賀凌霄 韓文龍 李 波 江智敏 徐 敏 李芳芳 鄭 聰 徐世曉,*

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2 浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，浙江 杭州 310008；3 中國煙草總公司河南省公司，河南 鄭州 450002；4 福建省煙草公司南平市煙草公司浦城分公司，福建 南平 353400)

二萜類化合物順-冷杉醇(cis-abienol)是部分煙草葉片腺毛分泌物中特有的萜類香氣前體物之一，是由NtCPS2基因編碼柯巴基焦磷酸合酶(8-hydroxy-copalyl diphosphate synthase, CPS2)后合成的[1]。順-冷杉醇與二萜類化合物赤霉素(gibberellins，GAs)、倍半萜脫落酸(abscisic acid，ABA)具有共同的前體物質(zhì)香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranyl-PP，GGPP)[2-5]，合成途徑見圖1[1，6-7]。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種課題組前期研究表明，8306編輯順-冷杉醇合成基因NtCPS2后，NtCPS2基因的相對表達(dá)量和順-冷杉醇的含量降低，同時(shí)赤霉素合成途徑中相關(guān)基因受到影響，進(jìn)而使赤霉素含量提高[8]。此外，有研究表明，在植物生長過程中ABA與GAs相互影響，含量發(fā)生變化從而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，如：種子的萌發(fā)與休眠[9]、植株地上部的生長[10-12]。楊衛(wèi)民等[6]發(fā)現(xiàn)用不同濃度的外源ABA和赤霉素(gibberellin 3，GA3)分別處理木棗果實(shí)，對丙二醛(malondialdehyde, MDA)、維生素C(vitamin C，Vit C)、過氧化氫酶(Proline)含量和CAT活性均產(chǎn)生相反的作用，表現(xiàn)為相互制約或互為拮抗的特征。宋平等[13]研究表明，GAS與ABA間具有拮抗效應(yīng)，且在不同秈稻半矮稈品種中的拮抗效應(yīng)強(qiáng)弱不同。還有研究表明，在GAS處理?xiàng)l件下，ABA對水稻地上部生長的抑制作用被解除[11]。

ABA對氣孔運(yùn)動有調(diào)控作用[14-16]，同時(shí)氣孔是直接影響植物葉片光合作用的植物表皮結(jié)構(gòu)[17-18]。在被子植物中，ABA與質(zhì)膜受體或胞內(nèi)受體結(jié)合，激活G蛋白，激活后的G蛋白活化磷脂酶，產(chǎn)生abi1-1、NAD(P)H依賴型ROS和abi2-1等因子參與Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]，通過依賴Ca2+的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，Ca2+可抑制K+內(nèi)流通道，激活K+外流通道和陰離子通道，從而促進(jìn)K+外流[20-22]，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉或抑制氣孔開放[23]。此外，ABA還可通過不依賴Ca2+的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即通過提高細(xì)胞質(zhì)pH值，激活K+外流通道和陰離子通道誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉[24-25]。氣孔開閉變化會引起氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，GS)的變化，進(jìn)而影響植物的蒸騰速率(transpiration rate，Tr)和凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)[26]。有研究表明，植物氣孔導(dǎo)度下降導(dǎo)致胞間CO2濃度(intercellular carbon dioxide，Ci)下降，光合作用隨之下降[27-28]。植物通過光合作用合成的有機(jī)物質(zhì)是植株進(jìn)行生長和發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)[29]，累積的光合產(chǎn)物越多，越利于植株生長。同時(shí)，光合作用影響著植物體的生理代謝過程，對經(jīng)濟(jì)作物品質(zhì)的形成有基礎(chǔ)性作用[30-33]。因此，在一定范圍內(nèi)提高煙葉光合速率，可以增加煙草有機(jī)物的合成速率，有利于煙葉同化物的積累，從而提升煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[34-35]。

