徐鳴，萬金慶,2,3*，侯博玉

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，上海，201306)

鱖魚(Sinipercachuatsi),又稱桂花魚，是鮨科、鱖屬的魚類，魚肉有補氣血、益脾胃之功能，具有重要的經(jīng)濟價值[1]。發(fā)酵是用于食品保存的一種常見加工方式，在改善食品營養(yǎng)和功能特性方面起著重要作用[2]，在發(fā)酵作用下，魚體內(nèi)的脂肪、蛋白質(zhì)及其他有機物降解成游離脂肪酸、氨基酸、核苷酸和其他小分子物質(zhì)，給予魚肉特殊的滋味，深受消費者們的喜愛[3-4]。傳統(tǒng)發(fā)酵鱖魚的制作是在新鮮鱖魚中加入鹽份，于10～20 ℃條件下發(fā)酵1周左右制成。雖然所需時間短，但得到的成品會含鹽量偏高，腥臭味重，風(fēng)味差。為了提發(fā)酵鱖魚品質(zhì)，廠家開始改用低溫低鹽的發(fā)酵方式，雖然發(fā)酵時間相對較長，但魚肉的品質(zhì)滋味更佳[5-6]。本實驗更進(jìn)一步降低溫度，采用冰溫發(fā)酵的方法對鱖魚進(jìn)行發(fā)酵，并與常溫下發(fā)酵相對比，研究發(fā)酵過程中魚肉的生物胺、核苷酸、游離氨基酸、感官評價以及pH、微生物、總揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)等指標(biāo)，為冰溫發(fā)酵鱖魚提升產(chǎn)品品質(zhì)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

生物胺是一類具有生物活性的低分子質(zhì)量含氮有機化合物的總稱，在水產(chǎn)品中尤其是發(fā)酵水產(chǎn)品中普遍存在[7]。人體內(nèi)源性生物胺是活性細(xì)胞內(nèi)不可或缺的化合物，可以起到調(diào)節(jié)血壓以及血糖的濃度，調(diào)節(jié)DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成，以及抗氧化的作用，但攝入過多生物胺會引起頭疼、腸胃不適、甚至導(dǎo)致中毒及危害生命[8]，因此，生物胺可以作為水產(chǎn)品品質(zhì)及安全的重要指標(biāo)，而生物胺的安全限量沒有統(tǒng)一的國際標(biāo)準(zhǔn)。美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)限定人體攝入組胺和酪胺的含量不超過50 mg/kg，酪胺和苯乙胺含量不得超過100～800 mg/kg和30 mg/kg[9],歐洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)規(guī)定水產(chǎn)品中組胺的含量在100～200 mg/kg[10]。食品中生物胺的總量超過1 000 mg/kg，將誘發(fā)人體中毒[11]。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

新鮮鱖魚、食用鈉鹽，上海臨港新城農(nóng)工商超市。

生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，上海生工公司；衍生試劑丹磺酰氯(dansyl chloride，DNS-Cl)、乙腈(色譜純)、乙醚(分析純)、丙酮(分析純)、氨水(分析純)、乙酸銨(色譜純)，上海泰坦科技股份公司；三氯乙酸、高氯酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氯化鈉、平板計數(shù)瓊脂、MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LHS-150HC恒溫恒濕箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀，丹麥FOSS；L-8800氨基酸全自動分析儀，日本Hitachi；W2690/5高效液相色譜儀，美國Waters；Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國Waters公司；濾膜針頭濾器(13 mm，0.22 μm)，上海安譜實驗科技股份有限公司；A25實驗室小型均質(zhì)機，上海福克設(shè)備有限公司；垂直流SW-CJ-2F超凈工作臺，蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

將新鮮鱖魚宰殺，去鱗去內(nèi)臟，洗凈后切成大小相近的魚塊，加入3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的食用鹽均勻涂抹并整齊鋪滿發(fā)酵盒，蓋上蓋子。取兩塊魚肉于-18 ℃的冰箱中，將溫度采集儀的熱電偶固定于魚肉中心位置，10 s記錄1次溫度，至魚肉完全凍結(jié)，得到魚肉的冰點為-2.5 ℃。將上述魚肉分別置于10、-1.5 ℃的恒溫恒濕箱中發(fā)酵。10 ℃條件下的魚發(fā)酵4 d，每隔1 d取1次樣，冰溫條件下的魚發(fā)酵15 d，每隔3 d取1次樣，取樣品真空包裝于-18 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 pH測定

