劉文勝 綜述 柳湘潔審校

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院老年病科，湖北 武漢 430077

阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)是一種與衰老相關的最常見的神經(jīng)退行性疾病，目前全世界范圍內(nèi)有超過4 000萬人患此病[1-2]，其已成為一個重大的公共衛(wèi)生問題，給個人、社會和經(jīng)濟造成沉重負擔[3]。1907 年，德國精神科醫(yī)生和神經(jīng)病理學家ALOIS ALZHEIMER博士首次描述了阿爾茲海默病[4]。根據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織(WHO)的研究，阿爾茲海默病占老年癡呆癥病例的60%～70%，到2050 年其發(fā)病率估計增加兩倍[5-6]。目前普遍認為，淀粉樣前體蛋白(APP)裂解的變化、APP片段和β-淀粉樣蛋白(Aβ)的產(chǎn)生和沉積是導致阿爾茲海默病的可能原因，被稱為淀粉樣蛋白級聯(lián)假說[4]。Aβ是阿爾茲海默病最主要的病理學特征和診斷指標，可以用來與其他伴有癡呆癥狀的神經(jīng)退行性疾病區(qū)分[7]。此外，tau磷酸化學說、膽堿能學說、胰島素假說、氧化應激學說等也被認為是阿爾茲海默病可能的致病機制[8-9]。盡管患有AD的患者人數(shù)在不斷增長，但在美國目前僅批準了五種方案來治療AD的認知癥狀，其中最近的一項(美金剛)已于十多年前獲得批準[10]。這些藥物包括三種膽堿酯酶抑制劑(多奈哌齊，加蘭他敏和卡巴拉汀)和一種N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑(美金剛)[11]。在過去的15年中，很多科研機構在研發(fā)治療AD的藥物，但大多數(shù)都失敗了。目前，大多數(shù)已被確診為AD的患者僅以被動接受藥物治療為主，且治療效果不佳。因此，尋找新型可延緩或逆轉AD的藥物仍是目前的重中之重。

circRNAs 是一類內(nèi)源性的環(huán)狀非編碼RNA 分子。CircRNAs 以前被認為是轉錄后加工過程中錯誤剪接事件衍生的產(chǎn)物，并且豐度低，功能潛力小[12]。但是，最近有越來越多的證據(jù)表明，circRNAs 在整個真核細胞中分布廣泛，種類繁多，它們具有多種生物學功能，并且在各種疾病(例如神經(jīng)退行性疾病和癌癥)中發(fā)揮著潛在的重要作用[13-15]。CircRNAs已在許多生物學領域得到廣泛認可和重視。先進的研究表明，大腦中有成千上萬的circRNAs[16-17]。隨著深度測序技術的發(fā)展，臨床已經(jīng)鑒定出其他新穎的circRNAs，并顯示與腦部疾病有關。最近的研究表明，circRNAs 在神經(jīng)退行性疾病中可能起重要作用，包括阿爾茲海默病[18-20]。本篇綜述將討論circRNA的分類和功能以及circRNAs在阿爾茲海默病中的研究進展。

1 circRNA的分類

大多數(shù)circRNAs 是通過反向剪接由前體mRNA(pre-mRNA)形成的。隨著測序技術的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定了幾種類型的circRNAs。根據(jù)其特征可以分為四個亞型，即外顯子型circRNAs(ecircRNA)、環(huán)狀內(nèi)含子型circRNAs (ciRNA)、外顯子-內(nèi)含子型circRNAs(EIciRNA)和tRNA內(nèi)含子型circRNA(tricRNA)。

1.1 EcircRNA EcircRNA主要位于細胞質(zhì)中，主要來源于單個或多個外顯子，通過轉錄產(chǎn)物的反向拼接形成的。5'剪接位點(剪接供體位點)與3'剪接位點(剪接受體位點)相連，產(chǎn)生包含外顯子和內(nèi)含子的套索結構[21]。套索狀結構中的內(nèi)含子被去除后外顯子通過和磷酸二酯鍵連接形成ecircRNA 分子[22]。另外，內(nèi)含子中的Alu重復序列可以彼此相互作用，以促進反向剪接[27]。