目前，有關(guān)NtCPS2對二萜類代謝合成途徑的影響已有報(bào)道[1,4,8,36-38]，但NtCPS2基因與光合作用關(guān)系的研究鮮見報(bào)道。本研究以烤煙品種(系)8306、8306B、MSK326、豫煙11號和新豫煙11號為材料，分別比較8306B與8306、新豫煙11號與豫煙11號在光合參數(shù)及相關(guān)合成基因相對表達(dá)量和酶活性，氣孔開度，順-冷杉醇、GA3、ABA含量及相關(guān)合成基因相對表達(dá)量上的差異以及產(chǎn)量和品質(zhì)的差異，旨在明確NtCPS2基因?qū)夂献饔玫恼{(diào)控方式，以期為萜類化合物對植物光合作用的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制提供例證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年在河南省漯河市臨潁縣進(jìn)行，選擇土壤肥力中上等且均勻、地勢平坦、排灌方便、遠(yuǎn)離工業(yè)區(qū)、前茬一致的沙壤土作為試驗(yàn)地。供試烤煙(NicotianatabacumL.)品種(系)為自育高香氣烤煙品系8306、8306B[39](8306編輯NtCPS2基因的純合突變植株T3代)、MSK326、豫煙11號[40](MSK326×8306，YU11)、新豫煙11號(豫煙11號改良父本的新品系，MSK326×8306B，NYU11)，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種實(shí)驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)共5個處理，分別為8306、8306B、MSK326、YU11、NYU11。各處理種植面積為60.5 m2，田間行距為110 cm, 株距為55 cm，于2019年3月1日播種，同年5月1日移栽，其他栽培措施按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范操作。移栽后75 d時(shí)，每個品種(系)隨機(jī)挑選5株長勢一致的煙株取樣并測定指標(biāo)；烤后樣統(tǒng)一選取C3F等級[41]葉片，每個品種(系)重復(fù)3次。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉面分泌物順-冷杉醇的測定 煙草葉片中的順-冷杉醇提取參照陳偉等[42]的方法，通過NIST12檢索譜庫確定各類物質(zhì)成分，并使用內(nèi)標(biāo)法對物質(zhì)定量。

1.2.2 內(nèi)源激素分析測定 采集移栽75 d后的0.50 g新鮮煙草樣品，用液氮速凍后，存放于-80℃冰箱中保存，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法 (enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)進(jìn)行測定，酶免疫試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)化控中心提供。

1.2.3 光合參數(shù)測定 于上午8:00-11:30，用CIRAS-3便攜式光合儀(英國漢莎)測定光合相關(guān)參數(shù)，每品種(系)隨機(jī)選定5株測定完全展開的功能葉，數(shù)據(jù)穩(wěn)定后記錄，5次重復(fù)取平均值。

1.2.4 光合相關(guān)的酶活性測定 采集0.50 g新鮮煙草樣品，用液氮速凍后，存放于-80℃冰箱中保存，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行測定，酶免疫試劑盒由武漢普奈斯生物科技有限公司提供。

1.2.5 農(nóng)藝性狀調(diào)查 每個品種(系)選擇有代表性的5株，根據(jù)《YC/T 142-2010煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法》[43]進(jìn)行煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查，測定并記錄株高和節(jié)距。

1.2.6 干物質(zhì)積累 每個處理選擇5株長勢均勻一致的植株，分為根、莖、葉片，在105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重后測定干物質(zhì)量。

1.2.7 化學(xué)成分 根據(jù)《YC/T 159、160、162、217-2002煙草和煙草制品化學(xué)成分連續(xù)流動法》[44]測定煙葉總糖、煙堿、氯和鉀含量。

1.2.8 產(chǎn)量統(tǒng)計(jì) 根據(jù)《GB 2635-1992烤煙》[41]對烤后煙葉分級，統(tǒng)計(jì)各處理產(chǎn)量。

1.2.9 中性致香成分含量檢測 取20.00 g烤后煙樣(C3F)采用內(nèi)標(biāo)法[45]，內(nèi)標(biāo)為硝基苯，通過RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海普渡生化科技有限公司)和7200氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫，北京)(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)進(jìn)行檢測分析。利用NIST12檢索譜庫定性，并使用內(nèi)標(biāo)法對物質(zhì)進(jìn)行定量，并對測得的物質(zhì)按照姜慧娟等[46]的方法進(jìn)行分類。

1.2.10 煙草葉片總RNA的提取 采用AM9690 Plant RNA isolation Aid(塞默飛，上海)提取供試材料葉片總RNA，于-80℃冰箱中保存。利用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)R223-01(南京諾唯贊生物公司)將待測RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，儲存在-20℃冰箱中備用。

引物設(shè)計(jì)采用Roche LCPDS2軟件(表1)并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)利用ChamQ SYBR qPCR Master MixQ311-03試劑盒(南京諾唯贊生物公司)在LightCycler?480 II型熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系10 μL：2× ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL，10 μmol·L-1正、反向引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火和延伸 30 s，共40個循環(huán)。通過2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量并作圖。