參考并改進(jìn)CHEN等[12]的方法，切碎取肉糜2.0 g，加入蒸餾水18 mL,均質(zhì)，8 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行測定。

1.3.3 微生物含量測定

參考并改進(jìn)GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)的測定》和曾雪峰[13]的方法，每組魚肉樣品無菌操作取樣3 g，切碎后加入27 mL無菌生理鹽水(0.9 g/L)，均質(zhì)15 min，梯度稀釋，選取3個適宜稀釋度的樣液，取0.1 mL 的樣液傾注在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測定不同的微生物數(shù)量，每個樣液做3個平行。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)用MRS培養(yǎng)基，30 ℃下培養(yǎng)2～3 d;酵母用PDA 培養(yǎng)基，25 ℃下培養(yǎng)3～4 d，菌落總數(shù)(total viable counts，TVC)用PCA平板計數(shù)培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3 d，進(jìn)行菌落總數(shù)計算，以lgCFU/g表示。

1.3.4 TVB-N測定

依據(jù) GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的分析方法測定TVB-N值。

1.3.5 呈味核苷酸測定

參考徐美祿等[14]方法略有改動。取3.0 g發(fā)酵魚肉，加入10 mL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))高氯酸溶液勻漿，超聲處理5 min后離心(4 ℃，10 000 r/min，15 min)取上清液，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))高氯酸5 mL 洗滌沉淀，相同條件下離心，合并2次上清液。使用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，用50 mL容量瓶定容，搖勻后0.22 μm水相濾膜過濾打入進(jìn)樣瓶進(jìn)行測定。試驗采用GL Inertsil ODS-3 色譜柱(4.6 mm×250 mm)等梯度洗脫，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，紫外254 nm檢測。

1.3.6 游離氨基酸測定

參考WANG等[15]的方法并有所改動。稱取2.0 g 樣品，加入15 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸溶液，勻漿，超聲處理5 min，4 ℃靜置2 h，離心(4 ℃，10 000 r/min，10 min)，取上清液5.0 mL，氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至2.0，10 mL容量瓶定容，搖勻后0.22 μm水相濾膜過濾打入氨基酸全自動分析儀進(jìn)樣瓶進(jìn)行測定。

1.3.7 生物胺測定

生物胺的提取參照GIGIREY等[16]的方法。稱取2 g魚肉，加入10 mL 0.4 mol/L的高氯酸，均質(zhì)10 min，均質(zhì)液在12 000×g冷凍離心10 min，重復(fù)2次提取后收集上清液，用0.4 mol/L 的高氯酸定容至25 mL。

生物胺的衍生參照GIGIREY等[16]的方法進(jìn)行。取1 mL的提取液加入200 μL 2 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，再加入300 μL飽和碳酸氫鈉和2 mL的丹磺酰氯(10 mg/mL)混合均勻，在40 ℃水浴45 min，然后加入100 μL氨水(25 g/L)，室溫下避光靜置40 min，用乙腈定容到5 mL。最后，取上清液過0.45 μm有機相膜打入進(jìn)樣瓶待測。

1.3.8 味精當(dāng)量(equivalent umami concentration，EUC)的計算

EUC[17]表示呈味核苷酸和鮮味氨基酸在協(xié)同作用下產(chǎn)生的鮮味強度，是以谷氨酸鈉(monosodium glutamate，MSG)的含量來表示100.0 g樣品中總呈鮮物質(zhì)的量。其計算如公式(1)所示:

EUC=∑aibi+1 218(∑aibi)×(∑ajbj)

(1)

式中：EUC，g MSG/100g；ai表示Asp和Glu(鮮味氨基酸)含量，g/100g；bi表示Asp和Glu相對于MSG的鮮度系數(shù)(其中Glu=1.0，Asp=0.077)；aj表示呈味核苷酸肌苷酸(inosine monphosphate，IMP)、單磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)的含量，g/100g；bj表示呈味核苷酸相對于IMP的鮮度系數(shù)(其中IMP=1.0，AMP=0.18)；1 218是協(xié)同作用系數(shù)。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

