徐俊 葉雨晴 牛雅靜 黃河 張蒙蒙

（1. 北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院 花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心 城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2. 北京市植物園管理處 北京市花卉園藝工程技術(shù)研究中心，北京 100093）

菊花（Chrysanthemum × morifolium）是中國(guó)傳統(tǒng)十大名花之一，有著3 000多年的栽培歷史，具有極高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在規(guī)?；a(chǎn)中，菊花主要通過(guò)由根狀莖發(fā)育而來(lái)的腳芽進(jìn)行扦插繁殖。根狀莖（rhizome）是指植物在地下水平生長(zhǎng)的變態(tài)莖，是許多多年生植物的營(yíng)養(yǎng)器官之一［1-2］。作為一種繁殖策略和營(yíng)養(yǎng)器官，根狀莖能夠幫助植物抵御非生物脅迫，例如，根狀莖型多年生禾本科植物草地早熟禾（Poa pratensis）和結(jié)縷草（Zoysia japonica），比非根狀莖型禾本科植物多年生黑麥草（Lolium perenne）表現(xiàn)出更好的耐旱性［3］。同時(shí)，根狀莖能增加植物的宿根性和繁殖能力，在普通水稻（Oryza sativa）中引入長(zhǎng)雄野生稻（O.longistaminata）的根狀莖性狀能培育出一次種植多年采收的多年生水稻［4］。此外，荷花（Nelumbo nucifera）、生姜（Zingiber officinale）等農(nóng)作物的根狀莖還是其主要的采收器官。有研究表明具有更多根狀莖的菊花品種抗寒性更強(qiáng)，根狀莖數(shù)量是抗寒菊花品種快速篩選的重要指標(biāo)［5］。并且菊花根狀莖還有助于抵御干旱脅迫，幫助菊花在干旱后更好的恢復(fù)［6］，但相對(duì)于在花色、開(kāi)花期等方面的表型分析和分子調(diào)控機(jī)制研究［7-9］，目前對(duì)于菊花根狀莖形成關(guān)鍵基因的克隆及其功能還少有報(bào)道。

目前控制高等植物根狀莖形成的關(guān)鍵基因尚報(bào)道較少，隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的日趨成熟，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用到根狀莖發(fā)育研究當(dāng)中，在長(zhǎng)雄野生稻、擬高粱（Sorghum propinquum）、蘆葦（Phragmites australis）、早竹（Phyllostachys praecox）等植物中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了一些可能與根狀莖發(fā)育相關(guān)的基因，包括激素合成和信號(hào)傳導(dǎo)、光周期響應(yīng)以及調(diào)控分生組織形成相關(guān)的基因。植物激素是植物體內(nèi)產(chǎn)生的在極低濃度下能夠產(chǎn)生生理效應(yīng)的信號(hào)分子，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)階段的調(diào)控。多種植物的根狀莖轉(zhuǎn)錄組報(bào)道中篩選出了與植物激素合成和信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因，如在荷花根狀莖生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因Gibberellic Acid Insensitive（GAI）、脫落酸受體基因Pyrabactin Resistant?Like（PYL）和生長(zhǎng)素響應(yīng)因子Auxin Response Factor（ARF）在伸長(zhǎng)期和膨大期的表達(dá)差異顯著［10］，赤霉素合成基因Gibberellin 20?oxidase（GA20ox）的表達(dá)量在根狀莖發(fā)育過(guò)程中降低［11］。此外，對(duì)強(qiáng)根狀莖草地早熟禾QH和弱根狀莖草地早熟禾SN的根狀莖芽、根狀莖節(jié)和根狀莖節(jié)間3個(gè)部位分別進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)脫落酸受體基因PYL和脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)基因PP2C在QH和SN的節(jié)中差異表達(dá)［1］。以上研究表明，根狀莖的生長(zhǎng)發(fā)育可能受到赤霉素、脫落酸等多種激素的調(diào)控。由于根狀莖起源于莖基部的腋生分生組織［2］，因此分生組織形成相關(guān)基因也可能參與控制根狀莖的形成。在擬高粱轉(zhuǎn)錄組中找到了在根狀莖中特異表達(dá)的MYB36，該基因在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中控制腋生分生組織的形成［12］；同時(shí)，在早竹根狀莖轉(zhuǎn)錄組中也篩選到了REVOLUTA（REV）、CLAVATA1（CLV1）等和分生組織形成有關(guān)的基因［13］。另外，有報(bào)道顯示，光周期誘導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因也可能參與根狀莖的形成和發(fā)育，F(xiàn)T基因的表達(dá)在溫代蓮和熱帶蓮的根狀莖發(fā)育過(guò)程中下降［10］。

