陳藝荃 方能炎 葉秀仙 羅遠(yuǎn)華 鐘淮欽 黃敏玲,* 樊榮輝,*

(1 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福建 福州 350013)

花香揮發(fā)物能吸引昆蟲進(jìn)行授粉繁殖，有利于防御病原體、寄生蟲和食草動(dòng)物的侵害[1-2]，其主要由花器官在特定花發(fā)育時(shí)期釋放產(chǎn)生[3]。迄今已有來自100種植物的大約1 700種花香揮發(fā)物被鑒定[2]。

花香揮發(fā)物主要由萜類化合物、苯丙酸類/苯類和脂肪酸衍生物這三類化合物組成[2-3]。萜類化合物是第一大類花香揮發(fā)物，主要由單萜(C10)，倍半萜(C15)和二萜(C20)組成[4-5]。揮發(fā)性萜類化合物由兩種常見的異戊二烯前體合成，即異戊烯焦磷酸酯(isopentenyl diphosphate, IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸酯(dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP)。在細(xì)胞溶質(zhì)中，IPP和DMAPP由甲羥戊酸(mevalonic acid, MVA)途徑的乙酰輔酶A生成，并在法呢基二磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase, FPPS)的催化下形成法呢基二磷酸(farnesyl diphosphate, FPP)。然后，細(xì)胞溶質(zhì)/線粒體中的萜類合酶(terpene synthase, TPSs)將FPP轉(zhuǎn)化為倍半萜[6-7]。在質(zhì)體中，IPP和DMAPP由甲基赤蘚醇磷酸(mevalonate pathway, MEP)途徑中的丙酮酸和甘油醛-3-磷酸合成，并通過香葉基焦磷酸合酶(geranyl pyrophosphate synthase, GPPS)轉(zhuǎn)化為香葉基焦磷酸(geranyl pyrophosphate, GPP)， 隨后，質(zhì)體中的TPS催化GPP轉(zhuǎn)化為各種單萜和二萜[8]。TPS基因家族被分為7個(gè)亞家族，分別為TPS-a～g[9-11]，目前，已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[12]、玫瑰(Rosehybrida)[13]、薰衣草(Lavandulaangustifolia)[14]、金魚草(Antirrhinummajus)[15]、煙草(Nicotianasuaveolens)[16]和依蘭(Canangaodorata)[17]等植物中獲得了TPS。

高等植物中萜類揮發(fā)物的釋放受到TPS基因表達(dá)模式的調(diào)控[6]。金魚草中，花香揮發(fā)物的釋放量隨TPS表達(dá)水平的升高而逐漸增加[16]；晚香玉中，揮發(fā)性萜類的晝夜釋放節(jié)律與TPS基因的表達(dá)密切相關(guān)[18]。TPS被認(rèn)為是萜類化合物形成的關(guān)鍵基因。

文心蘭(Oncidium)又名跳舞蘭，原產(chǎn)墨西哥、西印度群島、巴西等地，是蘭科中的一大屬，原種多達(dá) 750 種以上[19]。文心蘭中多數(shù)品種無香氣，而一些盆栽品種，如香水文心、夢香等香氣濃郁。目前對文心蘭花香的研究只集中在香水文心等花香成分的分析[20-22]，鮮見花香形成分子水平等更深入的解析。本研究以白夢香，黃夢香和香水文心為材料，探索香氣形成的分子機(jī)制，旨在為文心蘭花香分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉種質(zhì)資源圃種植的文心蘭。取香水文心(Onc.Sharry Baby)、白夢香(Onc.Twinkfe White Fantasy)、黃夢香(Onc.Twinkfe Yellow Fantasy)盛花期花朵用于轉(zhuǎn)錄組測序，取香水文心、白夢香、黃夢香花蕾前期、花蕾中期、盛花期花朵用于花香成分測定及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測。

表1 文心蘭3個(gè)品種花香等級及描述Table 1 Aroma level of floral scents from three varieties of Oncidium orchid