利用Origin lab 2017 軟件繪制曲線，用Excel 2010和SPSS 25.0軟件分析單因素ANOVA檢驗來進(jìn)行顯著性和方差分析，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸含量變化

2組不同條件下鱖魚發(fā)酵過程中的氨基酸含量變化如表1、表2所示，2組魚肉中游離氨基酸含量均隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行逐漸增加，有顯著性差異(P<0.05)。冰溫發(fā)酵過程中，鮮味谷氨酸含量從9.46 mg/100g增加到第15天的38.24 mg/100g，增加近4倍，在第15天達(dá)到閾值，谷氨酸對呈現(xiàn)鮮味做出貢獻(xiàn)。天冬氨酸在第15天達(dá)到最高值13.96 mg/100g，但始終未達(dá)到閾值，因此，天冬氨酸在整個過程中對鮮味的影響不大。鮮味氨基酸總量最高為52.60 mg/100g。10 ℃發(fā)酵過程中，谷氨酸和天冬氨酸及鮮味氨基酸總含量均在第3天達(dá)到最高值分別為31.20、12.24、43.44 mg/100g，其中，天冬氨酸同樣始終未達(dá)到閾值，鮮味氨基酸總量小于冰溫發(fā)酵鮮味氨基酸總量；冰溫發(fā)酵過程中總氨基酸含量在第15天達(dá)到最高值757.85 mg/100g，10 ℃發(fā)酵過程中總氨基酸含量在第3天達(dá)到最高值579.44 mg/100g，有顯著性差異(P<0.05)，由以上分析可知，冰溫發(fā)酵鱖魚能夠明顯增加魚肉中總游離氨基酸含量和鮮味氨基酸含量，提升鱖魚的滋味。

表1 鱖魚冰溫發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化 單位:mg/100g

2.2 呈味核苷酸及EUC的變化

發(fā)酵過程中AMP、IMP和肌苷(inosine，HxR)含量具體變化見圖1。AMP、IMP和HxR是鱖魚發(fā)酵過程中主要的呈味核苷酸，IMP是最主要的呈鮮味氨基酸，AMP具有甜味、鮮味等品質(zhì)，并且與Asp、Glu等會產(chǎn)生協(xié)同作用，呈現(xiàn)更強烈的鮮味[18-19]，HxR具有苦味，是ATP降解的最終產(chǎn)物之一。由圖1可知，冰溫發(fā)酵第15天魚肉中IMP含量為43.58 mg/100g，10 ℃發(fā)酵4 d魚肉中IMP含量為26.11 mg/100g，有顯著差異(P<0.05)，IMP的閾值為25 mg/100g，在冰溫發(fā)酵過程中，IMP含量始終大于閾值，所以，整個發(fā)酵過程中IMP始終對滋味起著重要貢獻(xiàn)作用。雖然HxR對魚肉滋味有負(fù)面作用，但發(fā)酵鱖魚成品中的游離氨基酸、短鏈肽以及其他呈味核苷酸會掩蓋弱化苦味，優(yōu)化魚肉滋味品質(zhì)。

表2 鱖魚10 ℃發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化 單位:mg/100g

a-冰溫發(fā)酵；b-10 ℃發(fā)酵圖1 發(fā)酵過程中呈味核苷酸含量變化Fig.1 Changes of flavor nucleotide contents

呈味氨基酸和鮮味氨基酸協(xié)同作用具有增鮮效果，根據(jù)表3中數(shù)據(jù)可以看出，EUC隨著發(fā)酵過程呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，2組發(fā)酵魚肉中的EUC均比新鮮魚肉要高，冰溫發(fā)酵15 d EUC達(dá)到最高值4.31 g MSG/100g，10 ℃發(fā)酵在第3天達(dá)到最高值3.52 g MSG/100g，隨后顯著降低。因此，冰溫發(fā)酵相對于10 ℃發(fā)酵能夠更好地提升魚肉鮮味。