綜上，目前的研究對(duì)高等植物根狀莖的發(fā)育過(guò)程有了一定了解，但根狀莖形成和生長(zhǎng)發(fā)育的分子基礎(chǔ)尚不清楚，誘導(dǎo)根狀莖形成的關(guān)鍵基因仍未找到。為了探究菊花根狀莖形成的分子機(jī)制，篩選可能參與菊花根狀莖發(fā)育的基因。本研究以能穩(wěn)定形成根狀莖的菊花品種‘2017XS’為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料，選取根狀莖尖、根狀莖中部、根狀莖下部、葉片、莖段、根系、莖尖、舌狀花8個(gè)組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果的生物信息學(xué)分析，篩選有可能控制根狀莖發(fā)育的關(guān)鍵基因，并利用RT?qPCR對(duì)其進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，從而為解析菊花根狀莖形成機(jī)理，培育具有豐富根狀莖、抗逆性強(qiáng)的菊花新品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

前期通過(guò)對(duì)大量的菊花種質(zhì)資源進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)‘2017XS’和‘2005042’兩個(gè)株系能夠穩(wěn)定形成根狀莖，并且數(shù)量較多（圖1）。本研究以‘2017XS’為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料，為了獲取全面的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并且獲得根狀莖中差異表達(dá)基因，除了根狀莖的3個(gè)部位根狀莖尖（RH）、根狀莖中部（RT）、根狀莖下部（RB）還選取了莖尖（SA）、葉片（L）、莖段（S）、根（R）、舌狀花（F）5個(gè)部位進(jìn)行測(cè)序（圖1?C）。所有的樣品取自無(wú)性繁殖的植株，每個(gè)部位取3次重復(fù)。樣品用液氮速凍，并儲(chǔ)存在?80℃條件下。

圖1 ‘2017XS’和‘2005042’根狀莖示意圖及轉(zhuǎn)錄組取材示意圖Fig. 1 Schematic diagram of ‘2017XS’ and ‘2005042’rhizomes and schematic diagram of 8 transcriptome sampling

以‘2005042’為驗(yàn)證品種，同樣取其根狀莖尖、根狀莖中部、根狀莖下部、莖尖、葉片、莖段、根和舌狀花8個(gè)部位，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中獲得差異表達(dá)基因的表達(dá)模式。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取與文庫(kù)構(gòu)建 使用植物RNA快速提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）分別提取總RNA。用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，加入破碎緩沖液將mRNA 隨機(jī)打斷，并以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第1條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第2條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA。純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)，加A尾并連接測(cè)序接頭，然后進(jìn)行片段大小的選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用Agilent 2100生物分析儀和ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與組裝 利用Illumina Hi?seqTM2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。過(guò)濾raw data中的低質(zhì)量數(shù)據(jù)以獲得clean data，隨后使用Trinity軟件［14］進(jìn)行從頭組裝，得到Unigene序列。獲得的Unigene序列通過(guò)BLAST［15］（E?value ＜ 10-5）與NR、Swiss?Prot、GO、COG、KOG、eggNOG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，使用KOBAS2.0［16］得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology結(jié)果，預(yù)測(cè)完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER［17］（E?value ＜ 10-10）軟件與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得Unigene的注釋信息。利用clusterProfiler［18］軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集和KEGG通路富集分析，并選取Padj ＜ 0.05的顯著富集的GO類(lèi)別和KEGG代謝通路。

采用Bowtie［19］將測(cè)序得到的Reads與Unigene庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，結(jié)合RSEM［20］進(jìn)行表達(dá)量水平估計(jì)。利用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）值表示對(duì)應(yīng)Unigene的表達(dá)豐度。采用DESeq2進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，以FDR（False Discovery Rate）＜ 0.01且差異倍數(shù)FC（Fold Change）≥2為篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異表達(dá)基因的聚類(lèi)分析使用Mfuzz軟件進(jìn)行［21］。使用Tbtools軟件制作基因表達(dá)量熱圖［22］。Venn圖使用在線平臺(tái)繪制（https://www.bioladder.cn/web/#/chart/17）。