1.2 頂空-固相微萃取和氣相色譜分析

使用頂空-固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)方法收集揮發(fā)性化合物。稱取1 g花朵樣品密封于20 mL提取瓶中并在50℃條件下平衡10 min。使用SPME纖維[聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，直徑65 μm]提取揮發(fā)性化合物并吸附30 min。然后，使用Shimadzu GCMS-TQ8040系統(tǒng)(日本島津)對捕獲的花香化合物進(jìn)行氣相色譜分析(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)。使用Rxi-5Sil MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)分離揮發(fā)性化合物，以氦氣作為載氣，流速為1 mL·min-1。柱操作條件如下：初始50℃保持2 min，再以4℃·min-1的速率升至170℃，然后以20℃·min-1的速率升至270℃，最后保持2 min。選用α-Terpinene為標(biāo)準(zhǔn)品，采用內(nèi)標(biāo)法。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.3 RNA提取、文庫構(gòu)建和RNA-Seq

收集盛花期的整朵花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，每個(gè)樣品3次重復(fù)。使用通用RNA提取試劑盒(Bioteke Corporation，大連)提取總RNA，應(yīng)用NanoDrop 2000 UV-vis分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國)和Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies，美國)進(jìn)行RNA質(zhì)量和濃度測定。文庫由北京百邁克生物科技有限公司使用mRNA-Seq樣品制備試劑盒(Illumina，美國)構(gòu)建。最后，使用Illumina HiSeq TM 4000平臺對文庫進(jìn)行測序。

1.4 組裝和功能注釋

收集四組樣品的原始數(shù)據(jù)(raw reads)，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)(reads)。應(yīng)用Trinity軟件通過重疊區(qū)域?qū)⒏哔|(zhì)量過濾后數(shù)據(jù)(clean reads)延伸為更長的重疊群(contigs)，通過對端連接進(jìn)一步組裝成轉(zhuǎn)錄本(transcripts)，然后聚類成單基因(unigenes)[23]。通過序列相似性，將所有組裝的unigenes與公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，E值閾值為10-5。七大數(shù)據(jù)庫包括Nr (NCBI non-redundant protein), Nt (non-redundant nucleotide databases), GO(gene Ontology), KOG (eukaryotic orthologs groups), KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes), Pfam(protein family), Swiss-Prot(Swiss-Prot protein database)。

1.5 表達(dá)注釋

使用Bowtie2軟件將修剪后的reads對齊到組裝的轉(zhuǎn)錄組[24]。應(yīng)用RSEM(RNA-Seq by expectation maximization)評估每個(gè)基因的豐度。應(yīng)用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片(fragments per kilobase of exon model per million mapped reads,FPKM)計(jì)算每個(gè)基因的數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)(read counts)[25]。應(yīng)用DESeq軟件鑒定文庫中的差異基因[26]。絕對錯(cuò)誤率(Error rate)<0.01和倍數(shù)變化值(Fold change)≥2作為閾值以確認(rèn)表達(dá)水平的顯著差異。

1.6 進(jìn)化樹構(gòu)建

在NCBI里查找其他物種的TPS核苷酸序列，利用MEGA軟件對TPS進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，參照Trapp等[27]和Fan等[28]的方法，對TPS家族進(jìn)行分類。

1.7 qRT-PCR分析

使用熒光染料SYBR Green(TaKaRa, 大連)在ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)上進(jìn)行qRT-PCR分析。應(yīng)用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。Actin作為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)條件及體系按TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(TaKaRa, 大連)試劑盒方法，每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對表達(dá)量。

表2 qRT-PCR所用引物序列Table 2 Primer sequences of qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 主要花香揮發(fā)物鑒定

GC-MS檢測結(jié)果表明，香水文心、黃夢香和白夢香3個(gè)品種中，萜類揮發(fā)物及其衍生物是主要花香揮發(fā)物(表3)。3個(gè)品種花香揮發(fā)物總相對含量均隨花的發(fā)育逐漸上升，到盛花期含量最高(圖1)。白夢香、黃夢香和香水文心3個(gè)品種的主要花香揮發(fā)物存在差異，白夢香的主要成分為芳樟醇(15.76 μg·h-1)和反式橙花醇(11.50 μg·h-1)，均在盛花期含量最高(圖2、表3)；黃夢香的主要成分為芳樟醇(27.13 μg·h-1)、 (E)-2-甲基巴豆酸異戊酯(27.08 μg·h-1)和反式橙花醇(23.49 μg·h-1)；香水文心的主要成分為β-羅勒烯(31.84 μg·h-1)和1,8-桉葉素(16.34 μg·h-1)，含量均隨花的發(fā)育上升，盛花期含量最高(圖2)。

