李興玉 綜述 曹云濤 審校

遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院新生兒科，貴州 遵義 563003

促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)于1971 年從貧血羊血漿中發(fā)現(xiàn)并提純[1]，其后利用基因重組技術(shù)克隆出重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythrpoietin，rhEPO)[2]；EPO可促進紅系祖細胞的分化與成熟、促進紅細胞生成，最先應用于治療腎性貧血；兒科領域中EPO 已用于治療早產(chǎn)兒貧血。近來發(fā)現(xiàn)EPO除有促進紅細胞生成作用外，還有廣泛的生物學活性，特別在神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用越來越受到重視。本文就EPO 及其受體的分布、神經(jīng)保護機制，從分子機制、動物實驗和臨床試驗等方面的最新研究進行綜述，以便更深入地了解EPO神經(jīng)保護作用。

1 EPO產(chǎn)生及分布

促紅細胞生成素(EPO)是一種分子量為30.4 kDa的糖蛋白，胚胎時期主要由胎兒肝臟產(chǎn)生，成年后EPO主要由腎臟血管周圍間質(zhì)成纖維細胞產(chǎn)生，非造血組織如肝臟、大腦、視網(wǎng)膜也產(chǎn)生EPO，在除腎臟以外的器官中的表達約占整個生物體總產(chǎn)量的15%～20%[3]。EPO 通過刺激骨髓中紅細胞前體細胞上的EPO 受體(EPOR)來誘導紅細胞生成，從而增加其存活、增殖和分化，最終增強攜氧能力。EPO 受體(EPOR)分布并不局限于紅細胞，在心臟、大腦、視網(wǎng)膜、胰腺和腎臟等許多器官表達，在這些器官中介導EPO發(fā)揮生物學作用。當暴露于缺氧、創(chuàng)傷和其他刺激時，EPO 及其受體的表達上調(diào)，通過多種作用機制起重要的神經(jīng)保護作用[4]。

2 EPO的神經(jīng)保護機制

2.1 促進神經(jīng)再生、損傷修復和正常發(fā)育 在腦和血管系統(tǒng)的發(fā)育中EPO 已被證明具有促進和刺激神經(jīng)發(fā)生的相關(guān)功能。通過對小鼠腹腔內(nèi)注射重組人促紅細胞生成素(rhEPO)，模擬內(nèi)源性神經(jīng)元EPO/EPOR信號傳導可以增加錐體神經(jīng)元的樹突棘密度，增加成熟的海馬錐體神經(jīng)元的數(shù)量[5-6]。越來越多的研究認為，小膠質(zhì)細胞可以表現(xiàn)出不同的表型，并能對特定的微環(huán)境做出不同的反應[7]。在損傷部位同時存在M1 和M2 兩種小膠質(zhì)細胞表型，M1 小膠質(zhì)細胞增加促炎介質(zhì)的分泌，從而損害軸突的再生，相反M2 小膠質(zhì)細胞可介導神經(jīng)保護功能并促進神經(jīng)再生。EPO 處理后，在腦缺血后同側(cè)皮質(zhì)中M1 標志物CD16 和CD11b 的蛋白表達水平顯著降低，而M2 標志物CD206 的表達顯著上升，EPO 可以阻止M2 向M1 的轉(zhuǎn)變并保持M2 小膠質(zhì)細胞表型，修復腦白質(zhì)完整性[8-9]。根據(jù)最近的一些研究顯示，Janus 激酶2/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(JAK2/STAT3)信號通路參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后小膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化[10-11]。非紅細胞生成突變體促紅細胞生成素(mutant erythropoietin，MEPO)通過JAK2/STAT3 和C/EBPβ信號通路促進小膠質(zhì)細胞向有益的M2 表型轉(zhuǎn)化，從而促進了少突膠質(zhì)細胞的形成[12]。MEPO可以刺激腦缺血小鼠恢復期的神經(jīng)再生和血管生成，抑制過度的膠質(zhì)形成，這表明MEPO對非小膠質(zhì)細胞(包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞)具有潛在的作用[13]。EPO通過激活JAK2-PI3K-NF-κB信號通路進而上調(diào)神經(jīng)元中生長和分化因子10(Growth and differentiation factor 10，GDF10)的水平，促進軸突形成，并呈劑量依賴性[14]。促紅細胞生成素可減輕樹突棘的損傷和海馬區(qū)的膽堿能功能障礙，通過刺激JAK2/STAT5/PI3K/Akt 信號通路抑制海馬GSK-3β的過度激活。此外，MA等[15]發(fā)現(xiàn)shRNA 對EPO 受體(EPO-R)的基因敲除阻斷了EPO對血管性癡呆(vascular dementia，VD)的神經(jīng)保護作用，推測促紅細胞生成素治療能夠通過刺激促紅細胞生成素受體來修復血管性癡呆的記憶損害。

