蔣 彧 何俊蓉

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，四川 成都 610000)

蘭科是單子葉植物第一大科，包含了5個(gè)亞科801個(gè)屬，品種數(shù)量近3萬(wàn)種，約占所有種子植物種類的10%[1]。我國(guó)十大名花中的蘭花也稱國(guó)蘭，屬于蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)小花型地生種，在我國(guó)有悠久的栽培歷史，是世界上最早栽培的蘭花。蘭花是高產(chǎn)值的花卉，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)及出口貿(mào)易的發(fā)展，全球蘭花市場(chǎng)逐漸繁榮，因此對(duì)蘭花的育種工作也提出了更高的要求。

蘭花育種的常用手段包括選擇育種、雜交育種、倍性育種、體細(xì)胞無(wú)性系變異以及分子育種等。我國(guó)蘭花品質(zhì)相關(guān)的育種以選擇育種及雜交育種為主，但這兩種育種方式的育種周期長(zhǎng)、工作量大，近年來也開始采用如倍性育種、體細(xì)胞無(wú)性系變異等方法。隨著測(cè)序技術(shù)及基因編輯技術(shù)的發(fā)展，分子育種技術(shù)在水稻、玉米、棉花等農(nóng)作物中被廣泛使用，并取得了很好的育種效果[2]。蘭花分子育種起步較晚，蘭科植物如小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris)[3]、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)[4]、深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica)[5]、白花蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)[6]的基因組發(fā)布將有效促進(jìn)蘭花分子育種工作的開展。近年來，基于多組學(xué)數(shù)據(jù)的分析，蘭花重要性狀相關(guān)基因的挖掘取得了重要進(jìn)展。蘭花中受低溫抑制的CgSVP[分離自春蘭(cymbidumgoeringii)]參與了蘭花低溫開花調(diào)控，該調(diào)控機(jī)制與模式植物中的低溫響應(yīng)機(jī)制存在顯著差異[7]。蘭花中的MADS-box基因家族參與了國(guó)蘭特異性唇瓣分化和重瓣化的調(diào)控，通過表達(dá)區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)生花型的變異[8-9]。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，研究者也成功獲得了蘭科植物鐵皮石解C3H、C4H[10]以及蝴蝶蘭MADS8/36/44的突變株系[11]。上述研究表明分子育種技術(shù)在蘭花育種中能夠發(fā)揮重要作用。

葉藝是國(guó)蘭特有的一種體征，表現(xiàn)為葉片呈現(xiàn)金銀色的條紋或斑點(diǎn)，具有較高的觀賞價(jià)值，葉藝蘭的價(jià)格也在逐步提高，其消費(fèi)市場(chǎng)具有巨大潛力。目前市場(chǎng)上銷售的葉藝蘭品種大部分屬于野生的變異種(也稱為下山蘭，即直接從山上挖回的蘭花)，另有少部分來自于栽培品種芽變，但前者會(huì)對(duì)蘭花野生資源造成破壞，后者變異率較低。人工誘變技術(shù)較栽培品種芽變具有更高的變異率，對(duì)蘭花的育種工作起到了重要的推動(dòng)作用。葉藝突變體成因復(fù)雜，目前的研究認(rèn)為葉綠體發(fā)育缺陷和葉綠素過量降解是葉藝性狀產(chǎn)生的直接生理原因[12]。墨蘭葉片顏色在由紅變黃，最后轉(zhuǎn)化為綠色的過程中，有28種代謝物在葉片變綠后含量降低到近零水平，還有15種花色素苷類代謝物含量呈下降趨勢(shì)[13]。CsERF2則通過乙烯信號(hào)途徑參與調(diào)控墨蘭(Cymbidumsinense)葉色的變化[14]。但總的來說，導(dǎo)致國(guó)蘭葉藝表型背后的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