表3 鱖魚發(fā)酵過程中EUC的變化 單位：g MSG/100g

2.3 生物胺含量的變化

冰溫和10 ℃ 發(fā)酵過程中生物胺含量變化如表4所示，對新鮮鱖魚進(jìn)行生物胺含量的檢測得到其中組胺含量為10.95 mg/kg，酪胺含量為0.30 mg/kg，精胺1.47 mg/kg，其他生物胺均未檢測出，總胺含量為12.73 mg/kg。

2.4 pH和微生物的變化

隨著發(fā)酵時間的增長，內(nèi)源性和外源性氨基酸脫羧酶作用于游離氨基酸上形成生物胺[11]。由表4可知，冰溫條件下，發(fā)酵到第15天時腐胺和尸胺含量由0分別增加到1.71、6.04 mg/kg，而10 ℃條件下發(fā)酵4 d，腐胺和尸胺含量分別達(dá)到25.66、8.96 mg/kg，兩者差異極顯著(P<0.01)。冰溫發(fā)酵時，組胺、酪胺和精胺積累量也都隨著發(fā)酵的進(jìn)行顯著增加(P<0.05)，最終含量分別為22.16、31.65、10.39 mg/kg，β-苯乙胺積累量較少，僅為0.06 mg/kg；10 ℃發(fā)酵時，組胺、酪胺和精胺積累量同樣也隨著發(fā)酵進(jìn)行顯著增加(P<0.05)，最終含量分別為21.33、21.45、17.56、0.41 mg/kg。冰溫發(fā)酵6 d與10 ℃發(fā)酵2 d時的組胺含量無顯著性差異(P>0.05)。2種不同發(fā)酵溫度下，鱖魚中生物按總累積量差異極其顯著(P<0.01)，冰溫條件下的總胺含量為72.01 mg/kg，10 ℃條件下的總胺含量為95.36 mg/kg。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，限定人體攝入組胺和酪胺的含量不超過50 mg/kg，酪胺和苯乙胺含量不得超過100～800和30 mg/kg[9]，食品中生物胺的總量超過1 000 mg/kg，將誘發(fā)人體中毒[11]，該2組實驗組中生物胺含量均未超過該標(biāo)準(zhǔn)。

表4 鱖魚發(fā)酵過程中生物胺含量的變化 單位：mg/kg

pH可反映魚肉品質(zhì)變化導(dǎo)致的酸堿程度的變化和蛋白質(zhì)降解的變化[20]。由圖2可知，新鮮鱖魚的pH為6.90，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，冰溫條件下pH最終降為6.73，10 ℃條件下pH最終降為6.63，pH的降低有利于乳酸菌和酵母菌的生長，促進(jìn)發(fā)酵，雖然此時的pH不是其最適生長溫度，但是在此pH環(huán)境下酵母菌和乳酸菌仍能夠生長繁殖。

a-冰溫發(fā)酵；b-10 ℃發(fā)酵圖2 發(fā)酵過程中pH 變化Fig.2 pH changes during fermentation

由圖3可知，新鮮鱖魚中微生物含量很低，菌落總數(shù)為4.18 lgCFU/g，在不同發(fā)酵溫度下，整個過程中各類微生物含量均呈現(xiàn)上升趨勢，10 ℃發(fā)酵第4天的菌落總數(shù)最終達(dá)到7.46 lgCFU/g，而冰溫發(fā)酵第15天的菌落總數(shù)僅為6.12 lgCFU/g，可見低溫抑制了微生物的生長(P<0.05)。對發(fā)酵起決定性作用的乳酸菌和酵母菌含量在10 ℃第4天和冰溫第15天分別為5.71、5.63 lgCFU/g和5.29、5.03 lgCFU/g，說明雖然低溫抑制了微生物的生長，但仍有耐低溫的乳酸菌和酵母菌能在冰溫條件下生長繁殖。

a-冰溫發(fā)酵；b-10 ℃發(fā)酵圖3 冰溫發(fā)酵過程中微生物數(shù)量變化Fig.3 Changes in the number of microorganisms during fermentation

