宋軍霞 ， 祁紅兵 ，彭 璐

（1. 嶺南師范學(xué)院 地理科學(xué)學(xué)院，廣東 湛江 524048；2. 嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048）

茶是我國(guó)的國(guó)飲，是天然的綠色飲料。我國(guó)是最早發(fā)現(xiàn)茶樹和茶飲品的國(guó)家[1]。茶葉中的活性物質(zhì)有 白 蛋 白 、維 生 素 、 無(wú) 機(jī) 鹽 、 茶 多 酚 、 茶 嘌 呤 堿 、茶多糖等。茶葉生物堿具有興奮、松馳平滑肌、助消化作用；茶多糖具有防物理輻射、抗凝血、抗血栓、降低血糖及增強(qiáng)免疫功能；茶多酚具有抗氧化、抗癌、抗菌、消炎，治療痤瘡等作用[2-3]。

有關(guān)報(bào)道中提出，6 種茶葉對(duì)牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌、具核梭桿菌、中間普氏菌等口腔致 病菌都有很好的抑制作用，綠茶效果最好，紅茶效果最差[4]。也有試驗(yàn)指出六大類茶葉對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌都有抑制效果，不發(fā)酵的綠茶和中等發(fā)酵程度的烏龍茶、黃茶和白茶抑菌效果較好[5]。由此可見茶葉抗菌譜廣，抗菌效果很強(qiáng)且不易產(chǎn)生耐藥性。茶葉的主要抑菌物質(zhì)為茶多酚、茶黃素等物質(zhì)。由于不同的制作工藝致使不同茶葉的活性物質(zhì)改變，抑菌效果也不同。學(xué)者研究茶葉的抑菌活性時(shí)傾向于研究六大類茶葉，而較少研究茉莉花茶（再加工茶） 的抑菌效果。在前者的基礎(chǔ)上選取人們?cè)谌粘Ｉ钪休^喜歡飲用的青茶 （半發(fā)酵茶） 和紅茶作為研究對(duì)象。其中，鐵觀音和茉莉花茶同屬于青茶 （半發(fā)酵茶的一種），其茶多酚水平較一致。不同的是在制作過程中將茉莉花用窨制的方法濃縮在茶葉中[6]；作為一種全發(fā)酵茶，紅茶在加工過程中，沒有抑制茶多酚氧化酶的活性，從而促使兒茶素類物質(zhì)氧化成鄰醌進(jìn)而形成茶黃素等氧化聚合物[7]。

以蘇云金芽孢桿菌和大腸埃希氏菌作為指示菌，采用 6 mm 濾紙片進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)。蘇云金芽孢桿菌和大腸埃希氏菌分別是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的代表，測(cè)試 3 種茶葉，鐵觀音、紅茶、茉莉花茶對(duì)其的抑菌效果。同時(shí)，探究了不同的茶葉濃度、提取時(shí)間及提取溫度對(duì)指示菌抑菌效果的影響水平，得到較好的提取方案，方便日常生活中茶葉的沖泡，獲得更好的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 茶葉

鐵 觀 音 ， 廣 東 茗 上 茗 茶 葉 有 限 公 司 提 供 ； 紅 茶（滇紅）、茉莉花茶，廣西貴港天福茶葉有限公司提供。

1.1.2 供試菌種

蘇 云 金 芽 孢 桿 菌 、 大 腸 埃 希 氏 菌 ， 均 來(lái) 自 嶺 南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 藥品

營(yíng) 養(yǎng) 肉 湯 ， 青 島 高 科 園 海 博 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司提供；瓊脂，上海北諾生物科技有限公司提供。

1.2 儀器

FA2004B 型電子天平，上海天美天儀器有限公司產(chǎn)品；H22-X 型九陽(yáng)電磁爐，九陽(yáng)股份有限公司產(chǎn)品；GFL-23 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；HH.S21-8-S 型電熱恒溫水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；BCD-251WDGW 型海爾冰箱，青島海爾有限公司產(chǎn)品；LDZM-80KCS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；THZ-100 型恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-IBu型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SPL-250 型生化培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌種活化