研究認(rèn)為，60Co-γ射線可有效地對(duì)植物進(jìn)行誘變產(chǎn)生突變體[15]，通過60Co-γ射線對(duì)隆昌素根狀莖進(jìn)行誘變后可獲得能產(chǎn)生葉藝苗的葉藝隆昌素。隆昌素與葉藝隆昌素根狀莖分別表現(xiàn)為綠色和黃色，具有非常明顯的差異，這兩種材料中的葉綠素與類胡蘿卜素含量有較大差別[2]。本研究采用RNA-Seq技術(shù)對(duì)這兩種根狀莖進(jìn)行分析，鑒定在隆昌素與葉藝隆昌素根狀莖中差異表達(dá)的基因，旨在為解析葉藝隆昌素葉藝成因的分子機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)材料來自四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所組培室。培養(yǎng)溫度為23℃(白天)/18℃(晚上)，光照周期為14 h(光照)/10 h(黑暗)，光照強(qiáng)度為2 000 lx。無(wú)菌條件下隨機(jī)選取葉藝隆昌素(YR)和隆昌素(GR)根狀莖各4瓶，分別從每個(gè)培養(yǎng)瓶中隨機(jī)挑選1～2 cm根狀莖各4條，置于液氮中冷凍后，-80℃超低溫冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)，北京天根生化科技有限公司；mRNA富集用的磁珠mRNA Capture BeadsRNA，南京諾唯贊生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，北京艾德萊生物科技有限公司；2×SYBR?Green Supermix實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，德國(guó)DBI?Bioscience。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國(guó))；qTOWER2.2實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(DBI?Bioscience，德國(guó))

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA提取 根據(jù)植物總RNA提取試劑盒說明書，從根狀莖組織樣品中提取總RNA，利用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.3.2 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 使用Oligo dT磁珠法從總RNA中分離出mRNA，用超聲波破碎法將mRNA隨機(jī)斷裂成200 bp左右的小片段。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第一鏈cDNA，在DNA聚合酶作用下進(jìn)一步合成第二鏈cDNA。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因篩選 將構(gòu)建好的cDNA送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司使用Illumina Hiseq2500進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序方式為雙末端法，測(cè)序長(zhǎng)度為150 bp。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控，截除測(cè)序接頭、引物序列，并對(duì)低質(zhì)量值數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，最終獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)(reads)。使用Trinity軟件[16]對(duì)高質(zhì)量Reads進(jìn)行denovo拼接獲得單基因(unigene)。采用RSEM軟件(V 1.2.4)中的FPKM(fragments per kilobase per million reads)方法對(duì)unigene表達(dá)量水平進(jìn)行計(jì)算，使用Bioconductor軟件包中的DESeq(V 1.14.0)進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析。差異表達(dá)基因(different expression genes, DEGs)篩選閾值為|log2 value|>1且FDR≤0.05。

1.3.4 unigene功能注釋及基因結(jié)構(gòu)分析 使用BlastX將unigene與NR、GO、KOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)基因的相似性進(jìn)行功能注釋，得到與給定unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該unigene的蛋白功能注釋信息。使用TransDecoder軟件(transdecoder.github.io/)對(duì)unigene的編碼區(qū)及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.5 差異表達(dá)基因富集分析 分別使用GOseq與KOBAS對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能顯著性及KEGG Pathway富集分析。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 提取根狀莖RNA，用Aidlab公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)進(jìn)行cDNA的合成。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出準(zhǔn)備驗(yàn)證的unigene,分別設(shè)計(jì)這些unigene的特異引物，采用qTOWER2.2實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR分析，所有反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL：5 μL 2×SYBR?Green Supermix，0.5 μL 200 nmol·L-1正向引物，0.5 μL 200 nmol·L-1反向引物，1 μL cDNA模板，3 μL ddH2O。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，60℃擴(kuò)增30 s，循環(huán)39次；溶解曲線分析，即隨后將溫度從60℃逐漸升至95℃(每次提高1℃，每提高1℃停留4 s)。ACTIN-7基因作為內(nèi)參，通過2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉藝隆昌素和隆昌素根狀莖形態(tài)

葉藝隆昌素根狀莖呈淡黃色，形狀較為粗短(圖1-A)；隆昌素根狀莖則呈深綠色，形狀為不規(guī)則長(zhǎng)條形(圖1-B)。經(jīng)過培養(yǎng)后，淡黃色的根狀莖分化出葉藝苗，綠色的則只分化成正常的綠色試管苗。

圖1 葉藝隆昌素根狀莖(A)和隆昌素根狀莖(B)觀察Fig.1 Observation of Yeyi Longchangsu (A) and Longchangsu (B) rhizome

