逯朝陽(yáng)，姚瑤，2，郭春玲,2 綜述 楊濱，李保 審校

1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，山西 太原 030013；

2.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是一種慢性進(jìn)行性心血管系統(tǒng)疾病，其特征是大動(dòng)脈內(nèi)脂質(zhì)和纖維成分的積累，是老年人最常見(jiàn)的死亡原因之一。脂蛋白代謝紊亂和炎癥相關(guān)的機(jī)制一直是As研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[1]。低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)作為血漿脂蛋白的重要組成部分，參與了As發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，是As發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素[2]。LDL-C主要通過(guò)低密度脂蛋白受體(LDLR)途徑從血漿中清除，LDLR 主要位于肝臟中，其升高在增強(qiáng)LDL-C 清除率方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，并與降低心血管系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[3-4]。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是前蛋白酶轉(zhuǎn)化酶家族蛋白酶K 亞家族的第9 個(gè)成員，目前已證實(shí)，PCSK9可通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝而影響血脂，主要是在細(xì)胞表面與LDLR 的表皮生長(zhǎng)因子前體同源結(jié)構(gòu)域A(EGF-A)相互作用，強(qiáng)力抑制LDLR水平，限制LDLR介導(dǎo)的脂蛋白攝取，使得LDL-C在血漿中堆積，參與As的發(fā)生發(fā)展[3，5]。PCSK9還通過(guò)其他多種途徑參與As的發(fā)生發(fā)展，本文對(duì)PCSK9 作為重要調(diào)控因子如何介導(dǎo)As的發(fā)生發(fā)展，以及對(duì)試圖通過(guò)干預(yù)PCSK9 來(lái)防治As的相關(guān)研究進(jìn)行了綜述與展望。

1 PCSK9概述與表達(dá)

PCSK9 基因于2003 年初首次被報(bào)道[6]，前蛋白是生物活性蛋白和多肽通過(guò)有限的蛋白質(zhì)水解而獲得的基本單位，前蛋白轉(zhuǎn)化酶是一組絲氨酸蛋白酶，其特點(diǎn)是能夠水解同源底物中的肽鍵并激活本身[7]。自1990 年以來(lái)，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了8 種負(fù)責(zé)組織特異性處理分泌前體的哺乳動(dòng)物前蛋白轉(zhuǎn)換酶(PCs)，PCSK9則是前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族的第9個(gè)成員。

PCSK9 主要在肝、胸腺和脾臟、胰腺等中表達(dá)。在嚙齒動(dòng)物中，PCSK9 主要在成年肝細(xì)胞中表達(dá)，在小腸和腎臟中表達(dá)較少，在發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中短暫表達(dá)[8]。在KIM 等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)，PCSK9 與胸腺和脾臟CD4+T細(xì)胞群的改變有關(guān)，小鼠中PCSK9的缺失導(dǎo)致循環(huán)中IL-17 的減少和脾臟中Th17 細(xì)胞數(shù)量的減少。PCSK9 在胰腺中也控制LDLR 的表達(dá)，可能有助于維持適當(dāng)?shù)纳砥胶猓韵拗萍?xì)胞中膽固醇超載，而這種效應(yīng)與循環(huán)PCSK9 無(wú)關(guān)，可能與局部產(chǎn)生的PCSK9有關(guān)[10]。

2 PCSK9與脂代謝紊亂

2003年前，已知的高膽固醇血癥只有兩種常染色體顯性形式：家族性高膽固醇血癥(FH)，由編碼LDL受體(LDLR)的基因突變引起；家族性載脂蛋白-100(APOB-100)突變引起的載脂蛋白-b100缺陷(FDB)，該突變破壞了LDL與LDLR的結(jié)合。這兩種疾病都會(huì)導(dǎo)致血漿LDL-C水平升高和動(dòng)脈中膽固醇的積累，特別是冠狀動(dòng)脈(冠狀動(dòng)脈粥樣硬化)。2003年，ABIFADEL等[6]發(fā)現(xiàn)PCSK9基因后，多項(xiàng)研究證實(shí)，PCSK9突變?cè)陲@性高膽固醇血癥中所占的比例遠(yuǎn)低于LDLR 和APOB突變，因PCSK9突變而導(dǎo)致高膽固醇血癥的受試者中，僅有的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與脂蛋白代謝相關(guān)，提示PCSK9主要在膽固醇代謝通路中發(fā)揮作用[11-13]。