在無(wú)菌條件下，將指示菌種接入斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，置于 37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12 h，然后放置在 0～4 ℃的冰箱中冷藏，備用。試驗(yàn)前從斜面上挑取菌種接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)皿中，置于 37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12 h，上述方案重復(fù) 3 次，菌種活化完畢。

2.2 菌懸液制備

在無(wú)菌條件下挑取 1 環(huán)指示菌置于 50 mL 的液體培養(yǎng)基中，在 37 ℃條件下以轉(zhuǎn)速 160 r/min 搖床培養(yǎng)12 h，放入 4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 指示菌濃度

參照文獻(xiàn)方法并稍作修改[8]。將菌液進(jìn)行濃度梯度稀釋，涂布平板，于 37 ℃條件下倒置培養(yǎng) 24 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況，根據(jù)培養(yǎng)后，菌落的生長(zhǎng)情況及抑菌圈大小明顯程度，選取合適濃度作為供試菌懸液濃度。

2.4 茶葉粗提液的制備

5.0 g 茶葉浸泡在 100 mL 煮沸的蒸餾水中，靜置30 min，得到 5 mg/mL 茶葉浸出液[9]。用濾紙將茶葉的粗提取物過濾，得到均一、穩(wěn)定的液體。

2.5 浸出液濾紙片的制備

將干凈的濾紙用打孔器打成直徑為 6.0 mm 邊緣清晰的紙片，置于 121 ℃烘箱中干熱滅菌 2 h，冷卻備用[10]。將無(wú)菌濾紙片和粗提液在無(wú)菌操作臺(tái)中浸泡30 min，濾出，風(fēng)干備用。

2.6 抑菌試驗(yàn)

試驗(yàn)采用抑菌圈法，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基制成平板，分別均勻涂布 2 種菌懸液。每個(gè)培養(yǎng)皿放置 4 片濾紙，每組 3 個(gè)平行，以不加藥液作為空白對(duì)照。于 37 ℃下倒置培養(yǎng) 24 h 后，分別測(cè)量并比較各樣品的抑菌圈直徑 （mm）。

2.6.1 茶葉濃度對(duì)抑菌效果的影響

按照 2.4 所示的試驗(yàn)方法，在基本條件為 100 ℃，30 min，制取質(zhì)量濃度分別為 1，2，3，4，5 mg/mL的茶葉提取液，用 2 種指示菌測(cè)試不同質(zhì)量濃度下的抑菌效果。

2.6.2 提取時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響

按照 2.4 方法所示，以 100 ℃，5 mg/mL 為基本條件，探究提取時(shí)間分別為 10，20，30，40，50 min下，提取時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響。

2.6.3 提取溫度對(duì)抑菌效果的影響

按照 2.4 的試驗(yàn)基礎(chǔ)，以 5 mg/mL，30 min 為基本條件，提取溫度分別取 60，70，80，90，100 ℃為提取溫度。探究不同的提取溫度下，茶葉粗提物對(duì)指示菌效果的影響，采用 2.6 中的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 茶葉種類對(duì)細(xì)菌的抑制效果的影響

3.1.1 3 種茶葉提取物對(duì)蘇云金芽孢桿菌的抑制效果

3 種茶葉提取物對(duì)蘇云金芽孢桿菌的抑制作用見圖 1。

由圖 1 可知，鐵觀音、茉莉花茶對(duì)蘇云金芽孢桿菌的抑制效果大于紅茶對(duì)蘇云金芽孢桿菌的抑制效果，抑菌效果為鐵觀音 = 茉莉花茶 > 紅茶，但 3種茶葉對(duì)蘇云金的都處于中度敏感。抑制強(qiáng)度隨著3種茶葉提取液質(zhì)量濃度的加大效果加強(qiáng)。