表1 測(cè)序結(jié)果Table 1 Sequencing statistics

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝與分析

分別對(duì)葉藝隆昌素和隆昌素的根狀莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每個(gè)樣本分別進(jìn)行4次重復(fù)，8個(gè)文庫(kù)得到的原始數(shù)據(jù)(raw reads)條數(shù)介于13 193 936～20 145 078，質(zhì)控后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)(clean reads)條數(shù)介于10 686 612～16 676 096，clean reads占raw reads的比例為70.15%～84.12%，clean reads數(shù)據(jù)量大小為3.96～6.08 Gb(表1)。使用Trinity和TGICL軟件對(duì)clean reads進(jìn)行從頭組裝，共得到162 407條unigene(表2)。unigene的N50長(zhǎng)度和平均長(zhǎng)度分別為1 049和678 bp。unigene長(zhǎng)度分布結(jié)果顯示大于1 000 bp的unigene有26 107個(gè)(圖2)。

2.3 基因功能注釋及分類

基因功能注釋與分類為闡明細(xì)胞內(nèi)特定基因的分子功能和生物代謝途徑提供了有價(jià)值的信息。將162 407 條unigene與Nr、GO和KOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得unigene的注釋信息。結(jié)果顯示有26 473條unigene注釋到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)，有20 119條unigenes注釋到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)，有38 926條unigene注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)(圖3)，其中有14 380條unigene在3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均有注釋。在GO部分，注釋到細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過程的unigene數(shù)目分別為12 114、13 170、13 642 條。

表2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝及unigene預(yù)測(cè)Table 2 Statistics of transcriptome assembly and predicted unigenes

圖2 unigene長(zhǎng)度分布圖Fig.2 Length distribution of unigene

圖3 GO、Nr和KOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.3 GO, Nr and KOG database annotation results statistics

圖4 相關(guān)性熱圖(A)和差異表達(dá)基因火山圖(B)Fig.4 Correlation heat map (A) and volcano map of DEGs (B)

2.4 差異表達(dá)基因的鑒定及功能分類

在閾值為|log2 value|>1和FDR≤0.05情況下，鑒定出644個(gè)unigene在葉藝隆昌素和隆昌素根狀莖中差異表達(dá)，其中497個(gè)unigene的轉(zhuǎn)錄本在葉藝隆昌素中表達(dá)豐度較高，147個(gè)unigene的轉(zhuǎn)錄本在隆昌素中表達(dá)豐度較高(圖4)。

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO聚類，結(jié)果表明有42個(gè)類別顯著富集，其中屬于生物學(xué)過程的有20個(gè)，屬于細(xì)胞組分的有11個(gè)，屬于分子功能的有11個(gè)(圖5)。在生物學(xué)過程類別中，代謝過程富集度最高，節(jié)律過程富集度最低；在細(xì)胞組分類別中，細(xì)胞富集度最高，膜封閉腔富集度最低；在分子功能類別中，催化活性富集度最高，金屬伴侶活性富集度最低。

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG聚類，結(jié)果顯示有8個(gè)代謝過程被顯著富集(P<0.05)(表3)。這些過程涉及植物-病原物互作(P=0.000 26)、礦物質(zhì)吸收(P=0.001 34)、光形態(tài)建成(P=0.001 99)、倍半萜和三

注: 1: 生物調(diào)控; 2: 細(xì)胞成分組織或起源; 3: 細(xì)胞過程; 4: 發(fā)育過程; 5: 定位系統(tǒng)的建立; 6: 生長(zhǎng); 7: 免疫系統(tǒng)過程; 8: 定位; 9: 代謝過程; 10: 多機(jī)體過程; 11: 多細(xì)胞組織過程; 12: 生物過程負(fù)調(diào)控; 13: 生物過程正調(diào)控; 14: 生物過程調(diào)控; 15: 再生; 16: 再生過程; 17: 刺激應(yīng)答; 18: 節(jié)律過程; 19: 信號(hào); 20: 單一的生物過程; 21: 細(xì)胞; 22: 胞間連絲; 23: 細(xì)胞要素; 24: 細(xì)胞間區(qū)域; 25: 大分子復(fù)合物; 26: 膜; 27: 膜要素; 28: 膜結(jié)合腔體; 29: 細(xì)胞器; 30: 細(xì)胞器要素; 31: 共質(zhì)體; 32: 抗氧化劑活性; 33: 結(jié)合劑活性; 34: 催化劑活性; 35: 電荷載體活性; 36: 酶調(diào)控因子活性; 37: 金屬伴侶活性; 38: 分子感應(yīng)器活性; 39: 核苷酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性; 40: 蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性; 41: 結(jié)構(gòu)分子活性; 42: 轉(zhuǎn)運(yùn)因子活性。Note: 1: Biological regulation. 2: Cellular component organization or biogenesis. 3: Cellular process. 4: Developmental process. 5: Establishment of localization. 6: Growth. 7: Immune system process. 8: Localization. 9: Metabolic process. 10: Multi-organism process. 11: Multicellular organismal process. 12: Negative regulation of biological process. 13: Positive regulation of biological process. 14:Regulation of biological process. 15: Reproduction. 16: Reproductive process. 17: Response to stimulus. 18: Rhythmic process. 19: Signaling. 20: Single-organism process. 21: Cell. 22: Cell junction. 23: Cell part. 24: Extracellular region. 25: Macromolecular complex. 26: Membrane. 27: Membrane part. 28: Membrane-enclosed lumen. 29: Organelle. 30: Organelle part. 31: Symplast. 32: Antioxidant activity. 33: Binding activity. 34: Catalytic activity. 35: Electron carrier activity. 36: Enzyme regulator activity. 37: Metallochaperone activity. 38: Molecular transducer activity. 39: Nucleic acid binding transcription factor activity. 40: Protein binding transcription factor activity. 41: Structural molecule activity. 42: Transporter activity.圖5 不同表達(dá)基因的GO注釋分析Fig.5 The GO annotation statistical of DGEs