已有證據(jù)表明，血漿脂蛋白a[Lp(a)]濃度與冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)生密切相關(guān)[1，14]。Lp(a)是一種密度介于高密度和低密度之間的特殊脂蛋白，是一種類(lèi)似低密度脂蛋白(LDL)的顆粒，含有載脂蛋白(a)(apoA)與載脂蛋白b(apoB)[15]。Lp(a)富含膽固醇，可以沉積于血管壁，促使動(dòng)脈粥樣硬化形成血栓，是冠心病的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。LDL-C 主要通過(guò)LDLR 途徑從血漿中清除。LDL-C 與LDLR 結(jié)合后，LDL 和LDLR 被內(nèi)化到網(wǎng)格蛋白包覆的凹坑中，并在溶酶體中降解。當(dāng)LDLR 被循環(huán)回細(xì)胞膜時(shí)，PCSK9與LDLR結(jié)合，介導(dǎo)LDLR在溶酶體中的內(nèi)化和降解，減少LDLR的循環(huán)，進(jìn)而減少血漿中LDL-C的清除[3，16]。此外，O'DONOGHUE 等[15]匯總了25 096 例患者參與傅里葉試驗(yàn)結(jié)果，在接受依洛尤單抗[evolocumab(一種PCSK9 抑制劑)]治療48 周的患者測(cè)試血漿脂質(zhì)后發(fā)現(xiàn)，Lp(a)和LDL-C 水平從基線(xiàn)到48 周后相比，百分比均有下降，變化呈中度正相關(guān)性，且Lp(a)和LDL-C 水平較低的患者發(fā)生主要冠脈事件的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)降低，由此證實(shí)PCSK9 抑制劑可以通過(guò)降低基線(xiàn)Lp(a)濃度減少主要冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)生。此外，載脂蛋白b(apoB)是除了高密度脂蛋白以外的其他脂蛋白的主要結(jié)構(gòu)蛋白，起細(xì)胞識(shí)別和攝取LDL 的作用，PCSK9 的缺失降低了apoB 的生物合成率[17]。

除上述外，ASON 等[18]發(fā)現(xiàn)在CETP 轉(zhuǎn)基因小鼠中，PCSK9抑制劑介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化疾病程度的減輕需要LDLR和載脂蛋白e(apoE)的共同參與，增加肝臟LDLR的表達(dá)。TAVORI等[19]發(fā)現(xiàn)人PCSK9 也會(huì)在動(dòng)脈壁內(nèi)積聚，直接影響動(dòng)脈粥樣硬化病變的大小和組成，而不依賴(lài)于這種血脂和脂蛋白的變化，這些作用依賴(lài)于LDLR，但與apoE無(wú)關(guān)。

3 PCSK9與炎癥

3.1 內(nèi)皮細(xì)胞 內(nèi)皮功能障礙和炎癥是As早期發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵。研究表明，凝集素樣氧化LDL受體-1 (LOX-1)與氧化LDL (ox-LDL)在血管中結(jié)合，在內(nèi)皮損傷中發(fā)揮重要作用，高水平的LDL-C，特別是以ox-LDL 形式出現(xiàn)的LDL-C，會(huì)通過(guò)激活LOX-1 增加細(xì)胞內(nèi)活性氧應(yīng)激(ROS)的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)炎癥的發(fā)展[20]。SUN等[17]證實(shí)，缺乏PCSK9 的誘導(dǎo)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞中TLR2、LOX-1、ICAM-1、CCL2、CCL7、IL-6、IL-1 蛋白、Beclin-1、p62和TRAF6 編碼基因的表達(dá)會(huì)顯著降低(＞4 倍)。此外，高脂肪飲食喂養(yǎng)的apoE 基因敲除小鼠，沉默PCSK9 基因可以在不影響其血漿膽固醇水平的情況下，直接抑制As血管炎癥進(jìn)程及抑制Toll 樣受體4/核因子κB(TLR4/NF-κB)信號(hào)通路[21]。基于上述證據(jù)，有理由認(rèn)為，在內(nèi)皮細(xì)胞中，PCSK9可以通過(guò)除LDLR和apoE 以外的途徑啟動(dòng)促進(jìn)As 的進(jìn)程，既可以激活目前已證實(shí)的LOX-1途徑，又可以影響未明確的炎癥因子調(diào)控途徑，共同促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的發(fā)生發(fā)展，啟動(dòng)并加劇As的進(jìn)程。