注：不同小寫字母表示花香釋放量顯著差異(P<0.05)。Note: Statistical significance of the difference in the amount of floral scent released is indicated by different lowercase letters (P<0.05). The same as following.圖1 不同品種文心蘭不同花發(fā)育時(shí)期花香揮發(fā)物總相對含量Fig.1 Total floral volatile relative contents during different flower development stages in different varieties of Oncidium orchid

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

從9個(gè)文庫中共組裝獲得459 756個(gè)unigenes，平均長度為475 bp(表4)。在這459 756個(gè)unigenes中，186 711個(gè)被七大公共數(shù)據(jù)庫注釋，占總數(shù)的40.61%。為了鑒定unigenes分屬的代謝途徑，進(jìn)行KEGG注釋，結(jié)果顯示有42 157(9.17%)個(gè)unigenes分屬于123個(gè)KEGG途徑。圖3標(biāo)注的是差異基因最多的代謝途徑，包括初級代謝和次級代謝。3個(gè)品種中共發(fā)現(xiàn)34 313個(gè)差異基因，白夢香和黃夢香的差異基因較少，共5 431個(gè)，與香水文心的差異基因較多，分別有17 098和24 312個(gè)(表5)。

2.3 MVA和MEP途徑關(guān)鍵基因分析

文心蘭的轉(zhuǎn)錄組中共鑒定出14個(gè)MEP途徑基因，包括3個(gè)OnDXS、1個(gè)OnDXR、3個(gè)OnMCT、2個(gè)OnCMK、1個(gè)OnMDS、1個(gè)OnHDS、1個(gè)OnHDR和2個(gè)OnGPPS，這14個(gè)基因中，多數(shù)基因在黃夢香中的表達(dá)最高，在香水文心中的表達(dá)略低，在白夢香中的表達(dá)最低(圖4-A)。

共鑒定出的8個(gè)MVA途徑基因中，包括1個(gè)OnAACT、1個(gè)OnHMGS、1個(gè)OnHMGR、1個(gè)OnMK、1個(gè)OnPMK，1個(gè)OnMDC和2個(gè)OnFPPS，這8個(gè)基因中，多數(shù)基因在黃夢香中的表達(dá)最高，在香水文心中的表達(dá)略低，在白夢香中的表達(dá)最低(圖4-B)。

2.4 萜類關(guān)鍵基因分析

本研究從轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得5個(gè)顯著差異的TPS基因，聚類分析表明，OnTPS1(DN124402_c1_g1)、OnTPS3(DN124003_c0_g3)和OnTPS4(DN99721_c2_g1)聚為TPS-b亞家族，主要由單萜合成酶(mono-TPSs)組成，OnTPS2(DN136754_c1_g1)和OnTPS5(DN126828_c0_g1)是TPS-f亞家族的成員(圖5)。OnTPS4在3個(gè)品種中均高表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果顯示，隨著花的發(fā)育，3個(gè)品種的OnTPS4表達(dá)量均上升，且在盛花期達(dá)到最高，說明OnTPS4在3個(gè)品種中對香

圖2 文心蘭3個(gè)品種主要花香揮發(fā)物相對含量Fig.2 Relative contents of main floral volatiles in three varieties of Oncidium

表3 不同文心蘭品種盛花期主要花香成分Table 3 Main floral components of different varieties during blooming period in Oncidium orchid

表3(續(xù))

注：A: 細(xì)胞過程; B: 環(huán)境信息處理; C: 遺傳信息處理; D: 代謝; E: 有機(jī)系統(tǒng)。Note: A: Cellular processes. B: Environmental information processing. C: Genetic information processing. D: Metabolism. E: Organismal systems.圖3 香水文心、黃夢香和白夢香的KEGG注釋Fig.3 KEGG pathway in Onc. Sharry Baby、Onc. Twinkfe Yellow Fantasy and Onc. Twinkfe White Fantasy