表1 熒光定量引物序列Table 1 Sequences of fluorescence quantitative primers

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖，用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較, 用RStudio 1.2.5033軟件進(jìn)行相關(guān)性分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 編輯NtCPS2基因?qū)煵菥庉嬒岛碗s種F1代順-冷杉醇的影響

由圖2可知，8306B、NYU11的順-冷杉醇含量、NtCPS2基因相對表達(dá)量分別顯著低于8306、YU11。NYU11的順-冷杉醇含量、NtCPS2基因相對表達(dá)量與雙親MSK326和8306B相比差異均不顯著；YU11的順-冷杉醇含量、NtCPS2基因相對表達(dá)量均顯著高于MSK326，而順-冷杉醇含量與8306相比差異不顯著，NtCPS2基因相對表達(dá)量則顯著低于8306。

注：誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。不同小寫字母表示品種(系)間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: The error line represents the standard deviation. Different lowercase letters represent the significant difference among varieties (series)at 0.05 level. The same as following.圖2 不同品種(系)順-冷杉醇含量及合成基因表達(dá)量的比較Fig.2 The content and the synthetic gene expression in different varieties (series)

2.2 編輯NtCPS2基因?qū)煵菥庉嬒岛碗s種F1代內(nèi)源激素的影響

由圖3可知，8306B、NYU11的赤霉素含量分別顯著高于8306、YU11，脫落酸含量分別顯著低于8306、YU11。NYU11的赤霉素含量與雙親差異顯著，且含量順序?yàn)镸SK326>NYU11>8306B，YU11的赤霉素含量顯著低于MSK326，與8306差異不顯著(圖3-A)；NYU11的脫落酸含量與雙親差異顯著，表現(xiàn)為MSK326>NYU11>8306B，YU11的脫落酸含量顯著低于雙親(圖3-B)。說明NtCPS2基因編輯后赤霉素含量增加，脫落酸含量降低。

圖3 不同品種(系)內(nèi)源激素含量比較Fig.3 Endogenous hormones content of in different varieties (series)

由圖4-A、B可知，8306B的CPS基因相對表達(dá)量顯著高于8306，NYU11的CPS基因相對表達(dá)量與YU11差異不顯著，8306B、NYU11的GA20ox基因相對表達(dá)量分別顯著高于8306、YU11。NYU11、YU11的CPS、GA20ox基因相對表達(dá)量分別與MSK326差異不顯著。由上述結(jié)果可知，NtCPS2基因?qū)PS的表達(dá)影響顯著，其中GA20ox基因表達(dá)在雜交后代中遺傳效應(yīng)顯著。

圖4 不同品種(系)內(nèi)源激素基因相對表達(dá)量的比較Fig.4 Endogenous hormones gene relative expression of in different varieties (series)

由圖4-C～E可知，8306B、NYU11的GA2ox、PSY、NCED基因相對表達(dá)量分別顯著低于8306、YU11。NYU11的GA2ox基因相對表達(dá)量與雙親差異不顯著，YU11的GA2ox基因相對表達(dá)量顯著差異于雙親，8306>YU11>MSK326，NtCPS2基因編輯后赤霉素合成負(fù)調(diào)控基因GA2ox的相對表達(dá)量顯著降低(圖4-C)。NYU11的PSY基因相對表達(dá)量顯著差異于雙親，MSK326>NYU11>8306B，YU11的PSY基因相對表達(dá)量與雙親差異不顯著(圖4-D)。NYU11的NCED基因相對表達(dá)量顯著低于MSK326，與8306B差異不顯著，YU11的NCED基因相對表達(dá)量顯著低于8306，與MSK326差異不顯著(圖4-E)，NtCPS2基因編輯后脫落酸合成途徑中的正調(diào)控基因PSY、NCED的相對表達(dá)量顯著降低。

2.3 編輯NtCPS2基因?qū)煵菥庉嬒岛碗s種F1代氣孔開度的影響

由圖5可知，8306B、NYU11的氣孔閉合比率分別顯著低于8306、YU11。NYU11的氣孔閉合比率與雙親的差異顯著，MSK326>NYU11>8306B，YU11的氣孔閉合比率顯著低于雙親。表明NtCPS2基因編輯后降低了氣孔閉合比率且可在雜交后代中遺傳。

圖5 不同品種(系)氣孔閉合比率的比較Fig.5 Stomatal closure ratio of in different varieties (series)