3.2 單核/巨噬細(xì)胞 當(dāng)血管中炎癥發(fā)生時(shí)，單核細(xì)胞可浸潤(rùn)動(dòng)脈粥樣硬化病變部位，分泌大量促炎細(xì)胞因子，成熟為活化的巨噬細(xì)胞，加速動(dòng)脈炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。據(jù)報(bào)道，在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中起核心作用的為兩種不同的巨噬細(xì)胞群體：促炎(M1細(xì)胞)和抗炎(M2細(xì)胞)[22]，其中M1 巨噬細(xì)胞表達(dá)多種促炎介質(zhì)，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素家族如IL-1、IL-6、IL-12和蛋白水解酶3。研究證實(shí)，PCSK9 與NLRP3/Caspase-1 的作用是相互的[23-24]，一方面，PCSK9 通過(guò)啟動(dòng)線(xiàn)粒體DNA (mtDNA)損傷，激活NLRP3 炎癥小體信號(hào)(NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1 和IL-18)，進(jìn)而誘導(dǎo)Caspase-1 依賴(lài)的焦解作用，同時(shí)在決定PCSK9 分泌方面，NLRP3炎癥小體可以通過(guò)IL-1小分子細(xì)胞發(fā)揮重要作用，特別是在高脂肪飲食的情況下更為顯著。但是PCSK9 與線(xiàn)粒體損傷、分裂或融合等，及其在巨噬細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程中的具體作用機(jī)制，目前該方面的研究尚屬空缺，需要更多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果予以補(bǔ)充。此外，NADPH 氧化酶是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS)的一種獨(dú)特的酶源，ROS 參與了腫瘤壞死因子α(TNF-α)介導(dǎo)的PCSK9 表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)清道夫受體(SRs)的表達(dá)[25]。SRs 是巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL 的主要受體，巨噬細(xì)胞釋放的PCSK9 具有生物活性，在DING等[26]實(shí)驗(yàn)中，TNF-α誘導(dǎo)的小鼠以劑量依賴(lài)的方式增加了PCSK9 和所有SRs 的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控ox-LDL 的攝取。以上可見(jiàn)，活化后的單核/巨噬細(xì)胞中，PCSK9 確實(shí)有促進(jìn)炎癥發(fā)展的作用，同時(shí)炎癥因子也在促進(jìn)PCSK9 的表達(dá)，比如PCSK9 與NLRP3/Caspase-1，鑒于巨噬細(xì)胞有多種促炎介質(zhì)表達(dá)，有理由相信其中還有更多作用機(jī)制值得去探究?？偟膩?lái)說(shuō)，單核/巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中有著舉足輕重的作用，尤其是可以表達(dá)多種促炎介質(zhì)的M1 巨噬細(xì)胞，一方面，活化后的巨噬細(xì)胞可以釋放多種促炎因子通過(guò)各種途徑與PCSK9 有著交叉相互作用，兩者相互影響，共同促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程，另一方面，PCSK9 對(duì)巨噬細(xì)胞線(xiàn)粒體的影響也值得注意及進(jìn)一步研究。另一項(xiàng)研究指出，PCSK9轉(zhuǎn)導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸激酶25 (STK25)轉(zhuǎn)基因小鼠的主動(dòng)脈中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)水平更高[27]，且STK25 蛋白在主動(dòng)脈各層均有表達(dá)，由此可見(jiàn)，STK25 在巨噬細(xì)胞炎癥過(guò)程中起著不可忽視的作用，也進(jìn)一步可以看到其在調(diào)節(jié)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)中或許可發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過(guò)藥物抑制STK25 功能可能為預(yù)防及治療動(dòng)脈粥樣硬化提供新的可能性，STK25 在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中發(fā)揮作用所涉及的信號(hào)通路可以為進(jìn)一步尋找相關(guān)的治療提供思路。

