吳玉呈，張青青

泰州市人民醫(yī)院心內(nèi)科1、內(nèi)分泌科2，江蘇 泰州 225300

近年來，肥胖的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)迅速增加，它與糖尿病、心腦血管疾病以及感染和腫瘤的發(fā)生都有著密切的關(guān)聯(lián)，給人類社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)、心理負(fù)擔(dān)。目前研究已經(jīng)證實(shí)肥胖所致的代謝紊亂及胰島素抵抗是上述并發(fā)癥產(chǎn)生和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，而肥胖狀態(tài)下內(nèi)臟脂肪組織中的代謝紊亂及慢性炎癥反應(yīng)則被認(rèn)為是其導(dǎo)致胰素抵抗的重要病理生理機(jī)制[1]。目前有研究認(rèn)為，肥胖患者體內(nèi)脂肪組織的M1型巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)脂肪組織慢性炎癥，從而導(dǎo)致胰島素抵抗及糖代謝紊亂[2]。此外，通過特異性敲除脂肪細(xì)胞的MHC-Ⅱ分子來增加脂肪組織中Treg 細(xì)胞，可以在不影響小鼠體質(zhì)量的情況下減輕肥胖引起的脂肪組織炎癥和代謝紊亂[3-4]。程序性死亡受體-1(PD-1)及其配體(PDL)具有負(fù)性調(diào)節(jié)的協(xié)同刺激信號(hào)，PD-1/PD-L1信號(hào)通路在調(diào)節(jié)代謝方面具有重要作用[5]。本研究組前期研究顯示肥胖患者的相關(guān)代謝指標(biāo)水平顯著高于正常對(duì)照組，外周血PD-1/PD-L1 水平高于正常對(duì)照組。因此推測(cè)PD1/PDL1對(duì)肥胖患者的代謝有一定的調(diào)節(jié)作用。本研究旨在探討PD-1 對(duì)肥胖相關(guān)代謝紊亂的影響，為PD-1/PD-L1 通路治療肥胖相關(guān)代謝紊亂提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只6周齡C57BL/6小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，其中10只為正常小鼠(20～25 g，普通飼料)，20 只為肥胖小鼠(大于30 g，高脂飼料)。全部小鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境溫度為(20±2)℃；空氣濕度50%～60%，小鼠自由飲水取食，12 h晝夜節(jié)律，及時(shí)清掃鼠籠及更換墊料。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法均經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(1905292號(hào))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將20 只肥胖小鼠隨機(jī)分為肥胖組和肥胖+PD-1 組，每組10 只，再取10只普通小鼠作為對(duì)照組。對(duì)照組予以普通飲食及安慰劑注射，肥胖組予以高脂飲食及安慰劑注射，肥胖+PD-1組采用高脂飲食及PD-1 抗體腹腔注射，200 μg/只，間隔7 d 給予一次，共行4次治療。

1.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法 4周后采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定三組小鼠的空腹血糖(FPG)、胰島素水平(Fins)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)和尿酸(UA)水平。肝臟甘油三酯含量檢測(cè)采用南京建成生物科技有限公司的甘油三酯測(cè)定試劑盒(酶標(biāo)儀比色法)進(jìn)行檢測(cè)。采用mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脂肪組織的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，三組間計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再采用Tukey'spost hoc 分析進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠的血糖、胰島素水平比較 干預(yù)4 周后，三組小鼠的FPG 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；肥胖組和肥胖+PD-1 組小鼠的血漿Fins 和HOMA-IR 水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而肥胖組小鼠的血漿胰島素和HOMA-IR水平分別與肥胖+PD-1 組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 三組小鼠的血糖及胰島素水平比較（±s）

表1 三組小鼠的血糖及胰島素水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.001。

組別對(duì)照組肥胖組肥胖+PD-1組F值P值HOMA-IR 14.34±2.25 80.25±12.60a 76.19±9.85a 4.443 0.001只數(shù)10 10 10 FPG(mmol/L)5.45±0.23 5.23±1.12 5.34±0.62 0.123 0.808 Fins(ng/mL)1.74±0.18 10.18±1.17a 9.71±1.01a 5.321 0.001

