程 月 朱姍姍 劉 靜 張世凱 翟曉松 劉 陽(yáng) 趙月菊,*

(1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與科學(xué)工程學(xué)院，山東 泰安 271018)

黃曲霉(Aspergillusflavus)是一種腐生真菌，易污染各類農(nóng)產(chǎn)品，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生具有強(qiáng)毒性和強(qiáng)致癌性的黃曲霉毒素(aflatoxins, AFT)，嚴(yán)重威脅人畜健康[1-4]?；ㄉ陀衩自诜N植、儲(chǔ)藏和加工中受黃曲霉毒素污染嚴(yán)重，黃曲霉毒素污染超標(biāo)事件時(shí)有發(fā)生。馬皎潔等[5]對(duì)來(lái)自湖南和湖北等12個(gè)省的玉米及其制品共計(jì)650份樣品進(jìn)行了真菌毒素檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn),玉米黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)的檢出率為53.02%，且有10.53%的玉米樣品中AFT含量超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。高秀芬等[6]調(diào)查全國(guó)主要花生和玉米產(chǎn)區(qū)的AFT污染情況發(fā)現(xiàn)，6個(gè)產(chǎn)區(qū)的花生AFB1污染率較嚴(yán)重，污染率接近60%，AFB1污染平均含量為91.74 μg·kg-1；在全國(guó)6個(gè)省抽取279份玉米樣品，AFB1檢出率高達(dá)75.63%，在抽檢的七類食品中，花生、玉米的檢出率最高[7]。2015年在我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口歐盟的251個(gè)違例事件中，花生中的AFT超標(biāo)事件高達(dá)98起，占39.0%，2014年違例事件167起，其中花生AFT超標(biāo)事件36起，占21.6%[7]。AFT污染給我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品加工和出口造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前主要通過(guò)抑制黃曲霉菌的生長(zhǎng)和毒素的形成來(lái)解決AFT污染。其中應(yīng)用防霉劑是控制黃曲霉毒素污染的一種有效方式，通常采用的防霉劑主要是人工合成類殺菌劑，如咪唑類，雖然效果良好，但具有毒副作用、易殘留、降解周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，限制了這類殺菌劑的使用范圍及劑量[8-10]。因此，亟待開發(fā)新型安全無(wú)殘留的防霉殺菌劑，從而有效控制黃曲霉污染。

異硫氰酸酯(isothiocyanates, ITCs)是一類具有R-N=S結(jié)構(gòu)通式的化合物，是硫代葡萄糖苷(benzyl glucosinolate, BG)的酶解產(chǎn)物，天然存在于十字花科、番木瓜科植物中，例如蘿卜、花椰菜、薺菜等[11]。異硫氰酸芐酯(benzyl isothiocyanate, BITC)是指R基團(tuán)為芐基的一種異硫氰酸酯。BITC已被證明是安全無(wú)毒的，廣泛用于降低血糖、血脂和抗癌[12]。Azaiez等[13]通過(guò)體外試驗(yàn)驗(yàn)證了3種異硫氰酸酯對(duì)真菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)3種異硫氰酸酯可以作為天然防腐劑應(yīng)用在面包或易受串珠鐮刀菌污染的食品中。Mejia-Garibay等[14]在液體培養(yǎng)和熏蒸條件下發(fā)現(xiàn)了黑芥末精油(異硫氰酸烯丙酯為其主要成分)可以抑制黃曲霉的活性。水分活度(water activity，aw)是影響霉菌生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的關(guān)鍵因素，但是目前關(guān)于aw對(duì)BITC抑制黃曲霉效果的影響鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)分別以花生和玉米為培養(yǎng)基質(zhì)，研究不同濃度BITC在不同aw下對(duì)于黃曲霉生長(zhǎng)和產(chǎn)毒情況的影響，旨在為進(jìn)一步開發(fā)基于BITC的抑菌產(chǎn)品提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A.flavusNRRL3357，由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所提供；AFB1，美國(guó)西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；BITC，上海源葉生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260型高效液相色譜儀(配有AgilenTTC-C185 μm×4.6 μm×250 mm色譜柱)，美國(guó)安捷倫科技有限公司；LRH-150F型生化培養(yǎng)箱，廣州番禹旭東坂田電子有限公司；SZ2-1LST型電子顯微鏡，日本Olympus公司；DRP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LS-50HD立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；D10-12型氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；BSA124S型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；Aqualab 4TE水活度測(cè)定儀，美國(guó)Decagon Devices公司；光化學(xué)衍生器，北京華安邁克生物有限公司；SK06G超聲波清洗器，上?？蓪?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

