于瑞莉，馮永巍，黃麗俊，楊 婷

（無錫市食品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，國家市場(chǎng)技術(shù)創(chuàng)新中心（特殊食品），江蘇 無錫 214000）

特殊食品是指為滿足某些特殊人群的生理需要，或某些疾病患者的營(yíng)養(yǎng)需要，按特殊配方而專門加工的食品，包括保健食品、嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品（簡(jiǎn)稱特醫(yī)食品）和特殊膳食等。在食品原料中，葉酸、生物素和維生素B12（VB12）是常添加的3種水溶性B族維生素，是人體維持正常生理機(jī)能的一類重要且典型的微量營(yíng)養(yǎng)素，在體內(nèi)不能自身合成，必須通過食物或外界環(huán)境獲取和補(bǔ)充[1]。由于特殊食品針對(duì)的人群特殊，其添加量要求嚴(yán)格，因此對(duì)于這3種水溶性B族維生素的含量測(cè)定有非常重要的作用。但由于基質(zhì)成分復(fù)雜，B族維生素添加量較低，且易受光熱分解[2]，使檢測(cè)難度大大增加。本文對(duì)葉酸、生物素和維生素B12常用的分光光度計(jì)法，熒光法、高效液相色譜、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、微生物法和免疫法進(jìn)行詳細(xì)分析討論，旨在為檢測(cè)工作者尋找一種簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)、快速的檢測(cè)方法提供指導(dǎo)。

1 性質(zhì)

葉酸（floic acid，維生素B9），包括天然的葉酸和用于強(qiáng)化食品和膳食補(bǔ)充劑的合成葉酸，其化學(xué)名稱是蝶酰谷氨酸，由蝶呤、對(duì)氨基苯甲酸和L-谷氨酸組成，對(duì)光敏感。葉酸缺乏會(huì)使單碳代謝嚴(yán)重異常，可導(dǎo)致慢性疾病和發(fā)育障礙，包括神經(jīng)管缺陷[3]、巨紅細(xì)胞型貧血、癌癥及神經(jīng)障礙等多種疾病。但是過量攝入合成葉酸又會(huì)引起并發(fā)癥[4-5]，如干擾人體對(duì)鋅的吸收，增加下一代患自閉癥的風(fēng)險(xiǎn)等。一般正常人葉酸的需求量為200～400 μg/d，世界衛(wèi)生組織建議成人至少為200 μg/d，孕婦和母乳為400 μg/d，不同年齡、不同階段的人需求量不同[6]。

生物素（biotin，維生素B7），是合成維生素C的必要物質(zhì)。含3個(gè)不對(duì)稱碳原子的雙環(huán)化合物[7]共有8種同分異構(gòu)體，穩(wěn)定性較好。作為羧化酶、羧基轉(zhuǎn)移酶、脫羧酶的輔酶參與人體的糖異生、脂肪酸和氨基酸代謝、能量傳遞過程。其長(zhǎng)期攝入不足會(huì)影響蛋白質(zhì)及RNA合成，降低身體免疫力[8]。

維生素B12（cobalamin，鈷胺素），是一類含有鈷離子的咕啉類化合物總稱[9]，是唯一含有金屬離子的水溶性維生素，在空氣中不穩(wěn)定，對(duì)光敏感。以輔酶形式參與各種代謝過程，在造血和健全神經(jīng)系統(tǒng)功能方面有重要作用。缺乏維生素B12不僅導(dǎo)致巨幼紅細(xì)胞貧血，還會(huì)引起心臟病，神經(jīng)紊亂，老年癡呆和帕金森綜合征等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[10-11]。

國家食品安全監(jiān)督抽檢對(duì)特殊食品中3種B族維生素的含量要求非常嚴(yán)格（見表1）[12]。由表可見，特殊膳食食品中尤其是孕、乳母營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品、嬰兒配方食品對(duì)維生素添加量有嚴(yán)格的要求，特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方奶粉和嬰幼兒配方奶粉對(duì)3種B族維生素含量區(qū)間要求更窄，含量更低，需要檢測(cè)方法具備更高的靈敏度和更低的檢出限。