2.4 編輯NtCPS2基因?qū)煵菥庉嬒岛碗s種F1代光合作用的影響

2.4.1 編輯NtCPS2基因?qū)煵菥庉嬒岛碗s種F1代光合參數(shù)的影響 由表2可知，8306B、NYU11的Pr、Ci、Gs、Tr、水汽壓虧缺(vapor pressure deficit，VPD)分別顯著高于8306、YU11，水分利用率(water use efficiency，WUE)分別顯著低于8306、YU11。YU11和NYU11的Pr、Ci、Tr在親本之間，未發(fā)生超親遺傳現(xiàn)象。

2.4.2 編輯NtCPS2基因?qū)煵菥庉嬒岛碗s種F1代光合相關(guān)酶活及基因相對表達(dá)量的影響 由圖6可知，8306B、NYU11的Rubisco、GAPDH活性分別顯著高于8306、YU11。YU11、NYU11的Rubisco活性均顯

表2 不同品種(系)F1代光合參數(shù)比較Table 2 Photosynthetic parameters of in different varieties (series)

著高于雙親(圖6-A)；NYU11的GAPDH活性顯著高于雙親，YU11的GAPDH活性與雙親差異顯著，MSK326>YU11>8306(圖6-B)。

由圖7可知，8306B、NYU11的Rubisco、GAPDH基因相對表達(dá)量分別顯著高于8306、YU11。NYU11的Rubisco、GAPDH基因相對表達(dá)量顯著高于MSK326，與8306B差異不顯著，YU11的Rubisco、GAPDH基因相對表達(dá)量與雙親MSK326和8306相比差異不顯著?？芍夂舷嚓P(guān)酶活性及基因相對表達(dá)量在編輯NtCPS2基因后顯著增加。

圖6 不同品種(系)光合相關(guān)酶活的比較Fig.6 Photosynthesis-related enzyme activities of in different varieties (series)

圖7 不同品種(系)光合相關(guān)基因相對表達(dá)量的比較Fig.7 Photosynthesis-related gene relative expression of in different varieties (series)

注：* 表示P<0.05 水平上顯著相關(guān)，** 表示P<0.01 水平上極顯著相關(guān)，***表示P<0.001 水平上極顯著相關(guān)。Note：* indicates significant correlation at 0.05 level, ** indicates extremely significant correlation at 0.01 level, and *** indicates extremely significant correlation at 0.001 level.圖8 NtCPS2基因與光合作用相關(guān)基因的相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between NtCPS2 gene and genes related to photosynthesis

2.5 萜類合成基因與光合作用相關(guān)基因的相關(guān)性分析

對8306編輯系和雜種F1代的萜類(順-冷杉醇、赤霉素、脫落酸)合成基因、氣孔閉合率與光合作用酶活相關(guān)基因進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖8。煙葉中CPS、光合作用相關(guān)基因Rubisco、GAPDH相對表達(dá)量均與NtCPS2相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性，其中煙葉中的CPS相對表達(dá)量與NtCPS2相對表達(dá)量在P<0.05 水平上呈顯著負(fù)相關(guān)，Rubisco、GAPDH相對表達(dá)量均與NtCPS2相對表達(dá)量在P<0.001水平上呈極顯著負(fù)相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)較大，分別為-0.776和-0.840；煙葉中CPS相對表達(dá)量與PSY相對表達(dá)量在P<0.01水平上呈極顯著負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為-0.651；煙葉的氣孔閉合率與PSY相對表達(dá)量在P<0.001水平上呈極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.891。表明NtCPS2基因相對表達(dá)量降低可能提高光合效率。

2.6 編輯NtCPS2基因?qū)煵菥庉嬒岛碗s種F1代農(nóng)藝性狀的影響

由表3可知，8306B、NYU11的株高、葉數(shù)、節(jié)距分別顯著高于8306、YU11，莖圍、最大葉長、最大葉寬、最大葉面積與8306、YU11相比差異不顯著。NYU11的株高、莖圍與雙親差異顯著，表現(xiàn)為MSK326>NYU11>8306B；YU11的株高顯著差異于雙親，表現(xiàn)為MSK326>YU11>8306。表明在農(nóng)藝性狀的各項(xiàng)指標(biāo)中NtCPS2基因?qū)χ旮吆凸?jié)距的影響最明顯。