1.2.3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 首先通過(guò)FPKM將低表達(dá)的和低變異度的基因去除。數(shù)據(jù)過(guò)濾之后對(duì)樣本進(jìn)行層次聚類(lèi)分析。利用pickSoftThreshold函數(shù)計(jì)算最佳軟閾值，選取無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)擬合指數(shù)R2＞ 0.8時(shí)power值最小的數(shù)為最佳power值。利用WGCNA包的blockwiseModules函數(shù)構(gòu)建共表達(dá)矩陣，模塊相似度閾值設(shè)置為0.25，合并相似度為0.8的模塊，模塊內(nèi)最小基因數(shù)設(shè)置為30，其他參數(shù)按照默認(rèn)設(shè)置［23］。

1.2.4 根狀莖高表達(dá)基因的篩選 使用Excel按照根狀莖尖的FPKM表達(dá)量高于其他組織3倍的標(biāo)準(zhǔn)篩選根狀莖尖高表達(dá)基因，按照根狀莖3個(gè)部位（根狀莖尖、根狀莖中部、根狀莖下部）的FPKM表達(dá)量均高于其他部位3倍的標(biāo)準(zhǔn)篩選根狀莖高表達(dá)基因［24］。

1.2.5 RT?qPCR驗(yàn)證 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組篩選結(jié)果，選取6個(gè)在根狀莖中特異表達(dá)的基因，在‘2017XS’和另一個(gè)穩(wěn)定形成根狀莖菊花株系‘2005042’的8個(gè)部位（根狀莖尖、根狀莖中部、根狀莖下部、莖尖、葉片、莖段、根和舌狀花）進(jìn)行基因表達(dá)的熒光定量PCR（RT?qPCR）分析，使用 primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物（表1）。用德國(guó)耶拿實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀qTOWER 2.2（Analytik Jena，German）進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，反應(yīng)體系20 μL。選用SAND作為內(nèi)參基因，用 2-ΔΔCt算法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量［25］。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序和從頭組裝

為了篩選得到根狀莖尖以及整個(gè)根狀莖中高表達(dá)的基因，對(duì)來(lái)自葉片、莖、根、舌狀花、莖尖、根狀莖尖、根狀莖中部和根狀莖下部的24個(gè) cDNA文庫(kù)使用 Illumina HiSeq 2000 高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。在過(guò)濾掉接頭序列、不明確和低質(zhì)量的reads之后，所有樣品總的clean reads大約159.51 GB。使用Trinity程序，將所有clean reads從頭組裝成196 467個(gè)轉(zhuǎn)錄本，平均長(zhǎng)度為905 bp，N50長(zhǎng)度為1 295 bp。這些轉(zhuǎn)錄本進(jìn)一步組裝成100 235個(gè)Uni?gene。Unigene平均長(zhǎng)度為832 bp，N50長(zhǎng)度為1 280 bp。在這些Unigene中，28 114個(gè)（28.05%）大于1 000 bp，46 596個(gè)（46.48%）小于500 bp（圖2?A）。

2.2 根狀莖差異基因的功能注釋和分類(lèi)

為了對(duì)組裝的Unigene進(jìn)行注釋?zhuān)瑢?duì)7個(gè)公共蛋白質(zhì)/核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了E值為10-5的BLAST搜索，最終獲得64 956（64.80%）個(gè)有注釋信息的Unigene。其中3 1951條（49.19%）在KOG中得到注釋?zhuān)?0 653條（62.47%）在Pfam中得到注釋?zhuān)?4 388條（52.86%）在Swissprot中得到注釋?zhuān)?2 639條（65.64%）在eggNOG中得到注釋?zhuān)?2 005條（95.46%）在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋。

為深入了解根狀莖發(fā)育基因的功能分類(lèi)和代謝途徑，將根狀莖和其他組織間進(jìn)行比較獲得差異基因（FDR＜ 0.01，F(xiàn)C≥ 2），共獲得3 274個(gè)差異基因。將這些基因根據(jù)序列同源性，分為25個(gè)KOG類(lèi)別（圖2?B）。一般功能預(yù)測(cè)基因（273，18.03%）、翻譯后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白伴侶（159，10.5%）、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制（136，8.98%）和碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（136，8.98%）類(lèi)別包含基因較多。相比之下，染色體結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)（9，0.59%）和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)（7，0.46%）的包含基因較少。在3 274個(gè)差異基因中，共有1 190個(gè)Unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配，并匹配到50條通路，覆蓋五大KEGG類(lèi)別（圖2?C）。最具代表性的3種途徑是植物-病原體互作（91, 8.95%）、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)（55, 5.41%）和碳代謝（53, 5.21%），其次是植物MAPK信號(hào)通路（50, 4.92%）和苯丙酸生物合成（48, 4.72%）途徑，而氨基?；鵷RNA生物合成（11, 1.08%）和油菜素生物合成（11, 1.08%）途徑包含基因最少。