注：A:甲基赤蘚醇磷酸途徑；B: 甲羥戊酸途徑。Note: A: 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway. B: Mevalonate(MVA) pathway.圖4 單萜和倍半萜合成相關(guān)基因表達(dá)譜Fig.4 Expression profiles of the genes involved in the monoterpene and sesquiterpene biosynthesis

注：AaLIS: 黃蒿芳樟醇合酶(AAF13356); CrGES: 長春花香葉醇合酶(AFD64744); AaADS: 黃蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶(AFA34434); AmMS: 金魚草月桂烯合酶(AAO41727); AtCPS1: 擬南芥柯巴基焦磷酸合(NP_192187); CmCPS: 筍瓜柯巴基焦磷酸合酶(AAD04292); AgPS: 大冷杉蒎烯合酶(AAB71085); AgMS: 大冷杉月桂烯合酶(AAB71084); AgLS: 大冷杉檸檬烯合酶 (AAB70907); CbLIS: 仙女扇芳樟醇合酶(AAC49395); AtGA2: 擬南芥貝殼杉烯合酶(AAC39443)。Note: AaLIS: Artemisia annua linalool synthase (AAF13356). CrGES: Catharanthus roseus geraniol synthase (AFD64744). AaADS: Artemisia annua amorpha-4,11-dienesynthase (AFA34434). AmMS: Antirrhium majus myrcene synthase (AAO41727). AtCPS1: Arabidopsis thaliana copalyl diphosphate synthase (NP_192187). CmCPS: Cucurbita maxima copalyl diphosphate synthase (AAD04292). AgPS: Abies grandis pinene synthase (AAB71085). AgMS: Abies grandis myrcene synthase (AAB71084). AgLS: Abies grandis 4S-limonene synthase (AAB70907). CbLIS: Clarkia breweri S-linalool synthase (AAC49395). AtGA2: Arabidopsis thaliana ent-kaurene synthase (AAC39443).圖5 文心蘭TPS進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic analysis of the TPS in Oncidium orchid

注：P1: 花蕾初期; P2: 花蕾中期; P3: 盛花期；F: TPS基因在3個(gè)文心蘭品種盛花期的FPKM值；a: 香水文心; b:黃夢香; c:白夢香。Note: P1: Early bud period. P2: Mid bud period. P3: Blooming period. F: FPKM value of TPS gene in blooming period of three Oncidium cultivars. a: Onc. Sharry Baby. b: Onc. Twinkfe Yellow Fantasy. c: Onc. Twinkfe White Fantasy.圖6 萜類合成酶基因表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of terpene synthase genes

表4 轉(zhuǎn)錄組測序和組裝數(shù)據(jù)Table 4 Summary of sequencing and assembly data

表5 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因Table 5 Differentially expressed genes of transcriptome sequencing

氣的形成起重要作用。OnTPS1、OnTPS2和OnTPS5在香水文心中表達(dá)顯著高于黃夢香和白夢香，qRT-PCR結(jié)果顯示，隨著花的發(fā)育，這3個(gè)基因在香水文心中均逐漸升高，在黃夢香和白夢香中隨花的發(fā)育表達(dá)量均未上升，說明這3個(gè)基因在香水文心花香揮發(fā)物的形成中起重要作用。OnTPS3在黃夢香中表達(dá)量最高，香水文心次之，白夢香最低(圖6)。

3 討論

花香作為觀賞植物品質(zhì)的重要特征，其評價(jià)也是植物學(xué)研究的熱點(diǎn)?；ㄏ愕慕M成和釋放模式已在許多植物中研究和明確，但其生物合成與調(diào)控機(jī)制尚未被揭示。本研究以香水文心、黃夢香和白夢香為材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序探索花香形成的分子機(jī)制，共獲得459 756個(gè)unigenes，40.61%的unigenes被公共數(shù)據(jù)庫注釋，這些信息為挖掘文心蘭花香關(guān)鍵基因和功能提供了重要資源。

