīng)紫外照射處理過的聚乙烯PE袋進(jìn)行包裝，28℃恒溫箱避光培養(yǎng)，定期觀察蓮藕發(fā)病情況。待發(fā)病后，按照1.3.1方法對(duì)病原菌再次進(jìn)行分離，將2次分離得到的病原菌的菌絲及菌落形態(tài)進(jìn)行對(duì)比，判斷兩者是否一致。

1.3.2 腐敗菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定 用打孔器在活化菌落邊緣打取直徑約6 mm的菌餅，轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每天觀察并記錄其菌落大小、形狀、顏色、菌絲密集度及擴(kuò)展直徑，并在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)。腐敗菌基因組DNA的提取參照劉小玉等[18]的方法，將純化好的腐敗菌轉(zhuǎn)接于PDA平板上進(jìn)行活化，待長(zhǎng)出菌落后，用無菌接種環(huán)刮取少量菌絲于PDB培養(yǎng)基中，28℃搖床振蕩(120 r·min-1)培養(yǎng)48 h，用無菌濾紙過濾得到菌絲體，再用無菌水洗滌3～5次，濾紙吸干多余水分，收集菌絲0.1～0.3 g，使用液氮進(jìn)行研磨，剩余操作按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為：ITS1：5′-T C G T A G G T GA A C C T G C GG-3′，ITS4：5′-T C C T C C G C T T A T T G A T A T GC-3′。引物合成委托杭州有康生物技術(shù)有限公司完成。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL、引物ITS1和ITS4各1 μL、模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。 按照說明書和設(shè)定PCR反應(yīng)程序，其中延伸時(shí)間根據(jù)目的基因序列長(zhǎng)度進(jìn)行設(shè)定，退火溫度根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行設(shè)定。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，58℃復(fù)性15 s，72℃延伸15 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，PCR產(chǎn)物測(cè)序由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。將測(cè)序所得序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast在線比對(duì)，選取同源性較高的已知序列。利用BioEdit、MEGA7.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建菌株與親緣關(guān)系較近物種的系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合菌株形態(tài)，確定菌株種屬。

1.3.3 腐敗菌生物學(xué)特性分析

1.3.3.1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 設(shè)置5、10、15、20、25、30、35、40℃共8個(gè)培養(yǎng)溫度，在培養(yǎng)2 d的菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，轉(zhuǎn)接至新的PDA平板中央，每個(gè)處理溫度設(shè)置3個(gè)平行，28℃培養(yǎng)箱進(jìn)行暗培養(yǎng)，48 h后采用十字交叉法測(cè)量病原菌得擴(kuò)展直徑，并觀察記錄菌絲密集程度。

1.3.3.2 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 以察氏固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等物質(zhì)量的D-果糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、葡萄糖和可溶性淀粉替代察氏固體培養(yǎng)基中的碳源，用等物質(zhì)量的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出粉、硫酸銨、硝酸銨和尿素替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，兩者均以無碳氮源的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，其余方法同1.3.3.1。

1.3.3.3 致死溫度測(cè)定 參照趙璐藐等[19]的方法，設(shè)置40、45、50、55、60、65、70℃共7個(gè)處理溫度，用打孔器從活化的菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌餅，置于裝有5 mL無菌水的試管中，在以上設(shè)定溫度水浴加熱10 min,取出后迅速冷卻并接種于PDA平板上，其余方法同1.3.3.1。

1.3.3.4 不同光照條件及pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，分別置于24 h持續(xù)光照、12 h光暗交替、24 h持續(xù)黑暗3個(gè)條件，設(shè)置4、5、6、7、8、9、10、11共8個(gè)pH值對(duì)病原菌的酸堿適應(yīng)性進(jìn)行測(cè)定，其余方法同1.3.3.1。

1.3.3.5 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 選取孟加拉紅培養(yǎng)基、蓮藕汁培養(yǎng)基、PDA、PCA以及清水瓊脂培養(yǎng)基(water agar，WA)共5個(gè)處理，其余方法同1.3.3.1。除測(cè)定不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)時(shí)，將病原菌置于不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中，其余試驗(yàn)均于28℃恒溫箱中進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著差異性分析用SPSS 19軟件進(jìn)行(P<0.05表示差異顯著)，采用GraphPad Prism8進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和圖片繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗菌的分離純化及致病性檢測(cè)