3.3 血管平滑肌細(xì)胞 在血管平滑肌細(xì)胞中，PCSK9 受Toll樣受體4-c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶(TLR4-SAPK/JNK)信號(hào)通路的調(diào)控[28]，而細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、p38 或磷脂酰肌醇三激酶(PI3-kinase)通路則對(duì)其沒(méi)有作用。TLR4 配體LPS可上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞中PCSK9基因和蛋白水平，這是一個(gè)在炎癥和代謝中重要的通路，血管平滑肌細(xì)胞來(lái)源的PCSK9 會(huì)降低單核細(xì)胞LDLR 表達(dá)，影響LDL-C/LDLR 介導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化因子受體(CCR2)表達(dá)，而后者對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和As發(fā)生至關(guān)重要。另外，溶血磷脂酸受體4 (LPAR4)[29]在腺相關(guān)病毒表達(dá)PCSK9 會(huì)降低LDLR 水平的作用，在暴露于ox-LDL后，平滑肌細(xì)胞上調(diào)炎癥標(biāo)志物IL-6 和CD68 的基因表達(dá)，且在敲除該基因的細(xì)胞中，編碼促生長(zhǎng)因子-平滑肌肌動(dòng)蛋白A2(Acta2)的表達(dá)在基線(xiàn)水平較低。其他研究表明，IL-17 可通過(guò)增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路和血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生膠原來(lái)穩(wěn)定斑塊的形態(tài)，并且在有促炎因子IFN-α存在的情況下，伴隨的IL-17 的增加可能會(huì)促進(jìn)As，但是抑制PCSK9 表達(dá)在上述通路中所起作用還未有試驗(yàn)進(jìn)行證明[30]。根據(jù)目前所有證據(jù)，有理由推測(cè)PCSK9 的升高會(huì)促進(jìn)IL-6、IL-17、CD68、IFN-α等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)As的發(fā)生發(fā)展。

3.4 血管成纖維細(xì)胞 血管成纖維細(xì)胞是形成血管外膜的主要細(xì)胞，血管功能障礙曾一度被認(rèn)為是血管的一個(gè)“由內(nèi)而外”的過(guò)程，但目前有更多證據(jù)表明，病理?xiàng)l件下，冠狀動(dòng)脈外膜重構(gòu)先于內(nèi)皮功能障礙的存在，最終導(dǎo)致血管壁增厚和功能障礙[31]。新生內(nèi)膜形成的部分特征是成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞后獲得了遷移和增殖能力，表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)和纖維連接蛋白等基質(zhì)成分的過(guò)度合成和分泌，這些表型改變?cè)试S外膜成纖維細(xì)胞持續(xù)向腔內(nèi)遷移，促進(jìn)新生內(nèi)膜的形成和內(nèi)膜增厚[32]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1(TGF-β1)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，在組織修復(fù)中起著核心作用[33]。所以誘導(dǎo)TGF-β的表達(dá)可能為外膜成纖維細(xì)胞成為肌成纖維細(xì)胞提供分化信號(hào)。另外，血管外膜成纖維細(xì)胞在血管緊張素Ⅱ(ANG Ⅱ)刺激下合成并釋放內(nèi)皮素-1(ET-1)，且釋放的ET-1具有生物活性，ET-1可能通過(guò)刺激外膜細(xì)胞表明ETA受體促進(jìn)膠原合成[34]。由于目前PCSK9與成纖維細(xì)胞炎癥方面的研究還屬空白，所以列出了以下猜測(cè)。REY等[35]研究表明，炎癥發(fā)生時(shí)血管成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量的NADPH氧化酶衍生的活性氧(ROS)，參與成纖維細(xì)胞增殖，結(jié)締組織沉積，可能還有血管張力，但特異性氧化還原敏感信號(hào)通路的參與導(dǎo)致細(xì)胞增殖尚不清楚。關(guān)于ROS，巨噬細(xì)胞部分也有提及，一方面其會(huì)參與TNF-α介導(dǎo)的PCSK9 表達(dá)，另一方面參與調(diào)節(jié)SRs 的表達(dá)，那么血管成纖維細(xì)胞來(lái)源的ROS是否有同樣作用呢？此外，缺氧條件下，前脂肪細(xì)胞增殖顯著增加，IL-6、MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，人硒蛋白P(SePP1)的表達(dá)量顯著降低，與血管成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后，血管成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，遷移增加，Ⅰ型膠原表達(dá)升高[36]。由此可見(jiàn)，缺氧可脂肪積累，誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致SePP1表達(dá)降低，可能參與了As的發(fā)生發(fā)展。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)與平滑肌細(xì)胞炎癥時(shí)的所涉及的炎癥因子有不謀而合之處，是否這些炎癥因子會(huì)共同作用于平滑肌細(xì)胞和血管成纖維細(xì)胞，同時(shí)接受PCSK9的調(diào)控呢。