2.5 TVB-N的變化

TVB-N值可反映蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)，從而反映水產(chǎn)品品質(zhì)的變化[21]。由圖4可知，新鮮鱖魚中TVB-N含量為8.87 mg N/100g，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，2組魚肉中TVB-N的含量均顯著提高(P<0.05)，冰溫發(fā)酵魚肉在第15天時TVB-N含量達(dá)到20.15 mg N/100g，10 ℃發(fā)酵至第4天時其含量為29.32 mg N/100g，未超過魚類產(chǎn)品含量中TVB-N含量的上限(30 mg N/100g)。

a-冰溫發(fā)酵；b-10 ℃發(fā)酵圖4 發(fā)酵過程中TVB-N變化Fig.4 TVB-N changes during fermentation

3 討論

LEI等[22]和MADEJSK等[23]的研究表明溫度是影響發(fā)酵食品中生物胺的一個重要因素，同時，冰溫也是維持水產(chǎn)品良好滋味的溫度帶，在冰溫帶對鱖魚進(jìn)行發(fā)酵，不僅能夠明顯降低魚肉中生物胺的含量，還可以顯著提高魚肉的品質(zhì)和滋味。本實驗通過對游離氨基酸、呈味核苷酸的研究，得到冰溫發(fā)酵鱖魚中鮮味氨基酸含量是10 ℃發(fā)酵的2倍，因此，冰溫發(fā)酵鱖魚的滋味明顯優(yōu)于10 ℃發(fā)酵。新鮮鱖魚在發(fā)酵過程中，由于自身微生物和蛋白酶的作用，大分子蛋白被降解為小分子肽和游離氨基酸，根據(jù)上述討論，冰溫能夠減少游離氨基酸向生物胺的轉(zhuǎn)化從而增加了鮮味氨基酸含量。不僅如此，冰溫還會影響ATP的降解過程，ATP的降解主要是由于磷酸化酶、組織蛋白酶等酶類以及微生物作用，發(fā)酵過程中，魚體內(nèi)的ATP降解為IMP，IMP再降解為HxR和次黃嘌呤，實驗結(jié)果表明冰溫發(fā)酵第15天的IMP含量是10 ℃發(fā)酵第4天的2倍，與蔣晨毓等[24]在研究中得出冰溫能夠延長IMP的積蓄時間，減緩IMP的進(jìn)一步分解這一結(jié)論相一致。因此，冰溫發(fā)酵鱖魚能夠提高鮮味核苷酸含量以及EUC，賦予發(fā)酵魚肉更好的滋味。

水產(chǎn)品產(chǎn)生生物胺主要有3個方面的原因，一是產(chǎn)生具有氨基酸脫羧活性的微生物，二是足量的游離氨基酸，三是適合微生物的生長繁殖以及適合合成氨基酸脫羧酶的理化條件[25-26]。游離氨基酸不僅是發(fā)酵水產(chǎn)品生產(chǎn)生物胺的重要前體物質(zhì)，而且為水產(chǎn)品中微生物的生長繁殖提供了重要能源。新鮮水產(chǎn)品中的生物胺含量較低，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在微生物以及酶的作用下生物胺含量不斷增長。溫度是影響微生物和酶作用的一個重要因素。根據(jù)實驗結(jié)果，冰溫發(fā)酵第9天微生物含量顯著上升，而生物胺含量也是在第9天增加明顯，開始產(chǎn)生尸胺、腐胺和β-苯乙胺，10 ℃發(fā)酵在第3天開始呈現(xiàn)相同的規(guī)律。由此可知，一方面，冰溫能夠抑制微生物的生長，魚肉中氨基酸脫羧酶和蛋白質(zhì)降解酶含量下降，從而減少了生物胺含量，結(jié)合pH值的分析，沒達(dá)到其最適pH也可能是微生物生長緩慢的因素；另一方面，冰溫發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氨基酸未能經(jīng)脫羧作用轉(zhuǎn)化成生物胺，不僅降低了生物胺含量，同時也增加了鮮味氨基酸含量。這與WANG等[27]在探究大黃魚生物胺與游離氨基酸的關(guān)系時得出的結(jié)論一致。