玉米培養(yǎng)基：稱取40 g玉米，碾碎成粉末后加入甘油和去離子水定容至1 000 mL，通過(guò)調(diào)節(jié)甘油和去離子水的添加比例控制培養(yǎng)基水分活度為0.995、0.980、0.960、0.930[15]，加入20 g瓊脂粉，121℃高壓滅菌30 min。

花生培養(yǎng)基：稱取40 g花生，碾碎成粉末后加入甘油和去離子水定容至1 000 mL，通過(guò)調(diào)節(jié)甘油和去離子水的添加比例控制培養(yǎng)基水分活度為0.995、0.980、0.960、0.930[15]，加入20 g瓊脂粉，121℃高壓滅菌30 min。

自制馬鈴薯培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)：200 g去皮馬鈴薯煮沸30 min，紗布過(guò)濾固體物質(zhì)取濾液，加入20 g葡萄糖和16 g瓊脂粉，用蒸餾水定容至1 000 mL，115℃高壓滅菌30 min。

1.4 孢子菌懸液的配制

將甘油保藏的黃曲霉菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，放置在28℃生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，待培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿黃曲霉綠色菌絲后，取出培養(yǎng)基，在PDA培養(yǎng)基上加入1 mL 0.1%吐溫80溶液，使用無(wú)菌棉簽挑取黃曲霉孢子至1%吐溫80溶液制成均勻的孢子菌懸液中，用血球平板計(jì)數(shù)，調(diào)至濃度107CFU·mL-1待用。

1.5 BITC溶液的配制

將BITC溶于乙醇，采用梯度稀釋法配制所需溶液[16]。

1.6 BITC抑制黃曲霉效果的分析

將黃曲霉孢子懸液接種于花生培養(yǎng)基中央，平板倒置，將一無(wú)菌圓形濾紙片(直徑20 mm)貼在另一平板中央，取一定量的BITC配制溶液于濾紙片上，使花生培養(yǎng)基平板內(nèi)精油濃度分別為0、5、10、15、20 mg·L-1，加入等量乙醇作為對(duì)照組。同樣的方法接種黃曲霉于玉米培養(yǎng)基，使其濃度為0、2.5、5.0 mg·L-1。然后用封口膜密封平板，28℃培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落直徑，直徑反映了菌絲生長(zhǎng)速率。BITC的體外抑菌效果分別采用菌落直徑和抑菌率來(lái)表示。抑制率100%的最低精油濃度為其最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

抑菌率與菌落直徑的換算公式為：

(1)。

1.7 AFB1的提取和檢測(cè)

抑菌效果測(cè)定后，提取黃曲霉毒素。取培養(yǎng)基平板，用6 mm打孔器分別從中心、外緣和中間部位打3個(gè)菌餅置于5 mL離心管，加入1.5 mL氯仿，震蕩30 min后8 000 r·min-1離心10 min取下層液體，60℃氮吹，用1 mL甲醇復(fù)溶。復(fù)溶之后的溶液用0.22 μm濾膜過(guò)濾到棕色液相進(jìn)樣瓶中，直接上樣。

高效液相色譜分析條件：C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；熒光檢測(cè)器2475型，激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm；柱溫：30℃；流動(dòng)相：以甲醇∶水(7∶3, v∶v)為流動(dòng)相；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1[17]。

(2)。

1.8 掃描電鏡觀察BITC對(duì)黃曲霉菌絲形態(tài)變化的影響

取aw為0.98的花生培養(yǎng)基中BITC(10 mg·L-1)處理3 d的黃曲霉菌絲和對(duì)照菌絲，用2.5%戊二醛溶液固定24 h，濃度為50%、75%、100%的乙醇各脫水20 min。通過(guò)臨界點(diǎn)干燥法干燥樣品，進(jìn)行噴金處理[18]。掃描電鏡下觀察并拍照。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 20.0方差分析(ANOVA)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用最小顯著差異法(least significant difference，LSD)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)；采用 Origin Pro 2017C 64Bit軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BITC對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)速率的影響