2.2 三組小鼠的肝腎功能及血脂比較 肥胖組小鼠的尿酸水平明顯高于對(duì)照組，肥胖+PD-1 組小鼠的尿酸水平明顯低于肥胖組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。肥胖組和肥胖+PD-1 組小鼠的甘油三酯、總膽固醇、HDL-C、LDL-C水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但肥胖+PD-1 組與肥胖組小鼠的上述指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。三組小鼠的ALT、AST、肌酐、尿素氮水平比較差異也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 三組小鼠的肝腎功能及血脂比較（±s）

表2 三組小鼠的肝腎功能及血脂比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.001；與對(duì)照組比較，bP＜0.01；與肥胖組比較，cP＜0.01。

組別HDL-C(mmol/L)59.54±3.32 74.34±5.12a 72.43±4.12a 4.321 0.001只數(shù)對(duì)照組肥胖組肥胖+PD-1組F值P值10 10 10 TC(mmol/L)70.45±3.43 202.45±12.22a 204.32±11.55a 7.212 0.001 TG(mmol/L)92.30±7.32 288.30±24.36a 274.59±25.38a 6.332 0.001 LDL-C(mmol/L)13.23±1.12 62.44±5.32a 62.39±4.24a 4.323 0.001 ALT(U/L)66.65±15.43 71.49±11.40 59.32±21.22 0.832 0.27 AST(U/L)110.51±17.46 114.87±17.39 108.13±10.27 0.435 0.617肌酐(μmol/L)16.25±1.31 16.42±2.25 15.44±1.25 0.082 0.93尿素氮(mmol/L)41.29±3.24 37.09±5.24 40.49±6.59 0.898 0.122尿酸(mmol/L)104.78±25.42 143.56±29.29b 111.01±28.26c 3.434 0.001

2.3 三組小鼠的肝臟重量及內(nèi)臟脂肪含量比較 肥胖組小鼠肝臟重量及肝臟重量/體質(zhì)量比值明顯高于對(duì)照組，肥胖+PD-1 組小鼠肝臟重量及肝臟重量/體質(zhì)量比值明顯低于肥胖組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)，肥胖組小鼠的肝臟甘油三酯含量明顯高于對(duì)照組，肥胖+PD-1 組小鼠肝臟甘油三酯含量明顯低于肥胖組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。肥胖組小鼠附睪白色脂肪組織(eWAT)重量及eWAT 重量/體質(zhì)量比值明顯高于對(duì)照組，肥胖+PD-1 組小鼠eWAT 重量及eWAT 重量/體質(zhì)量比值明顯于肥胖組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 三組小鼠的肝臟重量及eWAT重量比較（±s）

表3 三組小鼠的肝臟重量及eWAT重量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與對(duì)照組比較，bP＜0.01；與對(duì)照組比較，cP＜0.05；與肥胖組比較，dP＜0.01；與肥胖組比較，eP＜0.05。

肝臟甘油三酯含量(mmol/gprot)3.21±0.56 6.23±1.23b 4.32±0.65d 3.127 0.003組別對(duì)照組肥胖組肥胖+PD-1組F值P值只數(shù)10 10 10肝臟重量(mg)911.23±79.43 1082.34±133.28a 904.34±60.23d 4.211 0.001肝臟重量/體質(zhì)量(mg/g)38.33±2.23 43.45±5.56c 39.73±2.32e 2.287 0.027 eWAT重量(mg)196.20±15.10 744.20±113.61a 264.02±24.26cd 5.323 0.001 eWAT重量/體質(zhì)量(mg/g)8.23±0.45 30.23±4.23a 11.21±1.21bd 4.665 0.001

2.4 三組小鼠脂肪組織的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況比較 肥胖組小鼠M1 巨噬細(xì)胞標(biāo)記物(Itgax)和F4/80(Adgre1)mRNA 水平明顯高于對(duì)照組，肥胖+PD-1 組小鼠Itgax 和Adgre1 mRNA 水平明顯低于肥胖組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；肥胖+PD-1組小鼠的M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記物(Mrc1)mRNA水平明顯高于肥胖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4。