2.2 抗氧化活性，調(diào)節(jié)免疫 研究證實EPO的表達受缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1，HIF1)的調(diào)控。HIF1α是細胞對缺氧和氧化應激適應性反應的轉(zhuǎn)錄激活因子和主要調(diào)節(jié)因子，介導過多的適應性反應，包括谷氨酸和丙酮酸脫氫酶激酶1 促進糖酵解而抑制線粒體氧化磷酸化，血紅素氧合酶-1 (Heme oxygenase-1，HO1)和核因子樣2 (NRF2)用于減輕氧化應激，減輕腦損傷[16]。腦內(nèi)促炎癥細胞因子的上調(diào)、局部小膠質(zhì)細胞和系統(tǒng)性淋巴細胞(systemic lymphocytes)的激活以及白細胞的浸潤是缺血性腦損傷的重要原因，調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(regulatory T cells)可以拮抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-δ(IFN-δ)的產(chǎn)生，而TNF-α和IFN-δ的產(chǎn)生導致遲發(fā)性炎性腦損傷[17]。免疫系統(tǒng)也參與缺血再灌注損傷，組織修復和再生的證據(jù)表明EPO 的免疫調(diào)節(jié)作用也可能與其組織保護作用有關(guān)[18]。JM4是一種源自人類促紅細胞生成素的第一環(huán)的19'mer 環(huán)狀肽。該肽具有有益的免疫調(diào)節(jié)和組織保護作用，同時沒有促紅細胞生成素所致的血栓栓塞等不良副作用。JM4 進行長期治療可延遲PS19 小鼠(一種tauopathy 的動物模型)的神經(jīng)功能障礙的發(fā)作并延長其壽命。長期JM4 治療可減少PS19小鼠大腦中的IBA-1和MHC II誘導以及補體成分C3升高(神經(jīng)炎癥)，從而減少神經(jīng)元丟失(神經(jīng)變性)和小膠質(zhì)細胞激活。通過慢性JM4 治療降低了包括IL1β和TNF-α在內(nèi)的促炎細胞因子的表達[19]。