蓮藕在常溫貯藏條件下易發(fā)生腐爛，其自然發(fā)病癥狀為：貯藏第3天，蓮藕表面出現(xiàn)白色絨狀物，隨后蓮藕表面褐變，組織軟化、腐爛(圖1-A)。采用組織分離法，從腐爛部位共分離出3株真菌，分別標(biāo)記為L(zhǎng)O-1、 LO-2、 LO-3， 根據(jù)科赫氏法則[20]對(duì)分離出的真菌進(jìn)行回接驗(yàn)證，將病原菌分別接種至新鮮蓮藕上，只有LO-1能導(dǎo)致蓮藕腐爛，且腐爛部位分離得到的菌株與自然發(fā)病部位分離得到的菌株相一致(圖1-B)，從發(fā)病部位也可分離得到LO-1菌株，表明LO-1菌為蓮藕采后致腐病原菌。挑取菌落邊緣部位的菌絲對(duì)蓮藕致腐菌進(jìn)行分離純化，病原菌培養(yǎng)2～3 d時(shí)，菌落呈白色絨毛狀，近圓形，氣生菌絲旺盛(圖1-C)，顯微鏡下觀察菌絲無隔(圖1-D)。培養(yǎng)7 d后，菌落開始變?yōu)榈G色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落逐漸變?yōu)楹谏?，培養(yǎng)至第14天時(shí)，菌絲出現(xiàn)有隔形態(tài)(圖1-E)。該菌產(chǎn)孢條件較為苛刻，在燕麥培養(yǎng)基上于28℃持續(xù)光照培養(yǎng)至第21天時(shí)，可觀察到該菌分生孢子器的產(chǎn)生，分生孢子器近球形或不規(guī)則形，分生孢子呈橢圓形或卵形，初期無隔膜，具縱紋，無色或透明，成熟后在近中部出現(xiàn)隔膜，整個(gè)孢子呈褐色，胞壁加厚(圖1-F)。

圖1 蓮藕貯藏期間果實(shí)發(fā)病癥狀、分離菌株菌落形態(tài)和孢子形態(tài)Fig.1 Diseases symptom on water bamboo shoot and morphology characteristics of colonies and spores of isolated strains

2.2 腐敗菌系統(tǒng)發(fā)育樹的分析

采用真菌通用引物，對(duì)分離得到的病原菌DNA進(jìn)擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為 528 bp 的特異片段(圖 2-A)，對(duì)該 DNA 序列進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在 NCBI 上進(jìn)行比對(duì)，選取同源性較高的序列，構(gòu)建 LO-1 的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖 2-B所示。LO-1 的序列與可可毛色二孢菌Lasiodiplodiatheobromae(登錄號(hào)：MK166047.1)的同源性較高，可達(dá)到 99.81%，兩者親緣關(guān)系最近的，在進(jìn)化樹上聚為一類。將測(cè)序所得序列與其聚在同一分支上的物種序列對(duì)比結(jié)果如圖3所示，LO-1只有1個(gè)堿基與其親緣關(guān)系較近的物種的堿基序列不同。

注：M：分子量標(biāo)記。Note：M: Marker.圖2 蓮藕采后分離病原菌 rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果及基于ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Electrophoresis results on PCR products of rDNA-ITS from isolated strains and phylogenetic treeconstruted based on ITS gene sequence

圖3 ITS基因序列比對(duì)圖Fig.3 ITS gene sequence alignment map

2.3 蓮藕致腐真菌生物學(xué)特性分析

2.3.1 培養(yǎng)溫度和pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖 4-A可知，在培養(yǎng)基的pH值范圍為4～10 時(shí)，菌株均能生長(zhǎng)，其中pH值范圍為 4～6 時(shí)，菌絲擴(kuò)展直徑較大；pH值為5時(shí)，菌絲擴(kuò)展直徑最大；pH值范圍為 8～10時(shí)菌絲擴(kuò)展直徑較小，所以該菌在 pH值>10 時(shí)無法生長(zhǎng)。最適生長(zhǎng) pH 值為 5(P<0.05)。培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響如圖4-B所示，該菌在10～35℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最適宜的培養(yǎng)溫度為25℃，此溫度下培養(yǎng)2 d菌落直徑可達(dá)到80.01 mm，顯著高于其他處理(P<0.05)，在低于5℃或達(dá)到35℃以上菌絲不能生長(zhǎng)，故該菌最適生長(zhǎng)溫度為25℃。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate signifcant differences at 0.05 level. The same as following.圖4 不同pH值(A)、溫度(B)對(duì)菌株 LO-1生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of different pH value(A) and temperatures(B)on the growth of strain LO-1

