呂銘軒，陳兆學(xué)

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

0 引言

結(jié)核病是因機體感染結(jié)核分枝桿菌所引起的一種慢性傳染病。據(jù)統(tǒng)計，中國每年因結(jié)核病死亡的人數(shù)高達13 萬。因此，對結(jié)核病潛伏期感染的診斷以及防治工作十分重要。研究表明，結(jié)核感染T 細胞檢測，對結(jié)核病具有較低的不確定性和良好的特異性，是近年來國內(nèi)外結(jié)核感染診斷的一種可靠方法。該方法中，T 細胞斑點數(shù)量是診斷患者是否結(jié)核感染的依據(jù)，快速且準確地檢測出菌斑數(shù)量是臨床研究的一個重點和難點問題。隨著計算機技術(shù)高速發(fā)展和圖像處理技術(shù)日趨成熟，利用計算機自動計數(shù)來取代耗時長、效率低的傳統(tǒng)人工計數(shù)已是大勢所趨。

針對于此，研究人員提出了各種菌落自動分割和計數(shù)算法。如：Mohammad I Shah提出了一種基于分水嶺分割的細菌自動檢測和分類方法，在分水嶺分割之前加入預(yù)處理技術(shù)，用于去除大于或小于細菌的偽影和干擾目標，最終對結(jié)核陽性圖像細菌檢測的靈敏度和精確度達到90.3%和77%。桑艷艷等提出了一種針對菌落圖像改進的分水嶺分割算法。在分割之前先對圖像進行倒角距離變換和形態(tài)學(xué)處理，再利用區(qū)域合并算法聚集圖像相似區(qū)域，很好地抑制了分水嶺算法的過分割現(xiàn)象。張力新等提出了一種基于改進水平集的全自動菌落分割計數(shù)方法。該方法利用偏置場對背景建模來消除背景灰度的不均勻性，并構(gòu)造了多相水平集算法，實現(xiàn)菌落目標的自適應(yīng)分割。雖然以上算法在各自的實驗對象上都取得了不錯的分割效果，但由于在T細胞斑點試驗中，形成的不同菌斑區(qū)域之間的灰度及形狀大小往往會存在很大差異，而當前已有的菌斑自動計數(shù)算法大多是針對特定類型的菌斑圖像進行研究的，針對性較強但魯棒性差，難以對T 細胞菌斑圖像實現(xiàn)自適應(yīng)和精準的分割。

為解決T 細胞粘連菌斑圖像的分割和計數(shù)問題，本文設(shè)計了一種基于改進分水嶺算法的全自動T 細胞菌斑分割的計數(shù)算法。

1 算法流程

在T 細胞斑點試驗中，抗原刺激誘導(dǎo)的斑點特征是清晰的深色圓點，實際計數(shù)應(yīng)忽略小的及不清晰的斑點，僅對清晰的斑點進行計數(shù)。圖1 所示為人工計數(shù)的6 組樣例。

圖1 計數(shù)規(guī)則示例圖Fig.1 Example diagram of counting rules

根據(jù)T 細胞菌斑圖像的特點和相關(guān)計數(shù)規(guī)定，本文設(shè)計的改進分水嶺分割方法的過程主要包括以下3個基本步驟：

（1）預(yù)處理：包括消除背景和對圖像進行濾波降噪，主要目的是去除無效區(qū)域和噪聲干擾，增強圖像質(zhì)量。

（2）粘連區(qū)域識別：通過閾值分割、形態(tài)學(xué)處理和面積濾波等方法，找出圖像中的大面積菌斑區(qū)域。

（3）分割計數(shù)：將圖像分為大面積菌斑區(qū)域和小面積菌斑區(qū)域，利用標記分水嶺算法分別對兩類區(qū)域進行分割，合并分割結(jié)果并統(tǒng)計連通域數(shù)目得到最終計數(shù)結(jié)果。系統(tǒng)整體流程如圖2 所示。

圖2 T 細胞菌斑圖像自動分割和計數(shù)算法流程Fig.2 Algorithm flow for automatic segmentation and counting of T cell plaque images

2 算法實現(xiàn)

2.1 消除背景

原始菌斑圖像如圖3（a）所示。原始菌斑圖像常包含環(huán)境背景，如顯微設(shè)備光源對細胞圖像的鏡像反射部分及其干擾區(qū)域。為了避免這些因素對圖像處理的影響，同時減少計算負擔(dān)、提高算法效率，需先將目標培養(yǎng)皿識別并提取出來。本文使用霍夫變換提取出培養(yǎng)皿區(qū)域，消除背景干擾?；舴蜃儞Q是圖像處理中常用的檢測算法，能夠從較大的噪聲環(huán)境中提取出圖像里具有某種相同特征的幾何形狀（如直線、圓等）。本文基于霍夫變換實現(xiàn)圓形圖像目標檢測方法實現(xiàn)原理為：首先對原始圖像進行二值化處理，通過邊緣檢測獲取圖像邊界點。如果圖像中存在圓形，那么圓的輪廓一定屬于邊界點。圓的邊緣點的一般表達式為：