表3 DEG基因KEGG分析Table 3 The KEGG path way of DEG

萜生物合成(P=0.047 25)。

2.5 葉綠素與類胡蘿卜素相關(guān)基因的鑒定及表達(dá)分析

葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素是決定植物色澤的三大主要物質(zhì)。本試驗(yàn)通過unigene注釋結(jié)果進(jìn)行篩選，分別獲得了15編碼參與葉綠體與12個(gè)編碼參與類胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵酶的基因。對(duì)15個(gè)葉綠素相關(guān)基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，其中5個(gè)基因在兩種實(shí)驗(yàn)材料中表達(dá)水平基本一致，10個(gè)基因表達(dá)水平存在一定差異，但未達(dá)到顯著水平(表4)。與類胡蘿卜素相關(guān)的12個(gè)unigene中(表5)，編碼類胡蘿卜素解離雙加氧酶7(CDD7)的基因c1920_g1在葉藝隆昌素中表達(dá)下調(diào)。

表4 葉綠素相關(guān)unigene鑒定Table 4 Identification of chlorophyll related unigene

表5 類胡蘿卜素相關(guān)unigene鑒定Table 5 Identification of carotenoid related unigene

2.6 葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的鑒定及表達(dá)分析

從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選出一些編碼光系統(tǒng)I/II、 細(xì)胞色素b6f復(fù)合物、ATP合酶的unigene，其中光系統(tǒng)Ⅱ中的psbC、psbH以及光系統(tǒng)I中的Ycf3基因在葉藝隆昌素根狀莖中均表現(xiàn)為表達(dá)水平下調(diào)(表6)。葉綠體自身編碼的第二類基因是和葉綠體DNA復(fù)制與葉綠體基因表達(dá)相關(guān)的基因。DEG分析結(jié)果顯示，編碼RNA聚合酶亞基的glgC、rbcL以及編碼核糖體蛋白亞基的rpoB、rpsR基因在葉藝隆昌素根狀莖中均表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)(表7)。

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，本試驗(yàn)選擇了9個(gè)涉及葉綠素生物合成、光合系統(tǒng)和葉綠體發(fā)育的基因設(shè)計(jì)引物(表8)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，對(duì)轉(zhuǎn)錄組分析

表6 光合作用相關(guān)的葉綠體編碼基因篩選Table 6 Identification of chloroplast structure related unigenes

表7 葉綠體結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因篩選Table 7 Identification of chloroplast structure related unigenes

結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，如圖6所示。qRF-PCR結(jié)果顯示驗(yàn)證基因的表達(dá)趨勢(shì)均與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相符合，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)具有準(zhǔn)確性與可信性。

2.8 其他調(diào)控相關(guān)的差異基因

除了上述與葉綠素或類胡蘿卜素相關(guān)的差異基因，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果還獲得了大量與植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、編碼細(xì)胞色素P450蛋白、次生物質(zhì)代謝、內(nèi)源激素相關(guān)的差異表達(dá)基因(表9)。這些基因也可能影響葉藝隆昌素的葉色表型。