2.3.2 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖5-A可知，該菌以蔗糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)較好，培養(yǎng)2 d菌落直徑可達(dá)76.75 mm，且菌絲生長(zhǎng)迅速，長(zhǎng)勢(shì)較好，相對(duì)其他碳源處理有顯著性差異(P<0.05)，其次為可溶性淀粉。由圖5-B可知，該菌以酵母浸出粉、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨為氮源時(shí)生長(zhǎng)較好，四者間無顯著差異(P>0.05)，這4個(gè)處理的菌落直徑顯著高于其他氮源處理組(P<0.05)，其中以酵母浸出粉為氮源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最為茂盛，菌絲直立，觸及培養(yǎng)皿蓋，表明酵母浸出粉最有利于該菌生長(zhǎng)。

圖5 不同碳源(A)、氮源(B)對(duì)菌株 LO-1 生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of different carbon sources(A) and nitrogen sources (B)on the growth of strain LO-1

2.3.3 致死溫度測(cè)定 該菌經(jīng)過40～70℃水浴處理10 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖6)菌株LO-1在40～50℃處理后在PDA上能繼續(xù)生長(zhǎng)，但隨著溫度的升高，菌絲的擴(kuò)展直徑越來越小，菌絲分布也越來越稀薄，而55℃及以上溫度的各處理組，在培養(yǎng)7 d后仍未有菌絲長(zhǎng)出，將該平板放于適宜該菌生長(zhǎng)的條件下25℃培養(yǎng)7 d，仍未觀察到菌絲體的生長(zhǎng)，說明該菌致死溫度為55℃(處理10 min)。

圖6 不同致死溫度對(duì)菌株LO-1生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of different lethal temperatures on the growth of strain LO-1

圖7 光照條件(A)和培養(yǎng)基(B)對(duì)菌株LO-1生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of light conditions(A) and different media(B) on the growth of strain LO-1

2.3.4 不同培養(yǎng)基及光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 在不同光照條件下培養(yǎng)2 d后對(duì)菌落直徑進(jìn)行測(cè)定，由圖7-A可知，光照條件對(duì)LO-1菌絲生長(zhǎng)的影響有顯著性差異，其中連續(xù)光照條件更有利于菌絲的延伸，黑暗條件下菌絲擴(kuò)展直徑最小。培養(yǎng)至20 d時(shí)，12 h光暗交替及完全黑暗條件下均不產(chǎn)孢，而在連續(xù)光照條件下，培養(yǎng)至14 d便可觀察到孢子，說明持續(xù)光照有利于LO-1菌絲的生長(zhǎng)，且能促進(jìn)其產(chǎn)孢。不同培養(yǎng)基對(duì)LO-1生長(zhǎng)的影響有顯著性差異(P<0.05)，在蓮藕汁-葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，培養(yǎng)2 d后菌落直徑達(dá)到51.95 mm，菌落生長(zhǎng)平整、圓形，呈輻射狀，菌絲生長(zhǎng)旺盛；其次是PDA培養(yǎng)基，該病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后菌落直徑達(dá)43.84 mm。

3 討論

可可毛色二孢菌廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，目前已知寄主達(dá)500種之多[21]，可引起果腐病、根腐病、枝枯病、褐腐病等，目前已報(bào)道的有龍眼焦腐病[22]、花生莖腐病[23]、藍(lán)莓枝枯病[24]、肉桂枝枯病[25]、橡膠樹回枯病[26]、高良姜葉枯病[27]等，同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)可可毛色二孢菌是引起甘薯[28]和芋艿[29]等根莖類蔬菜腐敗的主要病原菌，但目前國(guó)內(nèi)尚鮮見可可毛色二孢菌侵染引起蓮藕采后腐敗病的相關(guān)報(bào)道。

