田冰，武煊，鐘玉潔，楊吉霞，陳應(yīng)娟，陶曉奇,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶，401120) 3(川渝共建特色食品重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715)

食品在加工、運(yùn)輸、貯存等過(guò)程中有可能帶入有害物質(zhì)，如獸藥殘留、重金屬殘留、農(nóng)藥殘留、致病菌等[1]，對(duì)食品質(zhì)量安全造成威脅，因此有必要探索準(zhǔn)確、高效、靈敏、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法以保障消費(fèi)者的食品安全。傳統(tǒng)的食品安全檢測(cè)方法如氣相色譜法[2]、高效液相色譜法[3]等雖然準(zhǔn)確性高，但是步驟繁瑣、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、需在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，不能實(shí)現(xiàn)高效、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，許多基于納米材料的智能傳感器在檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[4]。

金納米顆粒(gold nanoparticles，AuNPs)是指粒徑范圍在1～100 nm的超細(xì)金微粒，也被稱(chēng)為金膠體(gold colloids)。由于具有獨(dú)特的局域表面等離子體共振特性和較高的摩爾消光系數(shù)，AuNPs表現(xiàn)出與尺寸相關(guān)的顏色變化。隨著AuNPs粒徑的增加，表面等離子共振譜帶從可見(jiàn)光區(qū)向近紅外區(qū)移動(dòng)，溶液顏色反映出從紅色到藍(lán)色的變化[5]。

除了具有良好的光學(xué)性質(zhì)，AuNPs還具有類(lèi)似天然酶的活性，如過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、氧化酶和超氧化物歧化酶等[6]。由于AuNPs具有類(lèi)似過(guò)氧化物酶的性質(zhì)，因此在H2O2存在的情況下，AuNPs可以催化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)[7]、ABTS[8]、鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)[9]、Amplex Red(AR)[10]等底物發(fā)生顯色或熒光反應(yīng)，從而利用底物顏色變化構(gòu)建傳感器。此前AuNPs比色傳感器大多基于調(diào)控距離的聚集比色而構(gòu)建，近年來(lái)基于AuNPs酶活性構(gòu)建的比色傳感器應(yīng)用越來(lái)越多，本文將重點(diǎn)討論基于AuNPs過(guò)氧化物酶活性構(gòu)建的比色傳感器的傳感原理及其在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 AuNPs的制備方法

AuNPs的經(jīng)典合成方法是由TURKEVICH于1951年提出，然后由FRENS于1973年發(fā)展的Turkevich-Frens法[11]。將還原劑(如檸檬酸鈉、硼氫化鈉、抗壞血酸等)加入氯金酸溶液中，Au3+被還原成Au0，這種方法可合成粒徑10～50 nm的球形AuNPs，過(guò)程簡(jiǎn)單，不需要高成本的專(zhuān)用設(shè)備。BRUST和SCHIFFRIN在1994年提出的Brust-Schiffrin法可以合成更小粒徑的AuNPs，在正十二烷基硫醇存在下，用硼氫化鈉在水-甲苯兩相中還原氯金酸，從而制得粒徑為1～8 nm內(nèi)的熱穩(wěn)定AuNPs[12]。除了上述化學(xué)合成法外，還有晶種法[13]和生物合成法[14]等。

2 基于AuNPs過(guò)氧化物酶活性比色傳感器 的檢測(cè)原理

基于AuNPs的比色傳感器主要有兩種類(lèi)型，一種依賴(lài)于AuNPs的表面等離子體共振特性，一種利用AuNPs能模擬天然酶發(fā)揮催化作用的性質(zhì)。前者通過(guò)對(duì)AuNPs進(jìn)行表面修飾，利用靶標(biāo)和修飾基團(tuán)之間的相互作用就可以調(diào)控AuNPs的分散狀態(tài)，呈現(xiàn)出不同的顏色，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)[15]。不同的是，AuNPs酶活性比色傳感器的顏色變化來(lái)自底物的顯色反應(yīng)，而不是AuNPs本身。與靶標(biāo)的相互作用使AuNPs的酶活性發(fā)生變化，從而使反應(yīng)底物呈現(xiàn)不同顏色，通過(guò)反應(yīng)底物的顏色變化來(lái)檢測(cè)靶標(biāo)。目前報(bào)道的AuNPs酶活性比色傳感器主要利用AuNPs的過(guò)氧化物酶性質(zhì)，可分為以下兩類(lèi)：靶標(biāo)吸附-AuNPs傳感器、靶標(biāo)-適配體-AuNPs傳感器。