1.2 CiRNA 在形成CiRNA 的過程中，內(nèi)含子從前mRNA分子中切除，并通過兩個末端之間的獨特2'-5'連接進行進一步連接，然后修剪尾部形成CiRNA。CiRNA 主要存在于細胞核中，僅包含內(nèi)含子。其加工取決于共有基序，這些基序包含靠近5'剪接位點的富含7-nt GU 的元素和靠近分支點位點的富含11-nt C的元素[23]。

1.3 EIciRNA 與EcircRNA(僅包含外顯子)不同，EIciRNA 既包含外顯子又包含內(nèi)含子。一個外顯子的5'下游位點(剪接供體位點)通過5'-3'磷酸二酯鍵連接到另一個外顯子的3'上游位點(剪接受體位點)，并受套索驅(qū)動的環(huán)化作用。在反向剪接過程中，內(nèi)含子被保留在外顯子之間[24-25]。

1.4 TricRNA TricRNA 通 過pre-tRNA 剪 接 形成。通過tRNA 剪接酶將內(nèi)含子從前tRNA 分子中去除。隨后，在內(nèi)含子的末端形成具有3'-5'磷酸二酯鍵的閉環(huán)結構，產(chǎn)生tricRNA[26]。

2 CircRNAs的功能

2.1 CircRNAs調(diào)節(jié)線性RNA的轉錄 CircRNAs可以影響線性RNA的剪接，并在選擇性剪接和轉錄中發(fā)揮關鍵作用。外顯子是CircRNAs 的主要來源，而CircRNAs 的合成過程與線性RNA 的典型剪接競爭，因為外顯子對于通過典型剪接形成的線性mRNA 也是必不可少的[27]。因此，當CircRNA和線性mRNA的形成都需要相同的外顯子時，這兩個過程將相互競爭。CircRNAs 還可以與細胞質(zhì)中的RNA 結合蛋白(RBPs)或與RNA 相關的蛋白相互作用，形成RNA-蛋白復合物，影響基因轉錄或蛋白質(zhì)翻譯。CircRNA-RBP 復合體可以調(diào)控靶基因的轉錄和剪接，改變線性mRNA的剪接模式和mRNA穩(wěn)定性，并啟動其翻譯。此外，CircRNAs 可以與RBPs 相互作用以募集miRNA，從而影響下游靶mRNA的翻譯[27]。由內(nèi)含子形成的CircRNAs，例如CiRNA 和EIciRNA，可以調(diào)節(jié)其親本基因的表達。在細胞核中，發(fā)現(xiàn)CircRNAs 通過與U1小核核糖核蛋白(U1 snRNP)和RNA聚合酶Ⅱ相互作用來調(diào)節(jié)轉錄[28-29]。EIciRNA 與U1 snRNPs 相互作用形成EIciRNA-U1 snRNPs復合物，并在其親本基因啟動子處與RNA聚合酶Ⅱ相互作用，以增強這些基因的表達[30]。

2.2 CircRNAs充當miRNA的“海綿” CircRNAs可以作為miRNA 的海綿，抑制miRNA 介導的mRNA表達[31]。作為競爭性內(nèi)源RNA，CircRNAs 可通過與miRNA 反應元件結合而與miRNAs 競爭。CircRNAs包含一個或多個miRNA 結合位點，從而減少了miRNA介導的基因抑制表達，進而調(diào)控下游靶基因表達。