圖1 3 種茶葉提取物對(duì)蘇云金芽孢桿菌的抑制作用

在楊建英等人[11]的報(bào)道中提出，茶葉中主要的抑菌物質(zhì)為酚類物質(zhì)，茶多酚的抑菌機(jī)理是酚羥基和疏水的苯環(huán)與蛋白質(zhì)分子中的氨基或羧基結(jié)合，使細(xì)菌蛋白凝固、細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)菌遺傳物質(zhì) DNA 牢固結(jié)合，改變細(xì)菌的生理生化功能，從而達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的效果。鐵觀音和茉莉花茶同屬于半發(fā)酵茶的一種 （青茶），紅茶屬于全發(fā)酵茶，發(fā)酵過程中在酶的作用下，茶葉中多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化和降解，產(chǎn)生茶紅素、茶黃素、茶褐素和多糖類物質(zhì)，造成茶多酚減少，從而鐵觀音和茉莉花茶的抑菌效果大于滇紅的抑菌效果。

3.1.2 3 種茶葉對(duì)大腸桿菌的抑制作用

3 種茶葉提取液對(duì)大腸桿菌的抑制效果見圖 2。

圖2 3 種茶葉提取液對(duì)大腸桿菌的抑制效果

由圖 2 可知，在茶葉粗提取液質(zhì)量濃度為 1～5 mg/mL 時(shí)、3 種茶葉對(duì)大腸桿菌 （革蘭氏陰性菌）的抑制效果均不強(qiáng)，呈現(xiàn)出低度敏感，與茶葉種類的相關(guān)性不大。在茶葉粗提物質(zhì)量濃度為 1 mg/mL時(shí)，抑菌圈無(wú)明顯邊界。

采用大腸埃希氏菌和蘇云金芽孢桿菌作為指示菌，其中大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性菌的代表，蘇云金芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌的代表。茶葉粗提物抑菌圈直徑的判定標(biāo)準(zhǔn)是: 抑菌圈直徑 >15 mm 為高度敏感、10～15 mm 為中度敏感、7～9 mm 時(shí)為低度敏感，無(wú)抑菌圈則為不敏感。由折線圖 1、2 的試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比下可看出，鐵觀音，滇紅和茉莉花茶對(duì)蘇云金芽孢桿菌 （革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌） 抑菌圈直徑較大，綜合比較可得，抑菌效果為蘇云金芽孢桿菌 > 大腸桿菌。

通過抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果表明，茶葉粗提物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抑菌效果高于對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的抑菌效果。在茶葉粗提物質(zhì)量濃度為 5 mg/mL 時(shí)，對(duì)蘇云金芽孢桿菌的抑制作用達(dá)到中度敏感，而大腸桿菌的抑制作用處于低度敏感水平。在李輝[12]的報(bào)道指出，茶多酚對(duì)金黃葡萄球菌的抑制效果好于大腸桿菌的抑制效果，抑菌效果與茶多酚質(zhì)量濃度呈正比。而在孫昊等人[13]的試驗(yàn)顯示明茶多酚中的兒茶素對(duì)于草生歐文氏桿菌、枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和大腸桿菌均有較明顯的抑菌效果，在茶葉粗體液質(zhì)量濃度為 2 mg/mL 時(shí)出現(xiàn)抑菌圈，5 mg/mL 時(shí)抑菌圈最大。結(jié)合圖 2 試驗(yàn)結(jié)果，可以驗(yàn)證當(dāng)茶葉質(zhì)量濃度為 2 mg/mL 時(shí)，大腸桿菌才出現(xiàn)抑菌圈。

質(zhì)量濃度較低時(shí)，茶葉且 3 個(gè)平行組之間有無(wú)抑制作用的平板、增大了試驗(yàn)的誤差。為了更好地進(jìn)行試驗(yàn)，探究提取時(shí)間和提取溫度對(duì)抑菌效果的影響和找出大腸桿菌抑制效果較好的質(zhì)量濃度，故在此試驗(yàn)基礎(chǔ)上，增大了茶葉粗提取液的質(zhì)量濃度。