3 討論

目前已有研究對(duì)蘭科植物進(jìn)行了基因組測(cè)序，其花色變異及分子標(biāo)記得到了部分解析[8,17-18]，但大多數(shù)蘭花物種的遺傳信息尚不清楚。轉(zhuǎn)錄組代表組織特定發(fā)育時(shí)期或階段的所有轉(zhuǎn)錄本的總和，對(duì)于從宏觀層面揭示分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[19-21]。隆昌素和葉藝隆昌素試管苗根狀莖的顏色呈現(xiàn)明顯不同，前者呈墨綠色，后者呈黃色。通過對(duì)葉藝蘭分化的研究發(fā)現(xiàn)，黃色根狀莖可以分化出葉藝苗，綠色根狀莖則分化正常綠色試管苗，是研究國(guó)蘭葉藝形成機(jī)制的重要材料[2]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析鑒定到644個(gè)在隆昌素和葉藝隆昌素根狀莖中差異表達(dá)的unigene，通過對(duì)這些差異表達(dá)基因的篩選，初步分析了影響葉藝隆昌素根狀莖變黃的因素,為解析國(guó)蘭葉藝形成分子機(jī)制提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

植物的色澤與類胡蘿卜素、類黃酮、葉綠素含量有關(guān)[22]，植物葉綠素的合成過程要經(jīng)歷大約16個(gè)步驟，其中以谷氨酰t-RNA為起點(diǎn)，過程中涉及16種酶和20多個(gè)基因[23]，這些基因會(huì)影響葉綠素合成，進(jìn)而使葉綠體中各種色素的比例與含量發(fā)生變化，最終改變?nèi)~色。水稻中已有35個(gè)葉色相關(guān)基因得到克隆，如水稻ygl1黃綠葉突變體幼葉中葉綠體因?yàn)槿~片內(nèi)四吡咯中間體含量的變多而發(fā)育遲緩，導(dǎo)致其葉綠素含量遠(yuǎn)低于野生型[24]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，國(guó)蘭葉片顏色變異由葉綠素代謝途徑異常而非合成途徑異常導(dǎo)致[12]。本研究中篩選出的編碼葉綠素合成相關(guān)酶的基因在葉藝隆昌素與隆昌素根狀莖中也未檢測(cè)出顯著差異，與前人研究結(jié)果相似。

注:*表示具有顯著差異(P<0.05), ** 表示具有極顯著差異(P<0.01)。Note: * and ** indicate significant at 0.05 level and very significant difference at 0.01 level, respectively.圖6 unigene qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.6 qRT-PCR identification of unigenes

表8 qRT-PCR引物設(shè)計(jì)Table 8 qRT-PCR primers

CCD7編碼一個(gè)ABA生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶。研究表明，植物體內(nèi)源ABA的變化與CCD7表達(dá)變化存在顯著相關(guān)性[25]。另一方面，花瓣顏色的形成與CCDs的表達(dá)水平存在顯著相關(guān)性[25]，菊花白色花瓣中CCD4表達(dá)水平遠(yuǎn)高于黃色花瓣，CCD4沉默后的白色花瓣會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，原因是白色花瓣合成類胡蘿卜素之后進(jìn)行了降解。在葉藝隆昌素根狀莖內(nèi)，CCD7的表達(dá)量下調(diào)，可使胡蘿卜素降解速度變快，從而使得根狀莖顏色發(fā)黃，進(jìn)一步說明CCD的表達(dá)參與了顏色調(diào)控。

捕光色素蛋白復(fù)合體由類囊體蛋白與分布在葉綠體類囊體膜上的光合色素組成，這些色素蛋白復(fù)合體均參與了光反應(yīng)，起到轉(zhuǎn)換能量與傳遞電子的作用[26]。本研究中光系統(tǒng)Ⅱ中的psbC、psbH以及光系統(tǒng)Ⅰ中Ycf3基因在葉藝隆昌素根狀莖中表達(dá)量下調(diào)。這些基因的表達(dá)下調(diào)可能影響了葉綠體基粒片層結(jié)構(gòu)，造成光合電子傳遞速率下降，光合能力下降，進(jìn)而影響根狀莖增殖及分化效率。光合作用碳固定和光呼吸碳氧化過程中的關(guān)鍵酶為1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)，其大亞基編碼通過葉綠體基因?qū)崿F(xiàn)，是植物葉片內(nèi)的關(guān)鍵儲(chǔ)存蛋白。有研究顯示，水稻(OryzasativaL.)幼苗白化大多由Rubisco小亞基因的突變導(dǎo)致[27-28]。編碼Rubisco的unigene在葉藝隆昌素內(nèi)的表達(dá)量會(huì)減少也可能是導(dǎo)致葉藝隆昌素根狀莖變黃的原因之一。前人研究發(fā)現(xiàn)，大亞基與小亞基是核糖體的主要組成要素，煙草(NicotianatabacumL.)葉片因?yàn)槿笔~綠體核糖體小亞基編碼基因rps18而出現(xiàn)了畸形并變白的現(xiàn)象，存活率極低；Fleischmann等[29]通過研究發(fā)現(xiàn)，葉片形態(tài)會(huì)因?yàn)槿笔Ш颂求w大亞基編碼基因rpl36而發(fā)生變化，光合速率和植株生長(zhǎng)速