2.3 CircRNAs充當?shù)鞍踪|(zhì)翻譯的模板 大多數(shù)CircRNAs 都是由編碼片段產(chǎn)生的。因此，一些CircRNAs 可能具有編碼蛋白質(zhì)的潛力。5'7-甲基鳥苷帽結構和3'poly(A)尾部是正常的線性mRNA 翻譯所必需的。然而，由于circRNAs 既缺少帽蓋又沒有poly(A)尾巴，因此它們似乎沒有合適的結構來支持翻譯起始。最近的研究表明，CircRNAs 也可以翻譯成蛋白質(zhì)或肽。為了將CircRNA翻譯成為功能性蛋白，它必須包含一個開放閱讀框和一個內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)。IRES是內(nèi)源性CircRNAs 中的特殊核苷酸序列，可獨立于5'帽結構啟動蛋白質(zhì)翻譯[32]。一旦在其IRES處啟動翻譯，CircRNA就會充當?shù)鞍踪|(zhì)翻譯的模板。

2.4 CircRNAs與蛋白質(zhì)相互作用 CircRNAs可以與不同的蛋白質(zhì)相互作用形成特定的CircRNA-蛋白質(zhì)復合物(circRNPs)，隨后會影響相關蛋白質(zhì)的作用方式。例如，circMbl可與甘露糖結合凝集素(MBL)相互作用，并充當MBL 和circMbl 產(chǎn)生的負反饋調(diào)節(jié)劑[27,33]。MBL和circMbl由相同的基因位點產(chǎn)生，并且在它們的產(chǎn)生之間存在負調(diào)節(jié)反饋。當以過量濃度存在時，MBL結合至MBL pre-mRNA并導致其反向剪接形成circMbl。然而，當MBL蛋白與circMbl結合而濃度降低時，沒有足夠的MBL 與circMbl 相互作用。此時，CircMbl的產(chǎn)生就會減少。

3 CircRNAs在AD中的作用

長期以來，AD患者大腦中β淀粉樣蛋白(Aβ)的過度積累一直被認為是AD病理的最重要原因之一[34-35]。AD患者大腦中Aβ的異常水平導致斑塊的形成，并進一步導致由小膠質(zhì)細胞激活介導的神經(jīng)元炎癥反應，從而促進AD進展[36]。此外，越來越多的證據(jù)表明，氧化應激和功能障礙的自噬在Aβ的產(chǎn)生中起著至關重要的作用，并可能加速AD 的發(fā)展[37-38]。目前研究發(fā)現(xiàn)，一些CircRNAs 在神經(jīng)炎癥、氧化應激和自噬以及Aβ的產(chǎn)生和降解中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

3.1 CircRNAs與神經(jīng)炎癥 神經(jīng)炎癥通常被認為是由損傷或淀粉樣斑塊形成引起的神經(jīng)膠質(zhì)活化的結果，進一步導致腦功能惡化，這與AD 風險增加有關[39]。CircRNAs 已被報道參與神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)。研究已證實，CircRNA_0000950在AD的細胞凋亡、神經(jīng)突生長和神經(jīng)炎癥中起重要作用。此外，YANG等[40]證明cir cRNA_0000950 充當miR-103 海綿來減少miR-103 的表達，進一步提高細胞AD 模型中前列腺素氧化環(huán)化酶2 的水平。盡管circRNA_0000950的表達不受神經(jīng)元細胞中Aβ1-42誘導的影響，但是circRNA_0000950 的過表達促進神經(jīng)元細胞凋亡，抑制神經(jīng)突生長并提高炎性細胞因子水平，而circRNA_0000950 的敲除后出現(xiàn)相反作用。因此circRNA_0000950的敲除是治療AD的一種潛在治療手段。