其中，（，）為圓心，（X，Y）為圓上的點，即待檢測圓所對應(yīng)邊界點。

若轉(zhuǎn)換一下視角，把（X，Y）看成圓心坐標，（，）理論上當對應(yīng)以各邊緣點為圓心、半徑為的一系列圓的公共交點。因為數(shù)字圖像中圓形表達的誤差和邊界點檢測誤差的存在，各圓之交點實際上分布在以（，）點為中心的一個小區(qū)域中，而半徑也有微小誤差。因此，霍夫變換常常首先限定一個包含圓心坐標的二維區(qū)域，基于枚舉其中（，）組合，并針對所有邊緣點（X，Y）依照式（1）進行計算，對所得的在預(yù)估的（，，）參數(shù)空間中的對應(yīng)位置進行投票，最后選取得票數(shù)最多的（，，）參數(shù)組合，作為圖像中所檢測到的圓的參數(shù)。本文基于該方法可以確定培養(yǎng)皿所對應(yīng)圓的圓心和半徑參數(shù)，進而獲得有效的培養(yǎng)皿區(qū)域。經(jīng)霍夫變換得到的結(jié)果如圖3（b）所示。

圖3 原始圖像和提取出的有效計數(shù)區(qū)域Fig.3 Original image and extracted effective counting area

2.2 濾波降噪

通過濾波處理，消除圖像數(shù)據(jù)中可能存在的一些噪聲污染。本文分別使用均值濾波、中值濾波、雙邊濾波對圖像進行處理。通過實驗對比發(fā)現(xiàn)：均值濾波處理后的菌斑圖像會變模糊，會導(dǎo)致后續(xù)的粘連菌斑的識別非常困難。雙邊濾波計算量較大，實驗中取到的原始菌斑圖像大小均為3 288×4 608，因此耗時過長。中值濾波在平滑脈沖噪聲方面有很好的去噪效果，同時還保留了圖像的尖銳邊緣，但可能會將圖像中的細小菌斑當成噪聲誤處理掉，而本文中T 細胞菌斑計數(shù)任務(wù)要求忽略小的斑點，正好將此缺點轉(zhuǎn)換成了優(yōu)勢。因此中值濾波非常適合本論文算法的處理要求。圖4 分別是均值濾波和中值濾波處理后的結(jié)果。從中可以看出，與均值濾波相比，中值濾波結(jié)果的對比度更好。

圖4 濾波效果的比較Fig.4 Comparison of filtering effects

2.3 二值化

把灰度圖像轉(zhuǎn)化為二值圖像時，通常是設(shè)定一個灰度閾值，根據(jù)圖像中每個像素點的灰度是否達到該閾值，來判斷該點屬于背景區(qū)域還是目標區(qū)域。其公式如下：

其中，是設(shè)定的閾值，確定合適的值是達到好的分割效果的關(guān)鍵。

二值分割常用的方法是最大類間方差（Qstu）法，直接使用該方法得到的效果如圖5（a）所示。可以看到，部分背景區(qū)域被劃分到了目標區(qū)域，尤其是菌斑粘連的區(qū)域，輪廓失真較為嚴重，這與培養(yǎng)皿圖像中包含大量灰度與背景十分接近的菌斑區(qū)域相關(guān)。因此，對于本文研究的菌斑圖像，單一閾值的分割效果往往不盡人意，若采用局部閾值算法，則計算量又過大。為此，本文根據(jù)菌斑圖像的特點，使用一種改進的閾值解決該問題，其具體算法是：把最大類間方差法得到的二值化圖像看成一個掩膜，與原圖像相乘，得到不含菌斑的背景部分；計算背景部分的平均灰度得到閾值，再基于閾值得到最后的二值化結(jié)果。本文算法的處理結(jié)果圖5（b）所示，可見其分割效果得到了明顯改善。