2 檢測(cè)方法

2.1 比色法

維生素檢測(cè)開展初期，比色法有較廣的普適性。葉酸檢測(cè)分為直接比色和衍生物比色法兩種。直接比色法是在堿性溶液中將葉酸溶解，測(cè)定葉酸的特征峰吸收值，從而確定樣品中葉酸含量。衍生法則需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，使用衍生化試劑與葉酸反應(yīng)，合成其他穩(wěn)定且具有特征吸收峰的物質(zhì)后再進(jìn)行紫外測(cè)定。常用的衍生試劑有茚三酮、高錳酸鉀、N-(1-N)-二乙二胺等[19]。生物素測(cè)定則用無水乙醇提取，在硫酸乙醇溶液中生成橙紅色化合物，在一定范圍內(nèi)顏色深淺與生物素含量成正比，根據(jù)吸光度即可判斷生物素的含量[20]。維生素B12在 278，361和550 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，可使用紫外-可見光分光光度計(jì)法進(jìn)行含量測(cè)定[21]。該方法雖然操作簡(jiǎn)單，但易被樣品中其他物質(zhì)干擾，受儀器分辨率和樣品本底的影響較大，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精確性，因此不太適宜特殊食品中葉酸、生物素和維生素B12的檢測(cè)。

2.2 熒光法

對(duì)于自身含有熒光特性或是與標(biāo)記物結(jié)合發(fā)光的 B 族維生素，可使用熒光法測(cè)定。生物素和維生素B12不具有熒光特性，關(guān)于此方法的研究鮮有報(bào)道。只有葉酸結(jié)構(gòu)中的吡嗪嘧啶環(huán)含有特殊的吸收光譜,紫外光可將其轉(zhuǎn)化為熒光產(chǎn)物，采用熒光法和其他檢測(cè)手段相結(jié)合的方式進(jìn)行測(cè)定。陳瓊等[22]采用固相萃取-HPLC柱后氧化衍生熒光法測(cè)定運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品中葉酸的含量，趙海燕等[23]采用HPLC-柱后光化學(xué)衍生-熒光檢測(cè)方法，用于強(qiáng)化食品中葉酸測(cè)定。具有靈敏度高，重現(xiàn)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但它的缺點(diǎn)在于前處理復(fù)雜，不具備高效快速的特點(diǎn)，且檢出限較低，適用于特殊膳食但不適用于特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品中葉酸的檢測(cè)。

2.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）已普遍用于特殊膳食中維生素測(cè)定。耿瑛等[24]采用鈦膠反相色譜柱，建立了同時(shí)測(cè)定功能飲料中的生物素、葉酸、維生素B12等5種維生素的HPLC法。孫璐璐等[25]通過固相萃取-HPLC實(shí)現(xiàn)了對(duì)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化餅干中維生素B12含量的快速精確測(cè)定，檢出限0.1 mg/kg。

HPLC一般適用于添加形式明確，且含量較高的特殊膳食中維生素的檢測(cè)。但李貽[26]用HPLC和HPLC-MS分析嬰幼兒配方乳粉中B12含量，得出結(jié)論：HPLC因檢測(cè)重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于維生素B12含量高的樣品，但是靈敏度不高，儀器檢出限較高，對(duì)于含量低的樣品不宜準(zhǔn)確檢出。所以由于方法的局限性，特醫(yī)食品中葉酸、維生素B12的檢測(cè)較少采用HPLC。

2.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）相對(duì)于HPLC，有更強(qiáng)大的組分分離與鑒定能力，也有較低的檢出限；不僅可準(zhǔn)確測(cè)定維生素含量較高的特殊膳食，也可測(cè)定特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品中維生素含量。張辰辰等[27]利用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測(cè)定特醫(yī)食品中生物素、葉酸、維生素B12等8種維生素，定量限為4～10 μg/100 g，加標(biāo)回收率達(dá)85.52 %～116 %，RSD為0.49 %～4.10 %。陳美君等[28]建立了一種能同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中 11 種 B 族維生素的超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，采用電噴霧離子源正離子模式，方法線性范圍良好，樣品前處理方法簡(jiǎn)單，靈敏度高。盧蘭香等[29]采用免疫親和柱進(jìn)行凈化，建立了LC-MS測(cè)定特醫(yī)食品中生物素的方法。