2.3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

為了鑒定根狀莖起始和發(fā)育過(guò)程中高表達(dá)的基因，在去除低表達(dá)和低變異度的基因后構(gòu)建相關(guān)性聚類(lèi)樹(shù)，采用動(dòng)態(tài)切割法將產(chǎn)生的聚類(lèi)樹(shù)進(jìn)行切割，把表達(dá)模式相似的基因合并在同一分支上，每個(gè)分支代表1個(gè)共表達(dá)模塊，根據(jù)模塊相似度對(duì)表達(dá)模式相似的模塊合并（合并相似度為0.8的模塊）后進(jìn)行模塊劃分，最終獲得17個(gè)共表達(dá)模塊（圖3?A）。Meroyalblue模塊中共有460個(gè)基因，該模塊與根狀莖正相關(guān)；Meplum1模塊中共有632個(gè)基因，該模塊與根狀莖尖正相關(guān)（圖3?B），基于這兩個(gè)模塊我們進(jìn)行了根狀莖尖和根狀莖高表達(dá)基因的篩選。利用FPKM值衡量基因的表達(dá)水平，按照方法1.2.4中的標(biāo)準(zhǔn)篩選高表達(dá)基因?；诖?，在MEroyalblue模塊中共篩選到20個(gè)在根狀莖中高表達(dá)的基因，在MEplum1模塊中共篩選到16個(gè)在根狀莖尖中高表達(dá)的基因，共計(jì)36個(gè)基因，根狀莖尖中高表達(dá)的16個(gè)基因主要包括和抗逆相關(guān)的基因（LEA1、TIP1?1、TIP2?1）、脫落酸代謝相關(guān)的基因（ABA8ox）、紅光受體基因（PHYB）以及1個(gè)bZIP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子（bZIP34）（表2）。根狀莖中高表達(dá)的基因同樣包含大量抗逆相關(guān)的基因（LEA1、PIP1?1、TIP2?1和DREB1D），同時(shí)還包含了光周期轉(zhuǎn)錄因子（TFL1）、紫外光受體基因（UVR8）、生物節(jié)律控制基因（LHY）基因以及鋅指蛋白（zinc finger）（表3）。

表3 ‘2017XS’根狀莖中高表達(dá)基因匯總Table 3 Summary of highly expressed genes in the rhizomes of‘ 2017XS’

圖3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析Fig. 3 WGCNA analysis

2.4 基于韋恩圖篩選差異基因

為了鑒定根狀莖起始和發(fā)育過(guò)程中高表達(dá)的基因，進(jìn)一步著重于根狀莖3個(gè)部位（根狀莖尖、根狀莖中部、根狀莖下部）中DEGs的鑒定。在根狀莖尖和其他非根狀莖部位間的比較中有693個(gè)基因都差異表達(dá)（圖4?A），618個(gè)基因在根狀莖中部和其他非根狀莖部位都差異表達(dá)（圖4?B），有763個(gè)基因在根狀莖下部和其他非根狀莖部位都差異表達(dá)（圖4?C）。在這2 074個(gè)基因中篩選根狀莖尖中高表達(dá)基因和根狀莖高表達(dá)基因。按照方法1.2.4的標(biāo)準(zhǔn)篩選到16個(gè)在根狀莖尖中高表達(dá)的基因，其中除了11個(gè)WGCNA篩選到的基因，還包含了抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（DREB2F）、鋅指蛋白（CZF2）、ABA降解基因（ABA8ox）、ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因（PP2C）和糖基轉(zhuǎn)移酶基因（UGT83A1）等（表2）。根狀莖高表達(dá)的基因在WGCNA篩選到20個(gè)差異基因的基礎(chǔ)上新篩選到5個(gè)基因分別是鋅指蛋白（CZF4）、NADH脫氫酶基因（NDA1）、乙烯響應(yīng)因子基因（ERF C3）、β-糖苷酶基因（BG 46）和胚胎晚期發(fā)育蛋白基因（LEA Dc3）（表3）。