圖5 二值化效果圖對比Fig.5 Comparison of binarization effect diagrams

2.4 傳統(tǒng)分水嶺算法

本次研究使用分水嶺算法對圖像進行分割，該算法的思想源自于地形學(xué)，其原理是把一幅圖像視為跌宕起伏的地形曲面，采用浸水模型對圖像進行分割。傳統(tǒng)分水嶺算法對細微邊緣、噪聲和細小的灰度變化敏感，將其直接用于梯度圖像時，噪聲和梯度的其它局部不規(guī)則性常常會導(dǎo)致過分割。解決該問題的一種方法是加入一個預(yù)處理階段，將其他相關(guān)知識帶到分割過程中，從而限制允許的區(qū)域數(shù)目。通過對標記符的控制來抑制過量分割區(qū)域的產(chǎn)生。具體實現(xiàn)方法分為以下幾步：

第一步：對二值化處理后的圖像進行歐氏距離變換，得到一副灰度圖像；對該圖像使用分水嶺變換得到分，即標記背景標記。

第二步：利用擴展最小值變換，提取圖像的局部極小值作為內(nèi)部標記符。

第三步：利用強制最小技術(shù)產(chǎn)生梯度圖像的局部最小值，對修改后的圖像進行分水嶺分割。完成分割后，采用四鄰域標準遍歷搜索圖像連通域，標記排序每個連通域?qū)崿F(xiàn)計數(shù)。

擴展最小值變換在Matlab 中可以直接調(diào)用函數(shù)（，）來實現(xiàn)。其中，是輸入圖像，為最小值變換的區(qū)域最小值，參數(shù)的選取會影響最終分割結(jié)果。圖6 是直接使用標記分水嶺算法分割后的部分區(qū)域結(jié)果，其中圖6（a）參數(shù)設(shè)置為50，部分粘連區(qū)域的菌斑無法被準確分割出來，圖6（b）參數(shù)設(shè)置10 時，產(chǎn)生了大量過分割現(xiàn)象。通過多次改變參數(shù)發(fā)現(xiàn)，由于T 細胞菌斑圖像本身的特點，無論怎么改變參數(shù)，對全局進行一次性標記分水嶺分割得到的結(jié)果均無法令人滿意。

圖6 傳統(tǒng)分水嶺算法處理后的部分區(qū)域Fig.6 Part of the area processed by the traditional watershed algorithm

2.5 改進分水嶺算法

為了解決上述問題，本文結(jié)合形態(tài)學(xué)處理和面積濾波技術(shù)，對分水嶺算法進行了改進。在分割前對圖像進行粘連區(qū)域識別，并根據(jù)菌斑面積的大小，將圖像分成兩個部分。具體實現(xiàn)方法如下：

第一步：對二值化后的圖像進行形態(tài)學(xué)處理。

第二步：對形態(tài)學(xué)處理后的圖像進行連通域統(tǒng)計，設(shè)定一個面積閾值，根據(jù)菌斑面積的大小將圖像分成兩個區(qū)域。

第三步：分別對兩個區(qū)域的圖像進行分水嶺分割，合并兩幅圖像得到最終分割結(jié)果。

利用形態(tài)學(xué)中最基本的膨脹和腐蝕運算，可以進一步對二值化圖像進行處理，以改善分割效果。

膨脹運算公式為：

式中，為待處理圖像，為結(jié)構(gòu)元素。

圖像被結(jié)構(gòu)元素所膨脹，實際就是計算該點局部范圍內(nèi)各點與結(jié)構(gòu)元素中對應(yīng)點的灰度值相加，并選取最大值作為該點的膨脹結(jié)果。該運算可以起到邊界點擴充和連接內(nèi)部縫隙的作用。

腐蝕運算可以切斷粘連對象間的細小連接，消除細小噪聲，其運算公式為：

通過對這兩種算法不同順序的結(jié)合使用，以及對不同形狀大小的結(jié)構(gòu)元素的選取，可以擴展形態(tài)學(xué)圖像處理。如圖7 所示。

圖7 形態(tài)學(xué)處理前后的對比圖Fig.7 Comparison chart before and after morphological processing

圖7（a）是形態(tài)學(xué)處理前的圖像，從中選取了3處細節(jié)放大，由此可見圖像中存在的問題：

（1）對象輪廓十分粗糙，整體存在很多雜質(zhì)和噪聲。

（2）對象間存在細小連接。

（3）對象內(nèi)部有小孔洞。

圖7（b）是選取半徑為5的圓形結(jié)構(gòu)元素，對圖像進行先腐蝕再膨脹得到的結(jié)果。從局部放大圖中可以看到，形態(tài)學(xué)處理可以讓菌落輪廓變得光滑，同時剔除了一些雜質(zhì)點和偽菌落。