2.1.1 BITC在不同aw對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)速率的影響 (以花生為培養(yǎng)基質(zhì)) 黃曲霉等曲霉屬絲狀在適宜的固體培養(yǎng)基表面常形成肉眼可見(jiàn)的菌落，并產(chǎn)生大量孢子，通過(guò)傳播擴(kuò)散進(jìn)一步生長(zhǎng)繁殖。由圖1可知，在同一aw下(除0.930外)，BITC濃度不同，黃曲霉生長(zhǎng)速率差異顯著(P<0.05)。在設(shè)置的4個(gè)aw下，黃曲霉的生長(zhǎng)速率均隨著BITC濃度的增大而減小，且aw降低也會(huì)抑制黃曲霉的生長(zhǎng)。當(dāng)花生培養(yǎng)基質(zhì)aw為0.930時(shí)，BITC對(duì)黃曲霉的MIC值最小(5 mg·L-1)。表明以花生為培養(yǎng)基質(zhì)，BITC具有抑制和減弱黃曲霉菌絲徑向生長(zhǎng)和菌落形成的能力，并且具有明顯的濃度-效應(yīng)和水分活度-效應(yīng)關(guān)系。

注：同一水分活度下，不同字母代表不同濃度BITC 之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: For the same water activity, different letters represent significant differences between differenTConcentrations of BITC (P<0.05). The same as following.圖1 以花生為培養(yǎng)基質(zhì)，BITC對(duì)不同水分活度下 黃曲霉生長(zhǎng)速率的影響Fig.1 Effect of different dose of BITC on growth rate of A. flavus at different aw with peanut as the medium substrate

2.1.2 BITC濃度在不同aw下對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)速率的影響 (以玉米為培養(yǎng)基基質(zhì)) 由圖2可知，同一aw下BITC處理濃度不同，黃曲霉的生長(zhǎng)速率有顯著差異(P<0.05)。在4個(gè)水分活度下，黃曲霉的生長(zhǎng)速率均隨著BITC處理濃度的增大而減小。在BITC未處理的玉米培養(yǎng)基質(zhì)中，黃曲霉的生長(zhǎng)速率隨水分活度的降低而減小，在培養(yǎng)基質(zhì)aw為0.930時(shí)，BITC對(duì)于黃曲霉有較好的抑菌效果，其MIC值為2.5 mg·L-1。表明以玉米為培養(yǎng)基質(zhì)，BITC具有顯著影響黃曲霉徑向生長(zhǎng)和菌落形成的作用，并且具有明顯的濃度-效應(yīng)和水分活度-效應(yīng)關(guān)系。

圖2 以玉米為培養(yǎng)基質(zhì)，BITC對(duì)不同水分活度下 黃曲霉生長(zhǎng)速率的影響Fig.2 Effect of different dose of BITC on growth rate of A. flavus at different aw with maize as the medium substrate

2.2 aw和培養(yǎng)基基質(zhì)對(duì)BITC抑制率的影響

2.2.1 aw對(duì)于BITC抑制率的影響 (以花生為培養(yǎng)基質(zhì)) 由表1可知，不同aw對(duì)BITC抑制黃曲霉生長(zhǎng)的抑制率有顯著差異(P<0.05)。aw越小，BITC對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)的抑制率越大。在5和10 mg·L-1BITC處理的花生培養(yǎng)基基質(zhì)中，aw為0.930時(shí)可以完全抑制黃曲霉的生長(zhǎng)；在15 mg·L-1BITC處理的基質(zhì)中，aw為0.960時(shí)完全抑制黃曲霉的生長(zhǎng)；而20 mg·L-1BITC處理的基質(zhì)，aw為0.980時(shí)就可完全抑制黃曲霉的生長(zhǎng)，黃曲霉的MIC值隨著水分活度的減小而減小。

2.2.2 培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)于BITC抑制率的影響 由表2可知，在5 mg·L-1BITC處理?xiàng)l件下，同一aw(0.960、0.980和0.995)下，不同培養(yǎng)基基質(zhì)對(duì)BITC抑菌率有顯著影響(P<0.05)，以玉米為培養(yǎng)基基質(zhì)BITC的抑菌率大于以花生為培養(yǎng)基基質(zhì)。以花生和玉米為培養(yǎng)基基質(zhì)完全抑制黃曲霉的生長(zhǎng)的aw分別為0.930和0.995。