不同茶葉對(duì)大腸桿菌的抑菌效果見圖 3。

圖3 不同茶葉對(duì)大腸桿菌的抑菌效果

由圖 2 和圖 3 可知，在茶葉粗提物質(zhì)量濃度為1～5 mg/mL 時(shí)，對(duì)大腸桿菌的抑制效果為茉莉花茶 >滇茶 > 鐵觀音。紅茶在加工的過程中茶多酚轉(zhuǎn)化酶活性沒有被抑制，大約有 90%的茶多酚氧化成茶黃素。有研究人員表明在低質(zhì)量濃度時(shí)，大腸桿菌對(duì)茶黃素的敏感程度強(qiáng)于金黃色葡萄球菌。茉莉花茶作為一種花茶 （再加工茶），是 2 種抑菌物質(zhì) （茶多酚和茉莉花） 效果的疊加，韋英亮等人[14]的試驗(yàn)結(jié)果表明茉莉花渣黃酮對(duì)普通變形桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有一定的抗菌作用。

3.2 提取時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的影響

3.2.1 對(duì)蘇云金芽孢桿菌抑制效果的影響

按照 2.6.2 方法進(jìn)行試驗(yàn)。控制茶葉濃度和提取溫度不變，探究 3 種茶葉在不同溫度下對(duì)蘇云金芽孢桿菌的效果并繪制了折線圖。

提取時(shí)間對(duì)茶葉抑制蘇云金芽孢桿菌效果的影響見圖 4。

由圖 4 可知，在基礎(chǔ)條件為 5 mg/mL，100 ℃時(shí)，鐵觀音和茉莉花茶在提取時(shí)間為 20 min 時(shí)，對(duì)蘇云金芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑制作用。茉莉花茶在提取時(shí)間為 20 min 時(shí)，屬于高度敏感 。 在 20 min 之后，鐵觀音和茉莉花茶對(duì)蘇云金芽孢桿菌的抑制作用都有一定下降。而紅茶的最佳提取時(shí)間出現(xiàn)在 40 min左右，較 30 min 的抑菌效果有些許上升。綜上可知，提取時(shí)間對(duì)不同茶葉抑制蘇云金芽孢桿菌的效果影響依次為鐵觀音 > 茉莉花茶 >紅茶。

圖4 提取時(shí)間對(duì)茶葉抑制蘇云金芽孢桿菌效果的影響

3.2.2 對(duì)大腸桿菌 的抑制效果 影響

按照試驗(yàn) 2.6.2 所示方法進(jìn)行試驗(yàn)，探究 3 種茶葉在不同的提取時(shí)間下對(duì)大腸埃希氏菌的抑制效果。

提取時(shí)間對(duì)茶葉抑制大腸桿菌效果的影響見圖 5。

圖 5 提取時(shí)間對(duì)茶葉抑制大腸桿菌效果的影響

由試驗(yàn)結(jié)果可得，以 10 mg/mL，100 ℃為基本提取條件，鐵觀音、茉莉花茶和紅茶隨著提取時(shí)間的增加，對(duì)大腸桿菌的抑制效果也增強(qiáng)。鐵觀音由抑菌圈直徑 9.9 mm 增加至 11.9 mm。而茉莉花茶則是由 12.4 mm 增加至 13.6 mm。而紅茶的抑菌圈直徑由 8.4 mm 增加至 11.4 mm。綜上可知，提取時(shí)間對(duì)抑制大腸桿菌的影響水平鐵觀音 > 茉莉花茶 >紅茶。

3.3 提取溫度對(duì)抑菌效果的影響

3.3.1 提取溫度對(duì)抑制蘇云金芽孢桿菌的影響

按照 2.6.3 的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，探究提取溫度對(duì)茶葉提取液抑制蘇云金芽孢桿菌的效果影響。

