李海軍，王慶波，張英華，鄭德強(qiáng)，馬雙雙，王 超

（1.山東福瑞達(dá)生物科技有限公司，山東 臨沂 276700；2.山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，山東 濟(jì)南 250101；3.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

γ-聚谷氨酸（γ-poly-glutamic acid，γ-PGA）是一種由微生物發(fā)酵將D-或L-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基結(jié)合形成γ-酰胺鍵的聚陰離子均聚多肽[1]。目前，γ-聚谷氨酸以其較好的緩釋、成膜、乳化、保溫、增稠等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品[2]、藥品[3]等領(lǐng)域中。但是由于聚谷氨酸的生產(chǎn)成本高，導(dǎo)致其價(jià)格昂貴，極大地限制了其應(yīng)用[4]，其中最關(guān)鍵的是其發(fā)酵培養(yǎng)基的成本較高[5]。因此，尋找廉價(jià)的培養(yǎng)基原料生產(chǎn)聚谷氨酸的研究較多[6-10]。本文從聚谷氨酸發(fā)酵所需的氮源和碳源出發(fā)，分別研究小麥水解蛋白、豆餅粉、豆粕粉、玉米蛋白、玉米漿等有機(jī)氮源和甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖蜜、玉米糖蜜等碳源對聚谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響，在此基礎(chǔ)上通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了玉米漿、硫酸銨、甜菜蜜、谷氨酸鈉的添加量，最后通過發(fā)酵罐驗(yàn)證，比較優(yōu)化后的聚谷氨酸發(fā)酵工藝與原有工藝使用蛋白胨、葡萄糖作為氮源和碳源的發(fā)酵水平。

1 材料與儀器

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（FRD518CGMCC NO.6772），本實(shí)驗(yàn)室活化保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L，谷氨酸鈉10g/L，酵母粉5 g/L，MgSO40.25 g/L，K2HPO42 g/L，pH 7.5，115 ℃滅菌30 min備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖180 g/L，蛋白胨35 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，谷氨酸鈉60 g/L，調(diào)節(jié)pH 7.5，115 ℃滅菌30 min備用。

1.3 儀器與設(shè)備

電子分析天平（Mettler Toledo）；ZHJHC1115B垂直流超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；ZHWY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；LDZF-75KB-II立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；1200 Series高效液相色譜儀（Agilent Technologies）。

2 方法與結(jié)果

2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：取一管凍存的種子（約1 ml）接入裝有100 ml種子培養(yǎng)基500 ml三角瓶中，于37 ℃，250 r/min搖床震蕩培養(yǎng)至A600達(dá)到1.8～2.2。

發(fā)酵培養(yǎng)：以5 %的接種量接種活化好的種子，溫度37 ℃，250 r/min搖床振蕩培養(yǎng)或350 r/min攪拌、10 L/min通氣10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵時間64 h，pH不控制，得聚谷氨酸發(fā)酵液。

2.2 分析、測定方法

γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的測定使用QB/T5189-2017聚谷氨酸推薦的高效液相色譜法測定[12]，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及結(jié)果計(jì)算參見本標(biāo)準(zhǔn)。

色譜條件：色諧柱：TSK-gel G-3000PWXL凝膠色譜柱（7.8 mm×30.0 cm）；流動相：稱取42.6 g無水硫酸鈉，超純水溶解并定容至1 L，用乙酸調(diào)pH至4.0，用孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾，超聲波脫氣15 min；檢測柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；檢測器：紫外檢測器；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μl。

樣品制備：稱取2 g γ-聚谷氨酸發(fā)酵液，精確至0.001 g，用流動相溶解定容至100 ml。配好的試樣溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行高效液相色譜檢測，記錄峰面積，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到試樣中γ-聚谷氨酸的濃度c。