2.3 BITC對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒的影響

2.3.1 BITC濃度和水分活度對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒的影響 (以花生為培養(yǎng)基質(zhì)) 由圖3可知，以花生為培養(yǎng)基基質(zhì)，在較高aw(0.995和0.980)下，AFB1含量隨著BITC濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。而在較低aw(0.960和0.930)下，BITC濃度的增大會(huì)導(dǎo)致AFB1含量降低。并且隨著aw的降低，黃曲霉產(chǎn)毒被完全抑制所需的BITC濃度越來(lái)越低，aw為0.930時(shí)，BITC濃度僅需5 mg·L-1就可以完全抑制黃曲霉的產(chǎn)毒。當(dāng)使用相同的BITC濃度時(shí)，aw降低會(huì)進(jìn)一步抑制黃曲霉產(chǎn)毒。

表1 以花生為培養(yǎng)基基質(zhì)，水分活度對(duì)不同BITC濃度抑制黃曲霉抑制率的影響Table 1 Effect of different aw on inhibition rate of A. flavus with peanut as the medium substrate /%

表2 5 mg·L-1 BITC處理?xiàng)l件下，培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)BITC 抑制黃曲霉抑制率的影響Table 2 Effect of medium substrate on inhibition rate of BITCAgainst A. flavus under 5 mg·L-1 BITC treatment /%

圖3 以花生為培養(yǎng)基質(zhì)，不同濃度BITC在 不同水分活度下對(duì)于AFB1含量的影響Fig.3 Effect of different dose of BITC on AFB1 by A. flavus at different aw with peanut as the medium substrate

2.3.2 BITC濃度和水分活度對(duì)于黃曲霉產(chǎn)毒的影響 (以玉米為培養(yǎng)基質(zhì)) 由圖4可知，在同一aw下，黃曲霉產(chǎn)毒濃度隨著BITC濃度的增大而減小。在相同BITC濃度下，aw的減弱會(huì)進(jìn)一步抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生。在aw為0.995、0.980和0.960時(shí)，BITC濃度在5 mg·L-1時(shí)其產(chǎn)毒被完全抑制；在aw為0.930時(shí)，BITC濃度在2.5 mg·L-1時(shí)可以完全抑制黃曲霉產(chǎn)毒。

圖4 以玉米為培養(yǎng)基質(zhì)，BITC濃度在 不同水分活度下對(duì)于AFB1含量的影響Fig.4 Effect of different dose of BITC on AFB1 by A. flavus at different aw with peanut as the medium substrate

2.4 BITC對(duì)黃曲霉菌絲形態(tài)變化的影響

由圖5-A、B可知，掃描電鏡下觀察到未添加黃曲霉的菌絲表面光滑、圓潤(rùn)，呈桿狀，經(jīng)BITC處理72 h后，黃曲霉的菌絲形態(tài)有明顯變化，菌絲表面有明顯破損并且有粘連趨勢(shì)。宏觀形態(tài)觀察結(jié)果表明，BITC處理可明顯抑制黃曲霉的生長(zhǎng)(圖5-a、b)。

注：微觀形態(tài)：A為未用BITC處理的黃曲霉，B為使用BITC處理的黃曲霉；宏觀形態(tài)：a為未用BITC處理的黃曲霉，b為使用BITC處理的 黃曲霉。Note: Microscopic morphology: A: Aspergillus flavus without BITC treatment, B: Aspergillus flavus treated with BITC. Macroscopic morphology: a: Aspergillus flavus without BITC treatment, b: Aspergillus flavus treated with BITC.圖5 BITC對(duì)黃曲霉形態(tài)的影響Fig.5 Effect of BITC on the morphology of A. flavus