不同提取溫度對(duì)茶葉粗提物抑制蘇云金芽孢桿菌的影響見圖 6。

由圖 6 可知，在 5 mg/mL，100 ℃的基本條件下，茉莉花茶和紅茶隨著提取溫度的上升，對(duì)蘇云金芽孢桿菌的抑制圈增大，但鐵觀音的提取效果在80 ℃達(dá)到了 15.3 mm，處于高度敏感水平。提取溫度對(duì)茶葉粗提物抑制蘇云金芽孢桿菌的影響效果為紅茶 > 鐵觀音 = 茉莉花茶。相關(guān)試驗(yàn)曾指出提取溫度為 25～80 ℃時(shí)，茶多酚保持了很好的抑菌活性[15]；大于 80 ℃時(shí)，茶多酚的抑菌活性變化趨勢(shì)最大，抑菌效果得到抑制[16]。而紅茶的主要抑菌物質(zhì)是茶黃素，茶黃素具有熱穩(wěn)定性。

3.3.2 提取溫度對(duì)抑制大腸桿菌的影響

采用 2.6.3 所示的試驗(yàn)方法，探究不同提取溫度下，茶葉粗提物對(duì)大腸桿菌的抑制效果的影響。

不同提取溫度對(duì)茶葉粗提物抑制大腸桿菌的影響見圖 7。

圖 6 不同提取溫度對(duì)茶葉粗提物抑制蘇云金芽孢桿菌的影響

圖 7 不同提取溫度對(duì)茶葉粗提物抑制大腸桿菌的影響

由圖 7 可知，提取溫度增加，紅茶和茉莉花茶的粗提物對(duì)大腸桿菌的抑制效果逐漸增加。不同的是鐵觀音在 90 ℃時(shí)提取效率達(dá)到最大值。提取溫度隨后下降。結(jié)合 3.3.1 和 3.3.2 的試驗(yàn)結(jié)果，可得出綠茶的提取條件較茉莉花茶和紅茶溫和。綜合試驗(yàn)結(jié)果可得，提取溫度對(duì)抑菌效果的影響為茉莉花茶 >綠茶 >紅茶。

3.4 茶葉提取正交試驗(yàn)

3.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表 1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

從以上單因素結(jié)果分析，提取溫度、提取時(shí)間、茶葉粗提取液濃度因素之間存在著相互作用關(guān)系。在單因素試驗(yàn)中鐵觀音對(duì)提取時(shí)間及提取溫度的敏感度較大，依據(jù)人們飲茶茶習(xí)慣，選取鐵觀音作為正交試驗(yàn)材料。以鐵觀音 （綠茶） 抗蘇云金芽孢桿菌為例，將提取溫度 （A），提取時(shí)間 （B），茶葉質(zhì)量濃度 （C） 3 個(gè)因素及其水平值作為試驗(yàn)條件，得到 L9（33）。

3.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見表 2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表 2 可知，提取時(shí)間對(duì)和茶葉質(zhì)量濃度對(duì)茶葉粗提物的抑菌效果影響最大。各因子的影響順序是B>C>A，提取時(shí)間的影響最大，茶葉濃度、提取溫度的影響效果較小。分析表中相對(duì)最好的提取方案是A2B2C3，即提取溫度 80 ℃，提取時(shí)間 20 min，質(zhì)量濃度 5 mg/mL，這與單因素結(jié)果一致。

4 結(jié)論

（1） 茶葉粗提物對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的抑制效果為高度敏感，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抑制效果為低度敏感。在茶葉質(zhì)量濃度為 2 mg/mL 時(shí)出現(xiàn)抑菌效果，最大抑菌效果為 5 mg/mL，抑菌效果與茶葉質(zhì)量濃度成呈相關(guān)。

（2） 試驗(yàn)中 3 種茶葉的抑菌效果在革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌作為指示菌種的試驗(yàn)中變化趨勢(shì)不同。在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌為指示菌的試驗(yàn)中，抑菌效果為茉莉花茶 > 鐵觀音 >紅茶。而在革蘭氏陰性細(xì)菌為指示菌的試驗(yàn)中，抑菌效果依次為茉莉花茶 >紅茶 >鐵觀音。

（3） 通過對(duì)鐵觀音的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)驗(yàn)證，得到鐵觀音的沖泡條件為質(zhì)量濃度 5 mg/mL，80 ℃水溫，沖泡 20 min。