2.7 編輯NtCPS2基因?qū)煵菥庉嬒岛碗s種F1代光合產(chǎn)物及品質(zhì)的影響

2.7.1 編輯NtCPS2基因?qū)煵菥庉嬒岛碗s種F1代干物質(zhì)積累的影響 由圖 9-A可知，8306B、NYU11的干物質(zhì)積累總量分別較8306、YU11高19.96%、9.20%。8306B、NYU11的葉干物質(zhì)積累量分別較8306、YU11高27.73%、11.94%；8306B、NYU11的根干物質(zhì)積累量均顯著大于8306、YU11；莖干物質(zhì)積

圖9 不同品種(系)干物質(zhì)積累與分配的比較Fig.9 Dry matter accumulation and allocation of in different varieties (series)

累量差異不顯著。由圖9-B可知，烤煙干物質(zhì)主要分配給煙葉，8306B、NYU11的干物質(zhì)量分配給葉、根的比例分別大于8306、YU11，8306B、NYU11的葉干物質(zhì)分配量分別較8306、YU11多4.46和1.54個百分點(diǎn)。由上述結(jié)果可知，煙株干物質(zhì)積累量在編輯NtCPS2基因后顯著增加，其中葉和莖干物質(zhì)分配率明顯增加。

2.7.2 編輯NtCPS2基因?qū)煵菥庉嬒岛碗s種F1代產(chǎn)量的影響 由圖10可知，8306B、NYU11的產(chǎn)量分別顯著高于8306、YU11。NYU11的產(chǎn)量顯著高于雙親，YU11的產(chǎn)量顯著高于8306，與MSK326差異不顯著。

2.7.3 編輯NtCPS2基因?qū)煵菥庉嬒岛碗s種F1代化學(xué)成分的影響 由表4可知，8306B的煙堿含量顯著低于8306，總糖含量、氯離子含量、鉀離子含量、糖堿比顯著高于8306；NYU11的煙堿含量、氯離子含量顯著低于YU11，總糖含量、鉀離子含量、糖堿比、鉀氯比顯著高于YU11。NYU11的煙堿含量、總糖含量、糖堿比與雙親差異顯著；YU11的總糖含量顯著低于雙親，煙堿含量顯著高于8306，糖堿比在雙親之間，氯離子含量顯著高于MSK326，鉀離子含量、鉀氯比顯著低于MSK326。NtCPS2基因的表達(dá)量影響煙草化學(xué)成分的含量，其中煙堿含量顯著降低，總糖含量、鉀離子含量顯著增加。

圖10 不同品種(系)產(chǎn)量的差異比較Fig.10 Yield of in different varieties (series)

表4 不同品種(系)化學(xué)成分的差異比較Table 4 Chemical composition of in different varieties (series)

2.7.4 編輯NtCPS2基因?qū)煵菥庉嬒岛碗s種F1代中性致香成分的影響 由表5可知，8306B、NYU11的芳香族氨基酸降解產(chǎn)物、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、類西柏烷降解產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、葉綠素降解產(chǎn)物含量分別顯著高于8306、YU11。NYU11、YU11的中性致香產(chǎn)物含量未發(fā)生超親遺傳現(xiàn)象，表明編輯NtCPS2基因增加了中性致香成分的含量。

表5 不同品種(系)中性致香成分的差異比較Table 5 Neutral aroma components of in different cultivars (strains) /(μg·g-1)

3 討論

圖11 NtCPS2基因?qū)煵莨夂献饔糜绊懙拇x網(wǎng)絡(luò)Fig.11 Metabolic network of the effect of NtCPS2 gene on photosynthesis in tobacco

順-冷杉醇與GAs均是二萜化合物，由GGPP作為前體物質(zhì)經(jīng)過萜烯合成酶(terpene synthases, TPSs)催化分別生成順-冷杉醇和內(nèi)-貝殼杉烯，內(nèi)-貝殼杉烯再經(jīng)細(xì)胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases, P450s)和2-酮戊二酸依賴的雙加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenases, 2ODDs)生成GAs[47-50]。編碼萜烯合成酶的基因NtCPS2被編輯后，順-冷杉醇含量降低的同時(shí)GAs含量顯著增加，推測順-冷杉醇含量的降低可能減少了對共同前體物質(zhì)GGPP的競爭[39]，導(dǎo)致GAs含量增加[8]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，編輯NtCPS2基因影響了GAs合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而提高了GAs含量，但編輯NtCPS2基因后與順-冷杉醇和GAs有共同前體物質(zhì)的ABA含量及相關(guān)基因表達(dá)量顯著降低，因此編輯NtCPS2基因?qū)BA含量的影響與GAs不同，ABA含量降低的原因可能是受到其與GAs的拮抗作用影響[51]。周玲等[52]研究發(fā)現(xiàn)外源施加不同濃度的 GA3 降低了瓜爾豆的 ABA含量，本研究結(jié)果與之相似。有研究進(jìn)一步表明，GAs誘導(dǎo)的Ca2+/鈣調(diào)素信號調(diào)節(jié)水解酶的合成和分泌，而ABA阻斷水解酶的表達(dá)[53]，這可能解釋了GAs和ABA之間的拮抗作用[54]。