2.3 防止細胞凋亡，減輕炎癥 Bcl-2家族蛋白，包括促凋亡成員(如Bax)和抗凋亡成員(如Bcl-2)在細胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。已知裂解的Caspase-3在Bax/Bcl-2的下游起作用，在凋亡的執(zhí)行中也起著關(guān)鍵作用。通過體外氧-葡萄糖剝奪(OGD)進行細胞培養(yǎng)，模擬了體外HIE的狀況[20]。OGD處理可增加Bax 的蛋白表達并切割Caspase-3。相反，OGD 后Bcl-2 的蛋白表達以及Bcl-2/Bax 比值降低。與OGD處理相比，EPO 處理可逆轉(zhuǎn)Bcl-2、Bax 和裂解的Caspase 3的蛋白質(zhì)表達，以及Bcl-2/Bax比[21]。OGD后細胞凋亡率增加[22]，越來越多的證據(jù)表明EPO可以保護神經(jīng)元細胞免受OGD 誘導的細胞凋亡[23-26]。在OGD后源自低溫星形膠質(zhì)細胞的液體培養(yǎng)基ACM的存在下，裂解的Caspase 3 和TdT 介導的dUTP 缺口末端標記陽性的凋亡神經(jīng)元的數(shù)量要比OGD后從常溫星形膠質(zhì)細胞存在的ACM 的數(shù)量要少。OGD 后，使用抗EPO 中和抗體阻斷EPO 信號傳導會減弱源自低溫星形膠質(zhì)細胞的ACM 的抗凋亡作用[27]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的嚴重程度與小膠質(zhì)細胞激活和促炎細胞因子產(chǎn)生的牢固性密切相關(guān)。小膠質(zhì)細胞在急性或慢性神經(jīng)炎癥反應中起著重要介質(zhì)的作用，過度活化會加劇炎癥反應并介導細胞變性，導致神經(jīng)元死亡。最近的一項研究報道，EPO預處理可以減弱脂多糖誘導的小膠質(zhì)細胞的激活，包括體內(nèi)的形態(tài)學變化、體外的吞噬作用以及體內(nèi)和體外炎性細胞因子的產(chǎn)生[28]。EPO可通過多種機制減輕神經(jīng)炎癥，包括減少小膠質(zhì)細胞活性以及iNOS 和COX-2 的表達。另外，還調(diào)節(jié)了磷酸化AKT、mTOR和凋亡指示劑(如BAX，BCL-2和裂解的Caspase-3)的表達。EPO 抑制AKT-mTOR途徑，以減輕燒傷誘導的運動神經(jīng)元凋亡和小膠質(zhì)細胞活化[29]。缺氧缺血(hypoxic-ischemic，HI)損傷會嚴重損害大鼠的神經(jīng)行為表現(xiàn)，包括感覺運動、自發(fā)運動和認知能力。HI 損傷還會在大鼠的白質(zhì)、紋狀體、皮質(zhì)和海馬區(qū)導致腦部炎癥和神經(jīng)元死亡。rhEPO預處理(對幼鼠進行HI 并腹膜內(nèi)注射前1 h 加入rhEPO)和后處理(低氧暴露后1 h，對幼鼠進行HI注射rhEPO)均顯著改善了神經(jīng)行為表現(xiàn)，并防止了HI誘導的神經(jīng)元死亡，小膠質(zhì)細胞活化(OX42+)以及成熟少突膠質(zhì)細胞(APC-CC1+)和海馬神經(jīng)元(Nissl+)的丟失。Fluoro-Jade B是一種聚陰離子熒光素衍生物，能敏感且特異性地結(jié)合退化神經(jīng)元，OX42 是小鼠小膠質(zhì)細胞特異性標志CD11b。與用rhEPO 進行后處理相比，用rhEPO進行預處理提供了更好的抗炎和抗凋亡作用，通過減少OX42染色(小膠質(zhì)細胞)和Jade B染色(退化的神經(jīng)元)來表明[30]。

2.4 抗神經(jīng)毒性 谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白1(GLT-1)和谷氨酸天冬氨酸轉(zhuǎn)運蛋白(GLAST)是陽離子依賴性谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，不僅將谷氨酸轉(zhuǎn)運到神經(jīng)膠質(zhì)細胞中，而且還可以在細胞內(nèi)和細胞外環(huán)境中維持適當?shù)墓劝彼崽荻取Ｔ谀X缺血缺氧期間，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放會導致腦損傷。來自動物和臨床實驗的大量證據(jù)表明，高濃度的細胞外谷氨酸與神經(jīng)損傷密切相關(guān)。細胞外谷氨酸誘導的過度神經(jīng)毒性可導致神經(jīng)元死亡[31]。目前的結(jié)果表明，腦缺血再灌注降低了GLT-1 和GLAST 的mRNA 和蛋白水平，而EPO 預處理顯著提高了缺血再灌注后的這些水平。這表明由于EPO 預處理而導致的針對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能部分歸因于GLT-1和/或GLAST表達的上調(diào)[32]。在阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)中，β淀粉樣蛋白(amyloid beta，Aβ)產(chǎn)生和清除平衡障礙導致腦內(nèi)Aβ過度沉積是AD 主要的發(fā)病原因。Aβ淀粉樣肽的積累與細胞凋亡直接相關(guān)，AD中的Aβ肽負責離子穩(wěn)態(tài)的丟失，因為它能夠穿透細胞膜，形成一個孔，允許陽離子，尤其是鈣離子大量進入，導致細胞凋亡和細胞內(nèi)ATP 失衡[33]。促紅細胞生成素變體(EPOL)具有不同的糖基化模式，其特征是中性的、雙觸角的和α-唾液酸化的結(jié)構(gòu)，保留了神經(jīng)保護作用，但沒有造血活性。EPOL 對Aβ誘導的毒性具有神經(jīng)保護作用，其機制涉及EPOR、活性氧的減少和星形膠質(zhì)細胞增生的減少。此外，EPOL 治療還可以減少由于長期暴露于Aβ而導致的鈣超載。EPOL 還對慢性Aβ誘導的氧化應激具有神經(jīng)保護作用，其濃度比EPO低10倍[34]，促紅細胞生成素衍生物有望成為各種神經(jīng)疾病的治療劑。