彈性假黃瘤(PXE)是由ABCC6 突變引起的常染色體隱性疾病，以動(dòng)脈粥樣硬化和軟組織鈣化為特征。據(jù)KUZAJ等[37]研究發(fā)現(xiàn)，PXE成纖維細(xì)胞中膽固醇生物合成增加與PCSK9 水平升高有關(guān)，且ABCC6表達(dá)的增加伴隨著膽固醇生物合成的誘導(dǎo)，據(jù)此可以推測(cè)ABCC6 在人體脂蛋白和膽固醇穩(wěn)態(tài)中具有功能作用，但是具體機(jī)制還未有研究闡明。

4 調(diào)控PCSK9水平在治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病中的臨床意義

PCSK9 作為動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，使得抑制其作用的單克隆抗體被開(kāi)發(fā)，而循環(huán)的肝臟來(lái)源的PCSK9 是單克隆抗體的主要靶點(diǎn)[10]。兩種針對(duì)PCSK9的人單克隆抗體：依洛尤單抗(evolocumab)和阿莫羅布單抗(alirocumab)在臨床應(yīng)用最為廣泛，SABATINE等[38]研究共納入27 564例患者，證明了evolocumab在他汀類(lèi)藥物治療背景下可以顯著降低LDL-C 水平至30 mg/dL(0.78 mmol/L)，并且會(huì)顯著降低心血管風(fēng)險(xiǎn)，同樣，TAVORI等[19]研究共納入25 096 例患者，觀(guān)察使用48 周依洛尤單抗的患者發(fā)現(xiàn)，依洛尤單抗將冠心病死亡、心肌梗死或緊急血運(yùn)重建的風(fēng)險(xiǎn)降低了23%。除PCSK9 的人單克隆抗體之外，一種名為Inclisiran 的新型的通過(guò)降低膽固醇從而治療動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的藥物也即將問(wèn)世，該藥是一種化學(xué)合成的小干擾RNA(siRNA)分子，靶向于肝臟生成PCSK9，其降低LDL-C 的效果和降低心血管風(fēng)險(xiǎn)的潛力目前正在臨床試驗(yàn)中[39]。除上述兩類(lèi)調(diào)控PCSK9 水平的藥物外，WANG 等[40]對(duì)7030B-C5藥理作用和分子機(jī)理進(jìn)行詳細(xì)研究后，確定其為一種潛在的小分子PCSK9抑制劑。

5 結(jié)語(yǔ)

PCSK9 雖然發(fā)現(xiàn)較晚，但不可否認(rèn)它是As 中一個(gè)重要的信號(hào)調(diào)控因子。雖然臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明PCSK9 是降低血脂和預(yù)防和治療的As進(jìn)展的生物靶點(diǎn)，但其生理作用尚不完全清楚。LDLR和apoE 介導(dǎo)的PCSK9對(duì)血漿脂質(zhì)的影響是目前已被證實(shí)的，但是目前越來(lái)越多的證據(jù)表明，PCSK9是通過(guò)各種炎癥因子的介導(dǎo)促進(jìn)As的發(fā)生與發(fā)展，但其具體機(jī)制還未明確。希望通過(guò)本文的梳理可以提供新的思路去考慮PCSK9與As的關(guān)系。