本研究通過對(duì)LO-1的生物學(xué)特性初步探究發(fā)現(xiàn)，該菌在10～35℃條件下均可生長(zhǎng)，其中25℃最適合病原菌LO-1的生長(zhǎng)，該菌的最適生長(zhǎng)溫度與蓮藕采摘季節(jié)的溫度相近，這一研究結(jié)果與陳佳華[30]的報(bào)道相近，且在實(shí)際生產(chǎn)中具有一定的應(yīng)用價(jià)值，一方面在蓮藕采摘時(shí)應(yīng)盡量選擇氣溫較低的清晨或傍晚，可以有效鈍化病原菌的活性；另一方面采摘后的蓮藕應(yīng)放置于低溫條件下進(jìn)行貯藏，以此延長(zhǎng)其保鮮期。菌株LO-1在pH值4～10條件下均可生長(zhǎng)，最適pH值為5，更適宜在偏酸性環(huán)境下生長(zhǎng)。而蓮藕多生長(zhǎng)于偏酸性粘質(zhì)土中，與該菌適宜生長(zhǎng)的條件一致，這可能也是導(dǎo)致蓮藕易感染該菌的原因。在采后保鮮中可以考慮噴淋偏堿性保鮮劑來抑制蓮藕表面病原菌的生長(zhǎng)，以此延長(zhǎng)保鮮時(shí)間。LO-1病原菌可以利用蔗糖、葡萄糖等多種碳源，其中利用葡萄糖、乳糖、甘露糖的能力無顯著差異，對(duì)蔗糖的利用率最高，這與廖旺嬌等[31]在桉樹枝枯病上分離出來的LO-1菌的試驗(yàn)結(jié)果一致；本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病原菌也可利用多種有機(jī)碳源和無機(jī)碳源，其中對(duì)酵母浸出粉的利用率最佳，這與董章勇等[32]報(bào)道的沙田柚果腐病可可毛色二孢無法利用尿素的結(jié)果不同，這可能是由于不同地區(qū)、不同物種所分離到的菌株的生物學(xué)特性、抗逆性、致病性以及菌落形態(tài)等方面均存在差異。在對(duì)LO-1菌絲體致死溫度的研究中發(fā)現(xiàn)，該菌致死溫度為55℃處理10 min，這與戴利銘等[33]的研究結(jié)果相似。以上研究結(jié)果說明LO-1具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，可以利用多種碳源和氮源，且有較為廣泛的酸堿適應(yīng)能力，因此無法簡(jiǎn)單地通過改變外部環(huán)境條件來達(dá)到殺死病原菌的目的。今后的研究中應(yīng)考慮選擇環(huán)保型保鮮劑對(duì)蓮藕進(jìn)行保鮮。在研究不同培養(yǎng)基對(duì)該菌菌絲生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在蓮藕汁-葡萄糖培養(yǎng)基上菌絲擴(kuò)展直徑最大，說明蓮藕為該菌菌絲的生長(zhǎng)提供了較為適宜的條件，也是蓮藕易感染該菌的原因之一。本研究還發(fā)現(xiàn)光照條件對(duì)LO-1菌絲的生長(zhǎng)有顯著影響，光照可促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)，且可以促進(jìn)孢子的產(chǎn)生，說明蓮藕采后避光保存可在一定程度上延緩其腐敗進(jìn)程。而胡文軍等[26]研究發(fā)現(xiàn)光照條件對(duì)LO-1菌絲生長(zhǎng)的影響不顯著，這可能是由于病原菌因寄主不同而導(dǎo)致的差異，具體情況還有待進(jìn)一步研究。可可毛色二孢菌的產(chǎn)孢條件較為苛刻，在PDA培養(yǎng)基、不同碳氮源培養(yǎng)基以及不同pH值培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)30 d均未觀察到孢子的產(chǎn)生，在燕麥培養(yǎng)基中連續(xù)光照培養(yǎng)，第14天方可觀察到少量孢子的產(chǎn)生，其具體產(chǎn)孢條件還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究采用組織分離法對(duì)常溫下自然腐爛的蓮藕進(jìn)行病原菌的分離純化，得到LO-1、LO-2、LO-3 3種致腐真菌。根據(jù)科赫氏法則，確定蓮藕采后的主要致腐菌為L(zhǎng)O-1，對(duì)該病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，確定該菌為可可毛色二孢菌。通過對(duì)其生物學(xué)特性的研究發(fā)現(xiàn)，該菌最適生長(zhǎng)溫度為25℃，在酸性條件下能較好地生長(zhǎng)，在pH值為5時(shí)生長(zhǎng)最好，菌絲致死溫度為55℃(10 min)，可利用多種碳氮源，其中最佳碳源為蔗糖，最佳氮源是酵母浸出粉。在多種培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)，其中在蓮藕汁-葡萄糖培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最茂盛。光照條件對(duì)該菌菌絲的生長(zhǎng)有一定的影響，連續(xù)光照可促進(jìn)其生長(zhǎng)，該菌產(chǎn)孢條件較為苛刻，只有在燕麥培養(yǎng)基且持續(xù)光照的條件下才有少量孢子產(chǎn)生。