2.1 靶標(biāo)吸附-AuNPs傳感器的檢測(cè)原理

AuNPs具有類(lèi)似過(guò)氧化物酶活性，能打開(kāi)H2O2的O—O化學(xué)鍵形成羥自由基，催化無(wú)色底物(如TMB)氧化生成顯色產(chǎn)物(如藍(lán)色的oxTMB)，產(chǎn)物的顏色深淺與AuNPs酶活性正相關(guān)[15]。靶標(biāo)吸附在AuNPs表面，改變AuNPs表面性質(zhì)，從而調(diào)節(jié)AuNPs的酶活性。如卡那霉素[7]、三聚氰胺[16]、亞砷酸鹽[17]、Pb2+[18]、Hg2+[19-22]增強(qiáng)AuNPs的過(guò)氧化物酶活性，而多巴胺[23]、樂(lè)果農(nóng)藥[9]則減弱AuNPs的過(guò)氧化物酶活性。通過(guò)肉眼觀察或儀器手段衡量顯色產(chǎn)物的顏色變化，即可對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。檢測(cè)原理如圖1所示。

圖1 靶標(biāo)吸附-AuNPs傳感器的檢測(cè)原理Fig.1 Detection principle of the target-AuNPs sensors

2.2 靶標(biāo)-適配體-AuNPs傳感器的檢測(cè)原理

適配體(aptamer)是一段單鏈DNA或RNA，可以與核酸、蛋白質(zhì)、金屬離子和小分子發(fā)生特異性結(jié)合[24]，具有親和力高、體積小、易于合成和修飾等優(yōu)點(diǎn)。ELLINGTON等[25]首次報(bào)道使用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，從隨機(jī)單鏈核酸序列庫(kù)中分離合適的結(jié)合序列，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到與靶標(biāo)高度特異性親和的適配體。單鏈DNA通過(guò)堿基的配位作用吸附到AuNPs表面[26]，影響AuNPs酶活性，從而構(gòu)建適配體-AuNPs比色傳感器。靶標(biāo)通過(guò)與適配體的結(jié)合，間接調(diào)控AuNPs的過(guò)氧化物酶活性，實(shí)現(xiàn)比色檢測(cè)。靶標(biāo)對(duì)AuNPs過(guò)氧化物酶活性的調(diào)控表現(xiàn)為增強(qiáng)或抑制，關(guān)于其機(jī)理，有以下兩種解釋。

一種解釋認(rèn)為，適配體屏蔽了AuNPs表面的活性位點(diǎn)，使AuNPs酶活性被抑制。加入靶標(biāo)后，由于適配體與靶標(biāo)的高親和力、特異性結(jié)合，導(dǎo)致適配體結(jié)構(gòu)變化并從AuNPs表面解吸附，AuNPs活性位點(diǎn)重新暴露，從而恢復(fù)酶活性(圖2-a)[27-31]。

另一種解釋認(rèn)為， DNA通過(guò)堿基吸附在AuNPs上，其帶負(fù)電荷的磷酸骨架暴露在AuNPs表面，使DNA-AuNPs復(fù)合物的負(fù)電荷密度增加，與帶負(fù)電荷的底物(如ABTS)相互作用減弱，表現(xiàn)為酶活性降低,與帶正電荷的底物(如TMB)作用力更強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的酶活性增強(qiáng)。當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí)，靶標(biāo)-適配體的結(jié)合使適配體從AuNPs上解吸附，AuNPs表面負(fù)電荷減少，相應(yīng)地導(dǎo)致AuNPs的酶活性增強(qiáng)(負(fù)電荷底物)(圖2-b)或減弱(正電荷底物)(圖2-c)[8, 32-35]。

a- AuNPs酶活性增強(qiáng);b-AuNPs酶活性增強(qiáng);c- AuNPs酶活性減弱圖2 靶標(biāo)-適配體-AuNPs傳感器的檢測(cè)原理Fig.2 Detection principle of the target-aptamer-AuNPs sensors

3 基于AuNPs過(guò)氧化物酶活性的比色傳感 器在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用