圖4 根狀莖3個(gè)部位與其他組織的差異表達(dá)基因Venn圖Fig. 4 Venn diagram of DEGs in three parts of rhizome and other tissues

2.5 基因共表達(dá)趨勢(shì)分析

為了篩選根狀莖發(fā)育的關(guān)鍵基因，采用K?means聚類(lèi)對(duì)Venn圖中涉及的差異基因進(jìn)行分類(lèi)（圖5）。共鑒定出25個(gè)具有不同表達(dá)模式的聚類(lèi)，其中有8個(gè)聚類(lèi)在單個(gè)組織中高表達(dá)。聚類(lèi)3和16在舌狀花中高表達(dá)，聚類(lèi)5、13和18在根中高表達(dá)，聚類(lèi)22在葉片中高表達(dá)，聚類(lèi)14在莖尖中高表達(dá)，聚類(lèi)1在根中高表達(dá)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在根狀莖尖中高表達(dá)的聚類(lèi)模塊。但發(fā)現(xiàn)聚類(lèi)17中的473個(gè)基因在根狀莖3個(gè)樣品中高于其他組織。利用FPKM值衡量基因的表達(dá)水平，按照根狀莖3個(gè)部位中的表達(dá)量均高于其他組織3倍的標(biāo)準(zhǔn)篩選根狀莖高表達(dá)基因。在WGCNA和韋恩圖篩選的基礎(chǔ)上新篩選到10個(gè)在根狀莖中高表達(dá)的基因，主要包括光周期響應(yīng)基因（COL12）、紫外光受體基因（UVR8）、非生物脅迫基因（LEA）和糖基轉(zhuǎn)移酶基因（UGT）（表3）。

圖5 根狀莖穩(wěn)定型株系‘2017XS’基因表達(dá)模式的Cluster分析Fig. 5 Cluster analysis of gene expression patterns of rhizome stable line ‘2017XS’

綜上，基于以上3種方式共篩選到了20個(gè)在根狀莖尖中高表達(dá)的基因，36個(gè)在根狀莖中高表達(dá)的基因。這些基因涉及了激素代謝和信號(hào)傳導(dǎo)、光周期、非生物脅迫等重要的生物過(guò)程。

2.6 RT?qPCR驗(yàn)證差異基因的表達(dá)情況

為了驗(yàn)證 RNA?seq 結(jié)果準(zhǔn)確性，選擇6個(gè)篩選出來(lái)的高表達(dá)基因進(jìn)行RT?qPCR 驗(yàn)證，分析 RT?qPCR 與 RNA?seq 結(jié)果之間的相關(guān)性，每個(gè)基因進(jìn)行 3 次生物學(xué)重復(fù)。轉(zhuǎn)錄組中，bZIP34和ABA8ox在根狀莖尖中高表達(dá)，其余4個(gè)在根狀莖中高表達(dá)。結(jié)果顯示，6個(gè)基因的表達(dá)量變化與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序數(shù)據(jù)和RT?qPCR 的數(shù)據(jù)之間具有良好的一致性（圖6?A），表明本研究 RNA?seq 數(shù)據(jù)具有較高的可靠性。在‘2005042’中，6個(gè)基因的表達(dá)在根狀莖尖中的表達(dá)均顯著高于其他部位，結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及‘2017XS’的表達(dá)驗(yàn)證趨勢(shì)較為一致（圖6?B）。

3 討論

作為一種在園林中大量應(yīng)用的地被花卉，菊花具有開(kāi)花繁密、株型整齊等特點(diǎn)。在園林應(yīng)用中，根狀莖特性賦予了菊花極強(qiáng)的宿根性和無(wú)性繁殖能力。但目前關(guān)于菊花根狀莖的研究較少，菊花根狀莖形成的分子機(jī)制仍不清楚。本研究對(duì)包括菊花根狀莖在內(nèi)的8個(gè)組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，以期篩選可能參與根狀莖發(fā)育的基因。