花香主要由萜類化合物和苯類/苯丙酸類化合物組成，該類物質(zhì)由低分子量揮發(fā)性的復(fù)雜混合物組成。張瑩等[21-22]對香水文心、蜜糖和飛鳥花香成分的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)萜類為主要揮發(fā)物，但酯類含量很少。單萜類化合物在多種植物中為花香的主要成分，如小蒼蘭(Freesiahybrida)[29]、百合(Lilium)[30]、姜花(Hedychiumcoronarium)[31]等。本研究GC-MS結(jié)果表明，香水文心和夢香系列的花香揮發(fā)物均以單萜為主，但種類差異較大，這與前人研究結(jié)果基本一致。本研究中，黃夢香酯類含量最高，達(dá)53 μg·h-1。與揮發(fā)物種類相近的白夢香相比，黃夢香香氣更加濃郁，這可能與其主要香氣成分的嗅覺閾值偏低及香氣成分總含量高有關(guān)，酯類含量高可能是香氣更濃郁的另一因素。夢香系列與香水文心的花香成分差異較大，可能是不同萜類合成酶基因表達(dá)差異的結(jié)果。

MEP和MVA途徑分別為單萜和倍半萜的上游途徑[32-33]。在百合中，MEP途徑中的多數(shù)基因在有香氣的Siberia中表達(dá)量顯著高于無香氣的Novano[32]。本研究中，MEP和MVA途徑中的多數(shù)基因在黃夢香中的表達(dá)最高，在香水文心中表達(dá)比黃夢香中略低，在白夢香中表達(dá)最低，花香揮發(fā)物總量在黃夢香中最高，白夢香中最低，這兩者是相吻合的，說明黃夢香在MEP途徑的激活水平高于香水文心和白夢香。TPSs通過一步反應(yīng)將GPP或FPP轉(zhuǎn)化為各種萜類化合物，植物中含有多樣的TPS。TPS通常被分為7個(gè)進(jìn)化枝，而在一些植物中TPS僅有2個(gè)或3個(gè)進(jìn)化枝，揭示了特定基因類型的擴(kuò)增[34]。文心蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)顯著差異表達(dá)的TPS，3個(gè)屬于TPS-b， 主要由單萜合成酶(mono-TPSs)組成，2個(gè)屬于TPS-f。前人研究結(jié)果表明，萜類合成酶(TPS)的高表達(dá)是花香揮發(fā)物釋放量高的主要原因[34-35]。在花發(fā)育的過程中，金魚草揮發(fā)性萜類的釋放(如β-羅勒烯和月桂烯)與TPS基因的表達(dá)密切相關(guān)[15]。OnTPS4 在3個(gè)品種中均高表達(dá)，表明該基因在3個(gè)品種單萜合成中起關(guān)鍵作用；芳樟醇在3個(gè)品種中含量均較高，且均隨著花的發(fā)育含量上升，OnTPS4的表達(dá)與芳樟醇的釋放規(guī)律接近。OnTPS1在香水文心中表達(dá)偏高，在黃夢香和白夢香中低表達(dá)，并隨著花的發(fā)育表達(dá)量上升，說明OnTPS1是香水文心單萜揮發(fā)物形成的重要基因；β-羅勒烯和1,8-桉葉素在香水文心中含量高，在黃夢香和白夢香中含量很低，且釋放規(guī)律與OnTPS1的表達(dá)接近，推測OnTPS1可能是β-羅勒烯合成酶或1，8-桉葉素合成酶。OnTPS3在在黃夢香中表達(dá)偏高，說明OnTPS3是香水文心單萜揮發(fā)物形成的重要基因。OnTPS2和OnTPS5 在香水文心中表達(dá)偏高，對香水文心萜類揮發(fā)物的形成起到重要作用，但確定上述2個(gè)基因的具體類型和分布，仍需要進(jìn)行亞細(xì)胞定位或體外酶活性測定。

4 結(jié)論

本研究確定了3種文心蘭的主要花香成分為萜類化合物，并從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共獲得459 756個(gè)單基因(unigenes)，從上述單基因中篩選出5個(gè)顯著差異表達(dá)的TPS基因(OnTPS1～5)，驗(yàn)證了上述5個(gè)基因均對文心蘭花香揮發(fā)物的釋放起重要作用。在此基礎(chǔ)上，后續(xù)研究可對5個(gè)TPS基因進(jìn)行酶活性測定，以確定具體基因類型，并通過遺傳轉(zhuǎn)化，對無香文心蘭進(jìn)行改良。