表4 三組小鼠脂肪組織的巨噬細(xì)胞標(biāo)記物mRNA水平比較（±s）

表4 三組小鼠脂肪組織的巨噬細(xì)胞標(biāo)記物mRNA水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；對(duì)照組比較，bP＜0.05；與肥胖組比較，cP＜0.01；與肥胖組比較，dP＜0.01。

組別對(duì)照組肥胖組肥胖+PD-1組F值P值Mrc1 1.02±0.12 0.89±0.14 1.27±0.11d 5.563 0.001只數(shù)10 10 10 Itgax 1.07±0.13 1.57±0.23a 0.87±0.15c 5.231 0.001 Adgre1 1.03±0.11 1.37±0.13b 0.81±0.12c 2.317 0.027

3 討論

肥胖會(huì)導(dǎo)致糖耐量異常、血脂水平升高、內(nèi)臟脂肪含量顯著增加以及胰島素抵抗，本研究結(jié)果提示三組空腹血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但肥胖小鼠的空腹胰島素水平明顯高于對(duì)照組，考慮與肥胖引起顯著胰島素抵抗有關(guān)，這與既往研究結(jié)果相似[6-7]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，盡管肥胖對(duì)肝功能、肌酐水平無明顯影響，但能顯著增加尿酸水平。目前肥胖引起尿酸水平增加的機(jī)制不明，可能與糖皮質(zhì)激素過量引起的高胰島素血癥有關(guān)，因?yàn)楦咭葝u素血癥減少了尿酸在腎臟近端腎小管的排泄，導(dǎo)致血尿酸水平升高[8-9]。既往研究顯示糖皮質(zhì)激素引起的肥胖與食欲增加有關(guān)，一項(xiàng)慢性應(yīng)激的動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素能夠通過一系列相互關(guān)聯(lián)的杏仁核-邊緣系統(tǒng)-下丘腦事件導(dǎo)致對(duì)脂肪和碳水化合物的渴望增加[10]。

在本研究中，PD-1 抗體能夠改善肥胖引起的內(nèi)臟脂肪沉積。研究發(fā)現(xiàn)，PD-1 抗體可通過激活M2型巨噬細(xì)胞，增加白色脂肪組織中脂肪的利用和褐色變[11]。目前PD-1 抗體對(duì)脂代謝的作用觀點(diǎn)不統(tǒng)一，有些學(xué)者認(rèn)為PD-1 抗體可減少血漿甘油三酯，增加HDL-C[12]，但有些研究顯示PD-1 抗體對(duì)甘油三酯和HDL-C沒有顯著影響[13]，這可能與上述研究所采用的不同動(dòng)物模型有一定相關(guān)性。高脂小鼠模型的研究得到陽性結(jié)果的可能性要高于非高脂模型。此外，上述研究采用的PD-1 劑量及干預(yù)時(shí)間也有所差異，這可能也是結(jié)論不一的原因之一。本研究顯示PD-1抗體并不能改善肥胖引起的高脂血癥，與上述陰性結(jié)果研究存在一些相同點(diǎn)，如動(dòng)物模型都不是直接的高脂模型，且干預(yù)時(shí)間較短。

據(jù)研究報(bào)道，脂肪組織浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞可能是促炎性細(xì)胞因子的主要來源[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠脂肪組織也存在巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，特別是M1 巨噬細(xì)胞，這可能是肥胖相關(guān)代謝紊亂的原因之一。本研究還發(fā)現(xiàn)PD-1抗體能改善肥胖小鼠脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，并促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2 型巨噬細(xì)胞，提示PD-1 抗體可以改善肥胖相關(guān)的脂肪組織慢性炎癥。

綜上所述，PD-1 抗體能夠改善肥胖小鼠的內(nèi)臟脂肪沉積和尿酸水平升高，抑制巨噬細(xì)胞在脂肪組織的浸潤(rùn)，有望成為預(yù)防和治療肥胖相關(guān)代謝紊亂的新方向。