但是LC-MS/MS的測(cè)定與其標(biāo)準(zhǔn)溶液相關(guān)性較強(qiáng)，而這3種維生素在特殊食品中的存在形式較復(fù)雜。葉酸衍生物種類多，LC-MS/MS測(cè)定的只是不同衍生物的含量，盡管Ndawa等[30]將衍生物轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸或多種純化方式分別測(cè)得多種衍生物含量，但是葉酸及其衍生物不穩(wěn)定，且易在提取和測(cè)定過程中發(fā)生氧化降解或衍生物間相互轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致難以準(zhǔn)確測(cè)定葉酸總量。而維生素B12的主要存在形式包括羥基鈷胺素、氰基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素[31]，不同于允許添加到食品中的維生素B12的種類（氰鈷胺、羥鈷胺和鹽酸氰鈷胺）[32]，且維生素B12幾乎都是借助于微生物發(fā)酵獲得，其基質(zhì)復(fù)雜，儀器法難以滿足準(zhǔn)確測(cè)定要求。生物素有8種同分異構(gòu)體，陳杰峰等[33]通過同位素內(nèi)標(biāo)和LC-MS/MS測(cè)定的嬰幼兒配方奶粉中B6和生物素含量，其中生物素質(zhì)控樣品測(cè)定值（每100 g 含0.1906 mg）低于質(zhì)控樣品特性值區(qū)間（每100 g 含1.346±0.093 mg），且6個(gè)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果普遍低于國標(biāo)法，最高偏差達(dá)3.9 %，可見LC-MS/MS并不能準(zhǔn)確測(cè)定嬰幼兒配方食品中生物素的含量。LC-MS/MS作為更先進(jìn)的手段，盡管具有較低的檢出限，更高靈敏度，更簡(jiǎn)單的操作，但是在特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品葉酸、生物素和維生素B12檢測(cè)的準(zhǔn)確性和全面性方面還存在缺陷。

2.5 微生物法

目前，傳統(tǒng)微生物法是我國現(xiàn)行檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也是美國官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）和美國藥典（USP）的推薦方法。我國現(xiàn)行檢測(cè)方法為：《GB5009.211-2014 食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉酸的測(cè)定》[34]、《GB5009.259-2016食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物素的測(cè)定》[35]和《GB5413.14-2010食品安全標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測(cè)定》[36]。

葉酸主要是以葉酸衍生物的形式存在[37]，最主要的天然葉酸形式包括[38]：5-甲酰四氫葉酸、5-甲基四氫葉酸、四氫葉酸和葉酸；不同葉酸衍生物又包含單谷氨酸形式和多聚谷氨酸形式的葉酸，具有生物活性的多達(dá)100余種[39-40]。生物素共有8種同分異構(gòu)體，但只有全順式結(jié)構(gòu)的D-生物素具有生理活性[41]，D-生物素的存在形式又分為游離狀態(tài)與結(jié)合狀態(tài)。維生素B12的存在形式也不單一。微生物法利用相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌種對(duì)特定維生素有很強(qiáng)的特異性，在一定條件下，其生長(zhǎng)和繁殖速度與溶液中維生素的含量成一定對(duì)應(yīng)關(guān)系；可測(cè)定具有生物活性的維生素，測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確，范圍廣，靈敏度高，能滿足含量低和基質(zhì)復(fù)雜的特殊食品檢測(cè)。

但是國標(biāo)中傳統(tǒng)微生物法的諸多缺點(diǎn)也限制了該法的實(shí)際應(yīng)用范圍。如葉酸、維生素B12對(duì)光敏感，分析過程均需避光操作，對(duì)環(huán)境要求高；實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵點(diǎn)多，且要求平行管之間結(jié)果偏差不得超過10 %；由于產(chǎn)品實(shí)際含量一般高于標(biāo)示值，精準(zhǔn)把握樣品稀釋倍數(shù)，使其落入合適的線性區(qū)間的難度加大，導(dǎo)致對(duì)檢驗(yàn)員的操作水平和檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)要求提高；為了保證測(cè)定用菌種的活力需傳代2～3代，萊士曼氏乳酸桿菌活力較差，菌種活化時(shí)間需2～4 d，維生素的檢測(cè)周期一般需要4～6 d；另外如果保存不當(dāng)或傳代過多，菌種易變異失去對(duì)維生素的特異性，嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果。葉酸測(cè)定中所使用的鼠李糖乳桿菌只可測(cè)定出單尾形式的葉酸或含2～3個(gè)谷氨酸尾的葉酸，對(duì)長(zhǎng)鏈的谷氨酸葉酸衍生物的響應(yīng)較弱[42]。生物素的8種異構(gòu)體中只有1種具有較高的生物活性，采用微生物法不能分離并測(cè)定出該種異構(gòu)體的含量。另外，陳緒華等[43]研究發(fā)現(xiàn)，國產(chǎn)培養(yǎng)所含本底較高，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較差。

此外，微生物法實(shí)驗(yàn)過程中需大量的玻璃器皿，所有玻璃器皿及用具均需嚴(yán)格清洗、酸泡和干熱滅菌，工作量較大。近年，研究人員也對(duì)國標(biāo)微生物法進(jìn)行了改進(jìn)。主要優(yōu)化方向是縮小反應(yīng)體系，如微孔板式定量檢測(cè)試劑盒。涂曉波等[44]對(duì)奶粉中生物素、葉酸及維生素B12，利用自主研發(fā)與進(jìn)口維生素檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)自主研發(fā)試劑盒操作較簡(jiǎn)便。楊小平等[45]采用EP管代替試管，通過等比例縮小反應(yīng)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中葉酸含量，加標(biāo)回收率為98 %-107.5 %。余文等[46]采用96孔板代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng)，酶標(biāo)儀代替分光光度計(jì)，實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)。但是也存在檢測(cè)結(jié)果偏低的情況，另外試劑盒比較昂貴，檢測(cè)成本高，普及率較低。諸多問題使微生物法將逐漸被其他簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法替代。