3.2 CircRNAs與氧化應激 氧化應激已被認為是導致衰老和AD進展的一個重要因素[38]。活性氧的增加會促進Aβ蛋白前體的表達和加工，導致Aβ積累并激活大腦中各種信號通路，從而進一步促進AD 的發(fā) 展[41]。HUANG 等[42]研 究 表 明，mmu_circRNA_013636 和mmu_circRNA_012180 表達的調(diào)節(jié)與AD氧化應激損傷的預防有關。他們發(fā)現(xiàn)SAMP8(快速老化動物模型)小鼠海馬組織中mmu_circRNA_013636 增加，mmu_circRNA_012180 減少；然而，三七總皂苷(PNS)的治療逆轉了AD小鼠大腦中這些CircRNAs的表達變化。進一步的功能分析表明，mmu_circRNA_013636 和mmu_circRNA_012180 參與代謝、神經(jīng)營養(yǎng)因子和糖酵解以及磷脂酰肌醇信號通路，這些已被證明有助于AD 的發(fā)病機理。上述結果表明，mmu_circRNA_013636 和mmu_circRNA_012180 表 達的調(diào)節(jié)可能通過抗氧化應激機制參與PNS對AD的治療作用，這表明這些CircRNAs是AD治療藥物開發(fā)的潛在靶標。

3.3 CircRNAs與自噬 自噬是長壽蛋白質(zhì)和細胞器的主要細胞降解途徑。自噬體的積累是AD 的早期神經(jīng)病理學特征，直接影響Aβ代謝。研究表明，特定CircRNAs 的表達與AD 中的自噬密切相關。例如，最近有報道稱CircNF1-419 與AD 中的自噬密切相關[43]。老年SAMP8 (快速老化動物模型)小鼠中CircNF1-441的過表達會增強自噬，進一步降低tau 蛋白、p-tau 蛋白、Aβ1-42蛋白和載脂蛋白E(APOE)的水平，并影響與衰老相關的調(diào)節(jié)子p21、p35/25 和p16 的表達。 此外，CHEN 等[43]證實circNF1-419 通過與動力蛋白-1 (Dynamin-1)和銜接蛋白2B1(AP2B1)相互作用來調(diào)節(jié)自噬。CircNF1-441 結合Dynamin-1 和AP2B1影響它們的mRNA剪切、穩(wěn)定和翻譯。這些結果表明，circNF1-419 可通過與Dynamin-1 和AP2B1相互作用增強自噬，從而延遲AD 的發(fā)展。其他研究表明，CircRNAs可能與自噬小體組裝或囊泡運輸介導的途徑有關。HUANG 等[44]的研究發(fā)現(xiàn)10 個月大的SAMP8 (快速老化動物模型)小鼠的mmu_circRNA_017963 水平與對照組小鼠相比明顯降低，表明該CircRNA 與AD 發(fā)病機理有關。進一步的分析表明，mmu_circRNA_ 017963 可 能與mmu_miR_7033-3p 結合，并且它可能參與自噬小體組裝、胞吐作用和突觸小泡循環(huán)的生物學過程，這些已被證明與AD 的發(fā)病機理有關。

3.4 CircRNAs與Aβ產(chǎn)生 AD病理學的一個主要特征是由聚集的淀粉樣蛋白Aβ組成的斑塊的形成。減少Aβ的產(chǎn)生一直是近年來AD 實驗研究的主要目標[34-45]。一些CircRNAs 已被鑒定出直接或間接參與Aβ生成的調(diào)節(jié)，表明它們在AD病理中起著重要的作用。例如，miR-7的circRNA海綿(ciRS-7)以前被認為是miR-7 的內(nèi)源性海綿，最近有報道稱它在AD 的發(fā)病機制中起著至關重要的作用。先前的研究表明，ciRS-7 在人腦中富集，但在AD 患者的腦中表達下調(diào)。ZHAO等[46]發(fā)現(xiàn)，ciRS-7改變了泛素蛋白連接酶A(UBE2A)的表達，這對于清除AD 中的Aβ是至關重要。在散發(fā)性AD 中，ciRS-7 下調(diào)并且miR-7 的水平升高，導致UBE2A 表達降低[39]。UBE2A 在泛素26S蛋白酶體系統(tǒng)中起著中央效應器的作用，通過蛋白水解促進Aβ的清除。然而，在散發(fā)性AD 腦中，UBE2A已耗盡，這進一步誘導了淀粉樣蛋白Aβ的積累和老年斑的沉積。最近，SHI等[47]研究表明，ciRS-7在調(diào)節(jié)β-分泌酶(BACE1)和APP蛋白水平中也起著至關重要的作用。其中，BACE1 已被確定為AD病理生理學中產(chǎn)生Aβ肽的關鍵酶。BACE1 對APP 的裂解誘導Aβ肽釋放并引發(fā)Aβ斑塊形成[48]。SHI 等[47]發(fā)現(xiàn)ciRS-7 不影響APP 和BACE1 的mRNA 水平，而是降低APP 和BACE1的蛋白水平。他們的進一步研究表明，在人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y中ciRS-7 過表達會上調(diào)泛素羧基末端水解酶L1 (UCHL1)的mRNA 和蛋白水平，從而通過蛋白酶體和溶酶體途徑，加速APP 和BACE1 的降解，并減少Aβ的產(chǎn)生[47]。因此，表明ciRS-7具有潛在的神經(jīng)保護作用。