3 EPO的神經(jīng)保護作用

3.1 體外細胞實驗 GYETVAI 等[35]證實通過培養(yǎng)野生型中樞神經(jīng)膠質(zhì)4(CG4)細胞，促紅細胞生成素可能通過誘導胰島素樣生長因子和增加脂質(zhì)代謝來增加少突膠質(zhì)細胞的髓鞘再形成。WENKER 等[36]通過神經(jīng)元細胞(SH-SY5Y)在活化的小膠質(zhì)細胞EOC-2 或巨噬細胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)后發(fā)生了較多的凋亡，而EPO通過激活EPO/EPOR受體來消除這一效應，表明EPO增加了神經(jīng)元對促炎劑造成的損傷的抵抗力。

3.2 體外動物實驗 LIU 等[37]誘發(fā)的小鼠早產(chǎn)兒宮內(nèi)感染可導致氨基酸受體NMDA過度活化，然后介導氨基酸的興奮性毒性，從而導致神經(jīng)元凋亡。用重組人促紅細胞生成素治療后，可以通過抑制氨基酸的興奮性毒性來抑制NMDA 過度活化，促進腦內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖和分化，對宮內(nèi)感染引起的早產(chǎn)小鼠腦損傷具有一定的治療作用。GOVINDAPPA 等[38]在嚴重坐骨神經(jīng)擠壓傷小鼠模型(SSCI)中證實：在輕度至中度坐骨神經(jīng)擠壓傷后，單劑量促紅細胞生成素治療可促進功能恢復并增強神經(jīng)再生。JUENEMANN 等[39]在建立短暫性中腦動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型中得出：rhEPO 5 000 IU/kg 的單劑量預處理可顯著減少大鼠短暫MCAO 后24 h 缺血半影區(qū)域的缺血性病變體積并增加局部腦血流。

3.3 EPO 臨床試驗 在美國對中度至重度HIE的足月新生兒進行的Ⅱ期，多中心、雙盲對照試驗發(fā)現(xiàn)，高劑量的EPO 低溫治療缺氧缺血性腦病可降低MRI 腦損傷，特別是在皮層下區(qū)域并改善1 年運動功能[40]。薈萃分析對四項接受預防性rhEPO治療的隨機對照試驗中的1 133 名極早產(chǎn)嬰兒(約32 周妊娠)進行了分析，結(jié)果表明經(jīng)校正的18～24個月大的MDI評估，預防性rhEPO 改善了早產(chǎn)兒的認知發(fā)育，但對其他神經(jīng)發(fā)育結(jié)局無影響[41]。JUUL等[42]在對窒息和腦病試驗進行的一項多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照試驗中發(fā)現(xiàn)EPO在臨床前研究中具有神經(jīng)保護作用，Ⅰ/Ⅱ期試驗表明，多次高劑量的EPO可能為足月兒提供抗腦損傷的神經(jīng)保護。圍產(chǎn)期HIE 新生兒使用EPO 可降低腦損傷的風險、腦癱和認知障礙[43]。但最近有研究表明，從生后24 h 至32 周，對極早產(chǎn)兒進行的高劑量rhEPO 隨機、雙盲試驗對2 歲時嚴重神經(jīng)發(fā)育障礙或死亡的風險沒有影響[44]。目前促紅細胞生成素生成素的神經(jīng)保護作用大多通過動物實驗證實，人體實驗方面的研究較少，甚至有部分實驗中發(fā)現(xiàn)rhEPO沒有神經(jīng)保護作用，仍需要大量的臨床研究去證實。

4 結(jié)語

rhEPO 是一個有潛在臨床應用價值的神經(jīng)保護劑，其經(jīng)濟、實用，在治療腎性貧血中臨床應用多年。然而，關(guān)于EPO在新生兒神經(jīng)保護中的許多問題仍無確切結(jié)論，還有待進一步研究最佳劑量、給藥間隔和時間等。部分實驗認為大劑量的促紅細胞生成素有相關(guān)的副作用，如血栓形成、紅細胞增多癥、繼發(fā)性梗死等，促紅細胞生成素的衍生物應運而生，具有有益的免疫調(diào)節(jié)和組織保護作用，同時缺乏促紅細胞生成素的不良副作用，研究證實其同樣存在神經(jīng)保護作用，這為日后腦損傷治療提供新的藥物選擇。