本研究發(fā)現(xiàn)，編輯NtCPS2基因后的煙株ABA含量降低引起葉片氣孔閉合率下降、氣孔導(dǎo)度增加、植株光合作用增強(qiáng)，該結(jié)果與王清泉[55]的研究結(jié)果相近，即ABA含量與氣孔開度存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。Tal等[56]研究同樣表明，內(nèi)源ABA水平過低的植物突變體氣孔開度明顯增大。趙新宇等[57]研究發(fā)現(xiàn)將不同生育時(shí)期的離體大豆植株浸泡于含有ABA的營養(yǎng)液后葉片的氣孔均關(guān)閉，進(jìn)而對大豆葉片光合產(chǎn)生顯著的抑制作用，本研究結(jié)果與之相似，ABA含量降低間接導(dǎo)致光合作用速率增加，推測ABA含量降低導(dǎo)致的氣孔導(dǎo)度增大可以進(jìn)一步導(dǎo)致Ci增高，進(jìn)而使葉片凈光合速率升高[58]。同時(shí)，編輯NtCPS2基因后光合作用相關(guān)酶(Rubisco、GAPDH)的活性及基因相對表達(dá)量均增加。Rubisco[59]和GAPDH活性提高可以使煙草的光合效率和光合環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)效率增加、促進(jìn)光合作用增強(qiáng)[60]。

此外，對順-冷杉醇、GAs、ABA合成途徑中萜烯合成酶基因NtCPS2、CPS、PSY，氣孔閉合率和光合作用酶活相關(guān)基因Rubisco、GAPDH進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明NtCPS2基因相對表達(dá)量降低間接促進(jìn)煙株的光合作用、提高了煙株的光合效率。

綜上所述，NtCPS2對煙草光合特征的影響可能如圖11所示。編輯NtCPS2基因后，NtCPS2基因相對表達(dá)量降低，GGPP含量增加，GAs合成正調(diào)控基因相對表達(dá)量增加，負(fù)調(diào)控基因的相對表達(dá)量降低，導(dǎo)致GAs含量增加，推測由于GAs和ABA之間的拮抗作用，ABA含量降低，導(dǎo)致氣孔閉合率降低，從而由外界環(huán)境經(jīng)由氣孔擴(kuò)散到葉肉組織的CO2濃度(Ci)增高，進(jìn)而提高葉片的光合能力。

光合作用是作物產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，作物干物質(zhì)90%以上來源于光合作用[61]。本研究表明編輯NtCPS2基因后煙株光能利用效率的增加導(dǎo)致株高、干物質(zhì)積累和產(chǎn)量增加，與Dalal等[62]的研究結(jié)果相近。此外，8306B、NYU11的化學(xué)成分與8306、YU11有所不同，編輯NtCPS2后煙堿含量顯著降低、鉀離子含量明顯增加，可能是由于赤霉素含量的提高促使植物體內(nèi)IAA含量增加，間接抑制了煙堿合成酶的活性導(dǎo)致煙堿含量降低[63-64]，并且赤霉素含量的提高促進(jìn)了鉀離子的運(yùn)輸通道打開以及載體數(shù)量的增加[65]。同時(shí)，有研究表明鉀離子含量增高有利于提高煙葉的中性致香物質(zhì)含量[66]，與本研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)探究了JN6CPS2基因?qū)ο群献饔玫恼{(diào)控方式，為萜類化合物對植物光合作用反饋調(diào)節(jié)作用研究提供例證，發(fā)現(xiàn)降低NtCPS2基因相對表達(dá)量，可以增加純合突變植株的赤霉素含量，影響赤霉素合成途徑中CPS、GA20ox、GA2ox等基因的表達(dá)量，降低脫落酸含量及基因表達(dá)量和氣孔閉合率，從而提高光合酶活性及基因表達(dá)量、光合色素含量，改善植株的光合效率，提高葉片干物質(zhì)積累量和煙葉的品質(zhì)，而且對于以純合突變植株為親本的雜種F1代與以野生型植株為親本的豫煙11號有相似的變化趨勢。