2.3 發(fā)酵原料的選擇與單因素優(yōu)化

2.3.1 氮源選擇 在配制發(fā)酵培養(yǎng)基時分別用35 g/L小麥水解蛋白、豆餅粉、豆粕粉、玉米蛋白、玉米漿作為氮源代替蛋白胨作為實(shí)驗(yàn)組，蛋白胨35 g/L作為對照組，其他培養(yǎng)基成分不變，研究廉價(jià)氮源添加代替蛋白胨對聚谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

小麥水解蛋白、豆餅粉、豆粕粉、玉米蛋白、玉米漿、蛋白胨發(fā)酵聚谷氨酸的產(chǎn)量見表1。由表1可見，所選的廉價(jià)氮源中玉米漿的效果最好，但其發(fā)酵聚谷氨酸產(chǎn)量仍低于蛋白胨為氮源的產(chǎn)量。因此，可選取玉米漿作進(jìn)一步優(yōu)化。

表1 不同氮源類型發(fā)酵聚谷氨酸的產(chǎn)量

2.3.2 玉米漿條件的單因素優(yōu)化 選擇2.3.1項(xiàng)中篩選出的玉米漿分別加入20，25，30，35，40，45，50，55 g/L，作進(jìn)一步的單因素優(yōu)化。

玉米漿添加量對聚谷氨酸產(chǎn)量的影響，見圖1。由圖1可見，玉米漿添加量在20～40 g/L范圍內(nèi)，聚谷氨酸產(chǎn)量隨玉米漿添加量增加而增加，玉米漿添加量40 g/L時達(dá)最大，為28.42 g/L；當(dāng)大于40 g/L時，聚谷氨酸產(chǎn)量隨玉米漿添加量增加而降低。因此，選取玉米漿加入量為40 g/L作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖1 玉米漿添加量對聚谷氨酸產(chǎn)量的影響

2.3.3 無機(jī)氮源的單因素實(shí)驗(yàn) 在微生物培養(yǎng)過程中，無機(jī)氮源與有機(jī)氮源總是相互配合發(fā)揮作用，無機(jī)氮源可滿足前期微生物的快速生長，有機(jī)氮源則可滿足微生物中后期生長及產(chǎn)物積累[11]。在無機(jī)氮源中，常用的是氯化銨和硫酸銨，由于使用氯化銨會增加發(fā)酵液中氯離子的含量，因此，選擇硫酸銨作為無機(jī)氮源。在添加40 g/L玉米漿的基礎(chǔ)上，分別加入0，2.5，5，7.5，10，12.5，15 g/L硫酸銨，通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化添加量。

圖2為玉米漿添加量40 g/L時，聚谷氨酸產(chǎn)量隨硫酸銨添加量的變化。由圖2可見，硫酸銨從0增加至5 g/L時，聚谷氨酸產(chǎn)量從28.42 g/L增加至36.42 g/L，產(chǎn)量提高了28.15 %，與使用蛋白胨發(fā)酵聚谷氨酸產(chǎn)量相當(dāng)；之后，硫酸銨繼續(xù)增加至10 g/L時，聚谷氨酸產(chǎn)量變化不顯著；在10 g/L以后，聚谷氨酸產(chǎn)量隨硫酸銨添加量增加而逐漸降低。因此，選取硫酸銨加入量為5 g/L。

圖2 硫酸銨添加量對聚谷氨酸產(chǎn)量的影響

2.3.4 碳源選擇 在使用玉米漿40 g/L，硫酸銨5 g/L條件下，依據(jù)葡萄糖的加入量，分別使用同等質(zhì)量的甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、葡萄糖蜜、玉米糖蜜代替葡糖糖，驗(yàn)證廉價(jià)碳源對聚谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響，濃度和加入量及其聚谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量見表2。由表2可見，不同來源的糖蜜其聚谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)量不同，其中甜菜糖蜜的產(chǎn)量最高。因此，使用甜菜蜜代替葡萄糖作進(jìn)一步優(yōu)化。