表9 其他相關(guān)基因篩選Table 9 Identification of others related unigenes

表9 (續(xù))

度明顯變慢，本研究中編碼核糖體蛋白大小亞基的rpoB、rpsR基因葉藝隆昌素根狀莖均表達(dá)下調(diào)，而這些基因是否突變或缺失引起葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，有待進(jìn)一步研究確定。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了細(xì)胞器(如液泡、過氧化物體、線粒體、葉綠體等)間次生代謝產(chǎn)物、植物激素、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，是一種跨膜運(yùn)輸?shù)鞍?，存在于大部分生物膜上[30-31]。本研究中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因(ABCB1與ABCG2)表達(dá)下調(diào)，由此推測(cè)由于葉藝隆昌素根狀莖顏色變黃、葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致光合作用減弱、產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)減少，從而通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑反饋抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)。線粒體與葉綠體在植物細(xì)胞中都具有重要作用，線粒體內(nèi)膜中會(huì)出現(xiàn)氧化磷酸化的現(xiàn)象，在ATP合酶催化作用下，電子在線粒體內(nèi)膜上一系列電子傳導(dǎo)作用下傳遞到氧，促使ADP和磷酸合成ATP，線粒體內(nèi)膜上的ATP合成酶、細(xì)胞色素氧化酶、輔酶Q-細(xì)胞色素bc1還原酶、琥珀酸脫氫酶、NADH脫氫酶五種蛋白復(fù)合體都屬于電子傳遞體，其中線粒體電子傳遞鏈內(nèi)以NADH脫氫酶和NADH-泛醌氧化還原酶最為重要，電子傳遞速率受到這些酶活性的影響。本試驗(yàn)中，NADH脫氫酶、NADH-泛醌氧化還原酶和細(xì)胞色素氧化酶均表達(dá)下調(diào)，可以推測(cè)由于葉藝隆昌素根狀莖葉綠體結(jié)構(gòu)不完整，導(dǎo)致體內(nèi)新陳代謝減弱，通過信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制NADH脫氫酶、NADH-泛醌氧化還原酶和細(xì)胞色素氧化酶基因的表達(dá)，減少ATP的合成。作為折疊水解酶超家族成員的BDG，其主要在皮細(xì)胞中表達(dá)，擬南芥純合突變植株矮小、葉片異常、表皮毛細(xì)胞數(shù)不斷變小且細(xì)胞萎陷，存在許多畸型細(xì)胞，植株發(fā)育緩慢，推測(cè)其表皮細(xì)胞組織是在某種未知調(diào)節(jié)機(jī)制的作用下實(shí)現(xiàn)分化和增殖的[32]。本研究中，葉藝隆昌素根狀莖類聯(lián)苯水解酶蛋白顯著上調(diào)，但該蛋白的作用機(jī)制尚不清楚，可知其功能可能與角質(zhì)的生物合成或與細(xì)胞壁本身交聯(lián)酶相關(guān)，同時(shí)該蛋白是否與根狀莖顏色變黃相關(guān)有待進(jìn)一步證實(shí)。

4 結(jié)論

本研究采用轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，隆昌素與葉藝隆昌素根狀莖差異基因在植物-微生物互作、礦物質(zhì)吸收、光形態(tài)建成與倍半萜和三萜生物合成通路中顯著富集。此外，參與ABA合成的CDD7、光系統(tǒng)Ⅰ中的Ycf3、光系統(tǒng)Ⅱ中的psbC與psbH、編碼RNA聚合酶亞基的glgC與rbcL、編碼核糖體蛋白亞基的rpoB與rpsR等基因表達(dá)量的改變可能通過影響植株葉綠體發(fā)育從而影響植株的葉藝表型。