2.6 免疫法

免疫學(xué)分析技術(shù)是基于免疫學(xué)原理設(shè)計(jì)的對(duì)目標(biāo)樣本進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)手段。通過免疫分析技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原、抗體等免疫相關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。其中，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)，是目前最具有發(fā)展前景的技術(shù)之一，在特殊食品領(lǐng)域已逐步開始應(yīng)用。李江等[47]采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，得出嬰幼兒配方奶粉中維生素B12含量，快速靈敏、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、無需貴重儀器設(shè)備，檢出限3 μg/kg。葉酸測(cè)定中，由于單谷氨酸葉酸、多谷氨酸葉酸、葉酸衍生物與葉酸結(jié)合蛋白的親和性不相同，會(huì)影響測(cè)定的靈敏度，楊霈瑤[19]提出了通過制備葉酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的抗體，并在此基礎(chǔ)上利用酶免疫試驗(yàn)的基本原理，建立一種簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)方法。樂振竅等[48]采用ELISA測(cè)定功能食品中維生素B12的含量，結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度與AOAC方法達(dá)到同等效果。Kong等[49]開發(fā)了一種間接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)不同營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化中維生素B12的 4 種主要形式（氰鈷胺、羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲鈷胺）的方法，其檢測(cè)限為0.065 ng/ml，回收率為81 %～122 %。

此外，熒光免疫層析技術(shù)是免疫法中的基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的另一種新型膜檢測(cè)技術(shù)。主要基于抗原抗體特異性識(shí)別原理和層析反應(yīng)模式，能快速、準(zhǔn)確地測(cè)定特殊食品中維生素含量。劉海英[50]對(duì)生物素含量的檢測(cè)采用熒光微球免疫層析方法，熒光微球等發(fā)射光譜型標(biāo)記物因信號(hào)強(qiáng)度可隨激發(fā)光增強(qiáng)而增強(qiáng)，可有效降低層析方法的檢測(cè)限。以EDC/NHS介導(dǎo)的兩步法偶聯(lián)合成適用于免疫層析檢測(cè)的熒光微球探針。熒光微球探針粒度均一、化學(xué)及光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。以此建立的以生物素為目的物的免疫層析檢測(cè)方法，最終檢測(cè)限可達(dá)3 ng/ml，遠(yuǎn)低于其他檢測(cè)方法；靈敏度亦高于微生物法及HPLC，且檢測(cè)時(shí)間較短，檢測(cè)成本低廉。

3 討論

維生素B12、葉酸和生物素的檢測(cè)方法正處于優(yōu)化和創(chuàng)新的發(fā)展期，找到適合特殊食品中不同樣品基質(zhì)的最佳方法是目前研究人員的努力方向。分光光度法雖然操作簡(jiǎn)單，但測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度低和精確性差，因此不適于檢測(cè)特殊食品中3種維生素。熒光法可靠性存在缺陷，需要和其他檢測(cè)手段結(jié)合，由于生物素和維生素B12無紫外和熒光發(fā)色集團(tuán)，只適用于特殊膳食中葉酸測(cè)定，不適于其他特殊食品的測(cè)定；HPLC適用于添加形式明確，且含量較高的特殊膳食中3種維生素檢測(cè)，但對(duì)于某些基質(zhì)成分較復(fù)雜、含量低于儀器檢出限的特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品，檢測(cè)還存在缺陷。LC-MS/MS做為更先進(jìn)的手段，檢出限低，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，但準(zhǔn)確性和全面性方面還有不足。微生物法雖然是目前針對(duì)特殊食品這3種維生素的首選方法，特異性好、靈敏度較高，但由于操作關(guān)鍵點(diǎn)多，微生物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，工作量大，對(duì)環(huán)境、人員、菌種和培養(yǎng)基要求高等問題，應(yīng)用有限；相比之下，作為目前研究熱點(diǎn)的免疫法而言，有檢驗(yàn)靈敏度高、檢測(cè)限低、特異性好、樣本處理量大、檢驗(yàn)時(shí)間短、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、無需貴重儀器設(shè)備等諸多優(yōu)點(diǎn)，更適用于特殊食品，尤其是特醫(yī)食品和嬰幼兒配方食品的檢測(cè)，具有廣泛的開發(fā)空間和應(yīng)用前景。