3.1 菊花根狀莖及其在抗逆中的作用

根狀莖是植物在地下水平生長(zhǎng)的地下莖，源于腋生分生組織［2］。根狀莖在頂端分生組織在發(fā)育的過(guò)程中既能形成一個(gè)新的節(jié)間維持原來(lái)的狀態(tài)，也能使根狀莖尖向上彎曲形成母株的一個(gè)營(yíng)養(yǎng)克?。?］。同時(shí)根狀莖的節(jié)間能形成不定根從而拓展植物的根系。根狀莖作為一種重要的地下貯藏器官有助于植物在惡劣環(huán)境下生存，在脅迫條件下根狀莖能夠在地下生存，一旦條件合適根狀莖就能發(fā)育形成地上莖。有大量文獻(xiàn)報(bào)道根狀莖和植物非生物脅迫有關(guān)。在草地早熟禾中，根狀莖中貯藏的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物有助于其干旱后恢復(fù)［26］。在菊花中根狀莖同樣在非生物脅迫中起著重要作用，Anderson等［5］發(fā)現(xiàn)根狀莖越多的菊花冬季存活率越高，并且可以通過(guò)根狀莖表型進(jìn)行抗寒菊花的快速篩選。Zhang等［6］認(rèn)為菊花根狀莖有助于菊花在干旱后的恢復(fù)［27］，并且發(fā)現(xiàn)干旱脅迫能降低CmRH56的表達(dá)從而較少根狀莖的數(shù)量。

本研究中在根狀莖尖和根狀莖中找到了大量和抗逆相關(guān)的基因包括TIP、PIP、DREB和LEA。目前大部分關(guān)于DREB報(bào)道都和植物抗逆有關(guān)，在小麥（Triticum aestivum）中過(guò)表達(dá)大豆（Glycine max）的GmDREB1增加了小麥的抗旱能力，并且在干旱條件下的轉(zhuǎn)基因小麥的產(chǎn)量高于野生型［28］；過(guò)表達(dá)番茄（Solanum lycopersicum）SlDREB3改善了番茄在冷脅迫下的生理狀態(tài)，使植株在4℃環(huán)境下有更好的生長(zhǎng)表現(xiàn)［29］。在辣椒（Capsicum annuum）中抑制LEA同源基因CaDIL1表達(dá)，降低了辣椒在干旱脅迫下的表現(xiàn)［30］。AQPs在植物的抗逆脅迫方面有大量的報(bào)道，同時(shí)也有文獻(xiàn)報(bào)道其參與種子的萌發(fā)。目前未見(jiàn)這些基因在根狀莖發(fā)育中起作用的報(bào)道，但有研究表明干旱能夠誘導(dǎo)菊花的根狀莖產(chǎn)生［27］，我們推測(cè)抗逆類(lèi)基因有可能在干旱脅迫和根狀莖發(fā)育間起到橋梁作用。

3.2 脫落酸影響菊花根狀莖發(fā)育

越來(lái)越多的證據(jù)表明，激素影響植物發(fā)育過(guò)程的各個(gè)方面，脫落酸和赤霉素對(duì)植物的地下莖的休眠萌發(fā)和生長(zhǎng)發(fā)育起到了重要作用，袁婭娟［31］對(duì)草地早熟禾不同生育時(shí)期的根狀莖擴(kuò)展指標(biāo)和激素含量進(jìn)行了分析，認(rèn)為ABA含量越低，越有利于根狀莖擴(kuò)展；Li等［32］發(fā)現(xiàn)屏邊空竹（Cephalostachyum pingbianense）的根狀莖芽在休眠到萌發(fā)期間ABA含量下降，并且與ABA合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的調(diào)控基因，如NCED、PYL、SnRK2和ABF，在根狀莖芽萌發(fā)期間也顯著下調(diào)。此外，赤霉素也會(huì)影響根狀莖發(fā)育，外施赤霉素可以促進(jìn)高羊茅和草地早熟禾根狀莖伸長(zhǎng)［33］；在菊花中，外施赤霉素能增加其根狀莖數(shù)量［6］。

