◎ 方 亮，付圣麟，蘇廣林，林建添，詹穎馨，歐小云，劉 斌

（1.廣西大學(xué)食用菌研究所，廣西 南寧 530005；2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院應(yīng)用微生物研究所，廣西 南寧 530005）

黑牛肝菌（Phlebopus portentosus），又名黑牛肝，具有很高的經(jīng)濟價值[1]。黑牛肝菌子實體常單生于鳳凰木以及竹林間[2]，菌絲海綿質(zhì)，淡黃色至褐色[3]。黑牛肝菌的菌絲蔓延速度受外界條件影響大[4]，菌絲體適宜pH=3～9、溫度10～40 ℃[5]，菌絲的繼代老化現(xiàn)象明顯，是生產(chǎn)上急需探究和解決的問題[6]，SOD酶有Mn-SOD，F(xiàn)e-SOD以及Cu,Zn-SOD，作為同工酶在機體細胞中起抗氧化等保護功能[7]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實驗所用菌種PH-16為野生黑牛肝菌株，采集自廣西大學(xué)校園；PH-20為栽培種菌株，購自南寧市華潤市場（均經(jīng)形態(tài)鑒定與分子鑒定確定種屬）。MgSO4、K2HPO4等試劑購于天津博迪化工有限公司和上海麥克林生物科技公司。FE20精密pH計（美國Mettler-Toledo有限公司）、RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海凱儀設(shè)備有限公司）、Himac-CR21N高速冷凍離心機（日本HITACHI有限公司）及iMark-19301自動酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD有限公司）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌絲體蛋白含量測定、純化與SOD酶活測定

取發(fā)酵液 100 mL，經(jīng) 4 000 r·min-1，4 ℃，20 min離心，取2.0 g菌絲體冷凍研磨至勻漿，考馬斯亮藍G-250法測定蛋白含量，沒食子酸自氧化法測定酶活，具體操作方法參照文獻[7]。

丙酮沉降法純化。在新制備的菌絲體蛋白提取液中加入1.2倍體積-20 ℃預(yù)冷丙酮，-4 ℃靜置2 h，8 000 r·min-1，5 min去上清液，冷凍干燥沉淀，計算回收率[7]?；厥章?（M1/M）×100%，其中M1表示菌絲提取液加入量，單位為mg；M表示處理回收得到的沉淀，單位為mg。

硫酸銨分級沉降法純化。蛋白提取液中，加硫酸銨至30%飽和度，冰浴攪拌1 h，4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min。取上清液并再加硫酸銨至90%飽和度，離心合并沉淀，操作參數(shù)與計算同上。

丙酮-硫酸銨分級沉降聯(lián)用法。在丙酮沉降法獲得蛋白質(zhì)沉淀后，磷酸緩沖液復(fù)溶沉淀，再以硫酸銨分級沉降蛋白質(zhì)溶液，獲得蛋白質(zhì)，操作參數(shù)及回收率計算同上。

1.2.2 黑牛肝菌Cu,Zn-SOD酶類型鑒定

測 定 體 系 中 設(shè) 置 H2O2濃 度 梯 度 0 mmol·L-1、2.0 mmol·L-1、4.0 mmol·L-1以及 6.0 mmol·L-1。設(shè)置乙醇-氯仿（v∶v=3∶5）與酶液體積倍數(shù)梯度0倍、1.0倍、2.0倍以及3.0倍[8]，其余操作均一致，檢測SOD酶活性變化。

1.2.3 黑牛肝菌SOD酶活穩(wěn)定性因素探究

將 酶 液 pH 調(diào) 整 為 pH=4.5、pH=5.0、pH=5.5、pH=6.0、pH=7.5、pH=8.0、pH=8.5以及 pH=9.0的梯度，分別置于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃以及40 ℃金屬浴20 min，檢測SOD酶活性變化。SOD供試液4 ℃保藏0 d、1 d、3 d和5 d，以上述最適條件，測定酶活性變化，操作與1.2.1一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體蛋白純化方法對比分析

如表1所示，實驗表明方案3 SOD酶比活力最高，方案1沉降方案，蛋白質(zhì)回收率最低，且酶活最低。

表1 三種蛋白質(zhì)純化方法對比分析表

2.2 黑牛肝菌SOD酶類型鑒定

如圖1所示，PH-16和PH-20 SOD酶在各濃度的H2O2中迅速下降，2 mmol·L-1H2O2使 PH-16和 PH-20 SOD酶活性分別下降52.7%、39.4%，6 mmol·L-1H2O2使SOD酶殘余酶活分別下降25.4%、33.1%，隨著H2O2濃度升高，SOD酶活表現(xiàn)出不穩(wěn)定性。PH-16 SOD和PH-20 SOD酶均對乙醇-氯仿濃度變化保持活性穩(wěn)定。

2.3 黑牛肝菌SOD酶活穩(wěn)定性因素探究

如圖2（a）所示，PH-16與PH-20 SOD酶分別在pH=5.5、pH=6.5時活性最高。PH-16 SOD酶在pH＞6.0時，活性顯著降低，pH=8.0時活性下降超過60%，PH-20 SOD酶在pH＞6.5時，活性下降迅速，在pH=6.0～6.5保持高活性。如圖2（b）所示，PH-16與PH-20 SOD酶在低于25 ℃時，酶活性與溫度呈正相關(guān)，兩種SOD最高酶活溫度分別為25 ℃和30 ℃。PH-16 SOD酶在溫度超過30 ℃后，酶活性顯著下降，酶活穩(wěn)定范圍為25～30 ℃，PH-20 SOD酶活穩(wěn)定范圍為25～35 ℃。結(jié)合圖2（c）可知，PH-16與PH-20 SOD酶在4 ℃，5 d內(nèi)酶活分別剩余52.3%和70.5%，PH-16與PH-20 SOD酶5 d內(nèi)活性平均衰退速率分別為 16.2 U·mL-1·d-1和 8.5 U·mL-1·d-1，低溫短期保藏黑牛肝菌SOD酶，其活性衰減幅度小，但隨著保藏時間延長活性下降速度加快。

3 結(jié)論

本實驗根據(jù)PH-16與PH-20 SOD酶的化學(xué)穩(wěn)定性差異，確定為Cu,Zn-SOD酶。其最高酶活條件分別為pH=5.5和pH=6.5，溫度25 ℃和30 ℃，活性平均衰退速率 16.2 U·mL-1·d-1和 8.5 U·mL-1·d-1；丙酮 -硫酸銨聯(lián)用法能提高蛋白質(zhì)純化倍數(shù)，減少酶活性損耗。PH-20 SOD的穩(wěn)定性優(yōu)于野生種PH-16 SOD，表明經(jīng)人工選育的黑牛肝菌，其菌絲體對pH、溫度等因素變化具有更強的適應(yīng)力。