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)BITC殺菌防霉作用的研究取得了一些進(jìn)展，Isshiki等[19]測(cè)定了BITC抑制霉菌、細(xì)菌和酵母菌的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明雖然其對(duì)各種病原微生物的抑制效果有差異，但都具有抑制作用。張建佳等[20]以微小枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為模式菌株，以未添加BITC為對(duì)照組，通過(guò)測(cè)定微生物的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)在不致死細(xì)菌的濃度下控制BITC的加入可以延長(zhǎng)微生物的延滯期，并認(rèn)為BITC對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有一定的抑制作用。本研究也證實(shí)了BITC對(duì)黃曲霉有良好的抑菌作用，且抑菌效果與其濃度呈正比。

此外，有研究表明黃曲霉的生長(zhǎng)速率與基質(zhì)的aw有關(guān)[21-22]。本研究也表明aw越低，BITC的抑菌活性越強(qiáng)，這可能是由于水分活度的降低會(huì)使培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)蒸氣壓升高，導(dǎo)致BITC的抑菌能力增強(qiáng)[23]。此外，本研究也證明了BITC在玉米培養(yǎng)基質(zhì)中的抑菌活性比在花生培養(yǎng)基質(zhì)中強(qiáng)，這可能是由于玉米中的糖含量高于高于花生，糖在基質(zhì)中也可以作為一種防腐劑[24]，但是隨著aw的降低會(huì)弱化培養(yǎng)基基質(zhì)對(duì)BITC抑菌性的影響。

另外，本研究結(jié)果還表明，低aw也會(huì)抑制黃曲霉產(chǎn)毒，這與Ahmed等[25]研究黃曲霉在其他培養(yǎng)基上的產(chǎn)毒情況一致。Antonia等[26]研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉在杏仁培養(yǎng)基中aw與黃曲霉的產(chǎn)毒成正比。此外，本研究在aw為0.995花生培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)用BITC熏蒸黃曲霉，其產(chǎn)毒呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。Sonia等[27]研究表明，玉米中牛蒡、玫瑰草和香茅、肉桂精油在高aw(0.995)下對(duì)于鐮刀菌產(chǎn)毒的抑制效果不明顯，甚至有促進(jìn)產(chǎn)毒作用。這可能由于逆境中的微生物傾向于合成更多的次級(jí)代謝產(chǎn)物[28]。本研究中，BITC熏蒸可能造成了一個(gè)逆境環(huán)境，從而可能出現(xiàn)黃曲霉的產(chǎn)毒能力增加的現(xiàn)象。在較低aw下(0.980、0.960和0.930)的花生培養(yǎng)基質(zhì)隨著BITC處理濃度的增加，黃曲霉的產(chǎn)毒能力下降。在以玉米為培養(yǎng)基基質(zhì)時(shí)，BITC濃度的增加和水分活度的下降均會(huì)抑制黃曲霉產(chǎn)毒。

掃描電鏡觀察到菌絲形態(tài)受到嚴(yán)重破壞，發(fā)生了表面黏連、不平整、皺縮等一系列變形,這是由于BITC破壞了黃曲霉菌絲體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使黃曲霉不能維持細(xì)胞固有形態(tài)，阻止菌絲體的生長(zhǎng)[29]，其內(nèi)在機(jī)制可能是BITC的強(qiáng)疏水性造成細(xì)胞膜流動(dòng)性發(fā)生變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓不平衡，抑制其酶促反應(yīng)、內(nèi)容物泄露，最后造成細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞死亡[30]。

4 結(jié)論

本研究表明，BITC能夠顯著抑制黃曲霉的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒，同時(shí)具有濃度-效應(yīng)、培養(yǎng)基-效應(yīng)和水分活度-效應(yīng)關(guān)系。BITC在培養(yǎng)基低aw時(shí)具有更強(qiáng)的抗菌活性，這為BITC增強(qiáng)抗菌活性提供了一種手段。在aw為0.930時(shí)，較花生培養(yǎng)基質(zhì)，以玉米為培養(yǎng)基基質(zhì)時(shí)黃曲霉可以取得較小的MIC值(2.5 mg·L-1)。當(dāng)花生培養(yǎng)基質(zhì)高aw(0.995，0.980)條件下，低BITC濃度會(huì)促進(jìn)黃曲霉的產(chǎn)毒，這是投入使用BITC時(shí)需要注意的問(wèn)題，也提示僅抑制黃曲霉的生長(zhǎng)來(lái)控制黃曲霉的產(chǎn)毒是不科學(xué)的。