在本研究中找到了2個(gè)ABA代謝基因（ABA8ox）、5個(gè)調(diào)控ABA穩(wěn)態(tài)基因（UGT和BG）以及1個(gè)ABA信號(hào)傳導(dǎo)基因（PP2C），在根狀莖尖或整個(gè)根狀莖中高表達(dá)。但未找到和赤霉素相關(guān)的基因。ABA濃度和活性的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，ABA可以通過(guò)復(fù)雜的生化過(guò)程由2?C?甲基?D?赤藻糖醇?4?磷酸（Methylerythritol?4?phosphate pathway，MEP）起始合成ABA，整個(gè)過(guò)程中ABA合成的關(guān)鍵限速酶是NCED［34］。ABA的分解代謝主要通過(guò)8′羥基化實(shí)現(xiàn)，主要的酶是ABA8ox［35］。除外UDP?糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGTs和β-糖苷酶基因BGs在調(diào)控ABA活性方面發(fā)揮作用，UGTs可以將葡萄糖Glu結(jié)合到ABA上形成ABA葡萄糖酯（ABA?GE），使ABA失活，BGs 基因可以將Glu去除從而恢復(fù) ABA活性［31］。在葡萄中過(guò)表達(dá)ABA8ox同源基因VvA8H?CYP707A4能降低ABA含量，并促進(jìn)葡萄側(cè)枝生長(zhǎng)［35］。在番茄中過(guò)表達(dá)柿樹(shù)（Diospyros kaki）的UGT3能降低番茄ABA含量，使番茄出現(xiàn)植株變矮、種子休眠程度降低等表型［36］。柿樹(shù)DkBG1可以水解ABA?GE，從而釋放游離ABA，在番茄中過(guò)表達(dá)DkBG1可以促進(jìn)果實(shí)提前成熟［37］。本研究找到了在根狀莖尖或者根狀莖中高表達(dá)的2個(gè)ABA8ox、3個(gè)UGT和2個(gè)BG。因此ABA很有可能參與到菊花根狀莖形成和發(fā)育過(guò)程中。

3.3 光周期及光照影響菊花根狀莖發(fā)育

光周期對(duì)高等植物地下根狀莖的發(fā)育具有調(diào)控作用，在荷花中，短日照促進(jìn)根狀莖增粗，而長(zhǎng)日照促進(jìn)根狀莖伸長(zhǎng)［38］。在高羊茅中較長(zhǎng)的光周期有利于根狀莖的形成［39］。在竹類(lèi)植物中光周期核心轉(zhuǎn)錄因子FT與其根狀莖類(lèi)型有密切關(guān)系［40］。在本研究中我們篩選到了兩個(gè)光周期核心轉(zhuǎn)錄因子COL12和TFL1，一個(gè)紅光受體基因PHYB和兩個(gè)紫外光受體基因UVR8在根狀莖中特異高表達(dá)。

目前有大量文獻(xiàn)報(bào)道了光周期對(duì)根狀莖發(fā)育具有重要影響，其中光周期對(duì)于馬鈴薯（Solanum tuberosum）塊莖和草莓（Fragaria vesca）匍匐莖形成的分子機(jī)制研究得較為清楚，在馬鈴薯中共有3個(gè)CO?like基因（StCOL1/StCOL2/StCOL3），其中StCOL1在長(zhǎng)日照下優(yōu)先積累。StCOL1在RNAi系中的下調(diào)加速馬鈴薯塊莖的形成。StCOL1可以直接激活長(zhǎng)日照下的FT同源基因StSP5G。激活后，StSP5G通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)FT同源基因StSP6A轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制非誘導(dǎo)條件下的塊莖形成［41］。

葉片感受光信號(hào)是通過(guò)光受體完成的，如光敏色素和隱花色素等［42］。在本研究中還篩選得到了兩個(gè)紫外光受體基因UVR8在根狀莖中高表達(dá)，一個(gè)紅光受體基因PHYB在根狀莖尖中高表達(dá)。這些光受體基因可能通過(guò)感受光周期進(jìn)而影響植物地下莖發(fā)育。在馬鈴薯基因組中鑒定的5個(gè)光敏色素基因中，StPHYB和StPHYF在響應(yīng)長(zhǎng)日照抑制塊莖形成中發(fā)揮最顯著的作用。抑制StPHYF表達(dá)發(fā)現(xiàn)馬鈴薯能在長(zhǎng)日照下形成塊莖并且StPHYF和StPHYB能夠互作［43］。

4 結(jié)論

本研究利用 Illumina Hi?seqTM2000 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)菊花種質(zhì)‘2017XS’的8個(gè)組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得100 235個(gè)Unigene，其中64 956個(gè)Unigene 得到注釋。通過(guò)WGCNA、Venn圖篩選和K?means一共篩選得到20個(gè)在根狀莖尖中高表達(dá)的基因和36個(gè)在根狀莖中高表達(dá)的基因，主要包括ABA分解代謝、光周期相關(guān)的基因以及部分抗非生物脅迫類(lèi)基因。