表2 碳源濃度和加入量及其聚谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量

2.3.5 甜菜蜜的單因素優(yōu)化 分別加入200，250，300，350，400，450，500 g/L甜菜蜜，通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定其最佳添加量。甜菜蜜加入量對聚谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響，見圖3。由圖3可見，在200～350 g/L 范圍內(nèi)，聚谷氨酸產(chǎn)量隨甜菜蜜加入量增加而增加，甜菜蜜加入量350 g/L 時達(dá)最大值，為39.82 g/L；之后，甜菜蜜繼續(xù)增加，聚谷氨酸產(chǎn)量逐漸降低，因此選擇甜菜蜜的加入量為350 g/L作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 甜菜蜜加入量對聚谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響

2.3.6 谷氨酸鈉的單因素優(yōu)化 谷氨酸鈉為聚谷氨酸合成的前體物質(zhì)，當(dāng)聚谷氨酸產(chǎn)量增加，谷氨酸鈉加入太少就會影響聚谷氨酸的合成，因此對谷氨酸鈉添加量進(jìn)行了優(yōu)化，分別加入40，50，60，70，80 g/L谷氨酸鈉，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定其最佳使用量。由圖4可見，谷氨酸鈉加入量為40～70 g/L時，聚谷氨酸產(chǎn)量增加，70 g/L達(dá)最大值；80 g/L時聚谷氨酸產(chǎn)量不再增加。選擇70 g/L為最優(yōu)條件。

圖4 谷氨酸鈉加入量對聚谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響

2.4 聚谷氨酸產(chǎn)量的發(fā)酵罐驗(yàn)證

使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基玉米漿40 g/L、硫酸銨5 g/L、60 %甜菜糖蜜350 g/L、谷氨酸鈉70 g/L為實(shí)驗(yàn)組，原有工藝葡萄糖180 g/L、蛋白胨35 g/L、谷氨酸鈉60 g/L為對照組，其他培養(yǎng)基配方不變，進(jìn)行10 L發(fā)酵罐驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。聚谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)量與發(fā)酵時間的關(guān)系見圖5。由圖5可見，發(fā)酵初始時，對照組產(chǎn)量較高，可能是由于在初始時菌株可充分利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，而糖蜜單糖含量較少，需分解為單糖才能被利用。最終實(shí)驗(yàn)組聚谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)45.34 g/L，高于對照組的產(chǎn)量40.46 g/L，產(chǎn)量提高了12 %。

圖5 對照組與實(shí)驗(yàn)組聚谷氨酸產(chǎn)量與發(fā)酵時間的關(guān)系

3 討論

本文從聚谷氨酸發(fā)酵所需的氮源和碳源出發(fā)，分別研究小麥水解蛋白、豆餅粉、豆粕粉、玉米蛋白、玉米漿等有機(jī)氮源和甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖蜜、玉米糖蜜等碳源對聚谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響，在此基礎(chǔ)上通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了玉米漿、硫酸銨、甜菜蜜、谷氨酸鈉的添加量，最后通過發(fā)酵罐驗(yàn)證，比較了優(yōu)化后的聚谷氨酸發(fā)酵工藝與原有工藝使用蛋白胨、葡萄糖作為氮源和碳源的發(fā)酵水平。通過條件優(yōu)化，最終通過發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表明當(dāng)玉米漿40 g/L、硫酸銨5 g/L、60 %甜菜蜜350 g/L、谷氨酸鈉70 g/L時，聚谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到了45.34 g/L，高于原有工藝使用蛋白胨、葡萄糖的發(fā)酵水平40.46 g/L，產(chǎn)量提高了12 %。由于玉米漿的價(jià)格每噸約3000元，硫酸銨每噸約2000元，而蛋白胨每噸約2萬元，綜合其他生產(chǎn)費(fèi)用，生產(chǎn)成本降低了20 %以上，有利于聚谷氨酸的推廣應(yīng)用。