LU 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA HDAC9 也與Aβ生成的調(diào)節(jié)有關。CircHDAC9 在輕度認知障礙(MCI)和AD 患者的血清中顯著低于其他正常的個體，并且在AD 的小鼠和細胞模型中也降低。此外，研究表明cir cHDAC9充當miR-138海綿，可顯著降低miR-138的水平，同時增加沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin1，Sirt1)的蛋白表達。先前有研究已經(jīng)證實，Sirt1在減少Aβ的積累和減輕線粒體功能障礙方面發(fā)揮著重要的作用[50]。LU 等[49]發(fā)現(xiàn)，在體外實驗中CircHDAC9表達可以減少過量Aβ肽的產(chǎn)生，這表明cir cHDAC9可能是AD的治療靶標。

ZHANG 等[46]研究表明，circRNA KIAA1586 可以作為競爭性內(nèi)源RNA 發(fā)揮功能，吸附miR-29b、miR-101 和miR-15a，這可能與AD 的病理過程有關。 PEREIRA 等[51]研究表明，在AD 細胞模型中，miR-29b 的過表達抑制了BACE1 的mRNA 和蛋白表達，并降低了Aβ42的水平。LONG等[52]證實了miR-101可以與APP的3'-UTR結合以降低AD中APP的水平。HEBERT 等[53]發(fā)現(xiàn)散發(fā)性AD 患者的表達miR-15a 的大腦皮質(zhì)發(fā)生了顯著變化，并預測miR-15a 可以結合并調(diào)節(jié)BACE1 和APP。這些結果表明，circRNA KIAA1586是治療AD潛在的靶標。

4 結語

CircRNAs具有高度穩(wěn)定性，能夠穩(wěn)定地存在于血漿和腦脊液中，因此具有診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾病的巨大潛力。最近的一項研究表明，CircRNAs 表達水平與AD的神經(jīng)病理學和臨床嚴重評估密切相關[18]。DUBE等[18]實驗已經(jīng)表明，CircRNAs 的表達在AD患者實質(zhì)性癥狀發(fā)作之前已經(jīng)發(fā)生了改變，并且它們在血漿中穩(wěn)定存在和在外泌體中富集。這一發(fā)現(xiàn)表明，CircRNAs 可以作為癥狀前和癥狀性AD 以及潛在的其他神經(jīng)退行性疾病的外周生物標志物。

CircRNA與特定的miRNA共享結合位點，這使它們能夠充當miRNA海綿并抑制這些miRNA的調(diào)節(jié)功能。同時，CircRNAs 在Aβ的產(chǎn)生和代謝、氧化應激、自噬和神經(jīng)炎性途徑中起重要作用。此外，一些CircRNA可用作具有AD診斷潛在價值的新型生物標志物，如CircRNA_0000950 、mmu_circRNA_013636、mmu_circRNA_012180、CircNF1-419 和ciRS-7等。

如上所述，CircRNAs 在AD 中起關鍵作用，并且可能具有治療AD 的潛力。更多的CircRNAs 的表達特征和功能應在未來的研究中得以探究，以開發(fā)AD的新型治療靶標和生物標志物。