對形態(tài)學(xué)處理后的圖像進行連通域統(tǒng)計，并通過面積濾波刪除小面積對象，將得到的新二值圖像構(gòu)成一個掩膜。將該掩膜與原圖像相乘，并把其它部分置為背景灰度，得到圖像的大面積菌斑區(qū)域。在這一過程中，本文設(shè)置的面積閾值為50，即像素點大于50的區(qū)域被視為大面積菌斑區(qū)域，該區(qū)域包含粘連菌斑，需要進一步進行二次分割提高計數(shù)精度。如圖8 所示，圖8（a）是大面積菌斑區(qū)域，包含了所有粘連菌斑。圖8（b）是小面積菌斑區(qū)域，包含了所有滿足計數(shù)條件的菌斑。

圖8 大面積菌斑區(qū)域和小面積菌斑區(qū)域Fig.8 Large plaque area and small plaque area

使用改進后的算法得到結(jié)果如圖9 所示，其中圖9（a）是對圖像的第一次分割，僅檢測面積較小的菌斑區(qū)域，所有被檢測出來的菌斑均用“+”符號標記。圖9（b）是針對面積較大菌斑區(qū)域的二次分割。可以看出，粘連區(qū)域的菌斑被準確識別并用“.”符號標記出來。合并兩次處理結(jié)果得到的最終效果如圖10 所示。結(jié)果表明，本文算法能夠精準的識別出粘連菌斑，同時能有效排除面積或灰度未達到計數(shù)規(guī)定的菌斑。

圖9 本文算法處理后的部分區(qū)域Fig.9 Part of the area processed by the algorithm in this paper

圖10 本文算法最終結(jié)果Fig.10 The final result of the algorithm in this paper

3 實驗結(jié)果分析

為了測試本文算法的有效性和穩(wěn)定性，對復(fù)星醫(yī)藥集團股份公司提供的一組菌斑圖像進行實驗驗證。實驗選取的原始圖片大小均為3 288×4 608；實驗平臺為window10、CPU 為AMD3900X、MATLAB版本為2019b。

通過與傳統(tǒng)標記分水嶺算法的計數(shù)結(jié)果以及人工計數(shù)結(jié)果進行比對，來驗證本文算法的有效性。圖11 是選取的4個具有代表性的菌斑樣本的分割結(jié)果。其中，培養(yǎng)皿A 透光均勻，菌斑清晰可見且數(shù)量很少，幾乎沒有粘連現(xiàn)象，計數(shù)最為簡單；培養(yǎng)皿B 存在部分粘連菌斑，總體菌落相對較清晰，是本次實驗中最常見的一類圖像；培養(yǎng)皿C 中的菌落分布比較密集，對于這一類圖像，人工計數(shù)比較吃力；培養(yǎng)皿D 中的菌斑灰度非常不均勻，偽陰影過多且粘連現(xiàn)象太過嚴重，即使是肉眼也難以分辨。表1 是圖11 中的計數(shù)結(jié)果以及對剩余50 多個菌斑樣本計數(shù)的平均結(jié)果。其中，人工計數(shù)的結(jié)果是由10個人分別計數(shù)，去掉最大值和最小值取平均得到的。準確率由該算法得到的計數(shù)結(jié)果除以人工計數(shù)結(jié)果得到。

圖11 培養(yǎng)皿圖像的分割結(jié)果Fig.11 Select the segmentation results of four petri dish images

表1 結(jié)核感染T 細胞菌斑圖像計數(shù)結(jié)果Tab.1 Results of image count of plaque of T cells infected by tuberculosis

實驗結(jié)果表明，除了少量如培養(yǎng)皿D 這一類的菌斑圖像（實際臨床得到的這種圖像通常都是斑點飽和的陽性對照，不需要準確計數(shù)。），本文的算法對結(jié)核感染T 細胞菌斑圖像的檢測準確率均在95%以上，耗時30 s 以內(nèi)。相較于傳統(tǒng)的標記分水嶺算法，本文算法大大提高了計數(shù)精度。

4 結(jié)束語

本文根據(jù)T 細胞菌斑圖像的特點，設(shè)計了一種基于改進分水嶺算法的菌斑檢測方法。在傳統(tǒng)標記分水嶺算法的基礎(chǔ)上，加入了一個粘連區(qū)域識別的階段，通過把圖像分成兩部分并分別分割，大大提高了分割精度，有效抑制了傳統(tǒng)分水嶺算法的過分割現(xiàn)象。實驗證明，本文的算法滿足T 細胞菌斑圖像的計數(shù)要求，對T 細胞菌斑圖像有良好的分割效果。由于本文算法只需稍作修改，因此也適用于其它具有類似特征的菌斑或細胞圖像的分割，應(yīng)用前景較廣。