獸藥、農(nóng)藥的殘留，以及重金屬、致病菌和其他非法添加成分是導(dǎo)致食品安全問(wèn)題的主要來(lái)源，危害人類(lèi)健康?；贏uNPs過(guò)氧化物酶活性構(gòu)建的比色傳感器已被應(yīng)用于各類(lèi)食品樣品的安全檢測(cè)，如表1所示。

表1 基于AuNPs過(guò)氧化物酶活性比色傳感器的應(yīng)用Table 1 Application of colorimetric sensor based on AuNPs peroxidase activity

3.1 食品中獸藥殘留的檢測(cè)

可食用動(dòng)物加工成食品后，在養(yǎng)殖過(guò)程中使用的獸藥有可能會(huì)有殘留，如抗生素、抗菌劑等。SHARMA等[27]利用AuNPs類(lèi)過(guò)氧化物酶活性和Ky2適配體構(gòu)建“turn-off/turn-on”傳感器，實(shí)現(xiàn)了卡那霉素的高靈敏快速檢測(cè)，檢測(cè)限1.49 nmol/L，時(shí)間3～8 min，比傳統(tǒng)的鹽誘導(dǎo)AuNPs聚集方法靈敏15倍，速度快20倍。WANG等[7]發(fā)現(xiàn)卡那霉素通過(guò)—NH2吸附在檸檬酸鹽封端的AuNPs上，改變AuNPs表面性質(zhì)，從而增強(qiáng)AuNPs的過(guò)氧化物酶活性；基于此原理，開(kāi)發(fā)了基于AuNPs過(guò)氧化物酶活性變化直接檢測(cè)卡那霉素的方法，方法簡(jiǎn)便，不需要對(duì)AuNPs進(jìn)行任何修飾，在奶、肉中檢測(cè)限低至0.1 nmol/L。ZHAO等[8]以ABTS為顯色底物構(gòu)建AuNPs-適配體傳感器檢測(cè)牛奶中的鏈霉素，線(xiàn)性范圍0.1～0.5 μmol/L，檢測(cè)限86 nmol/L。類(lèi)似地，SONG等[36]發(fā)現(xiàn)帶負(fù)電的諾氟沙星通過(guò)靜電相互作用吸附在帶正電荷的1-Me-D-Trp@AuNCs(1-甲基-D-色氨酸修飾的納米金簇)表面，提高1-Me-D-Trp@AuNCs的酶活性，無(wú)需適配體即可直接檢測(cè)諾氟沙星，檢測(cè)限0.2 μmol/L。ZHANG等[33]發(fā)現(xiàn)四環(huán)素的特異性適配體增強(qiáng)AuNPs酶活性，而加入四環(huán)素時(shí)，AuNPs酶活性降低，以此實(shí)現(xiàn)原料奶中四環(huán)素的高靈敏度檢測(cè)，該方法檢測(cè)限為46 nmol/L。

3.2 食品中重金屬的檢測(cè)

環(huán)境中的重金屬元素可能通過(guò)食物鏈轉(zhuǎn)移至人體，危害人類(lèi)身體健康。LIAO等[18]利用Pb2+誘導(dǎo)AuNPs聚集，增強(qiáng)其過(guò)氧化物酶活性的原理，建立了一種簡(jiǎn)單可靠的比色方法，用于檢測(cè)水中的Pb2+含量。LONG等[19]發(fā)現(xiàn)Hg2+可被AuNPs表面的檸檬酸鈉還原為Hg0，Hg0分散在AuNPs表面，改變表面性質(zhì)，提高AuNPs的過(guò)氧化物酶活性，從而無(wú)標(biāo)記檢測(cè)Hg2+。HAN等[20]的研究證實(shí)了LONG的觀點(diǎn)，并且制成了AuNP比色試紙條，能同時(shí)執(zhí)行多個(gè)樣品檢測(cè)，簡(jiǎn)單便攜，可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。AN等[21]在LONG的比色傳感體系的基礎(chǔ)上，使用溫度計(jì)作為信號(hào)讀取器，當(dāng)加入Hg2+時(shí)，AuNP@β-CD(β-環(huán)糊精修飾的納米金)的催化活性顯著提高，藍(lán)色oxTMB的形成增強(qiáng)，從而導(dǎo)致溫度升高，可以在10 min內(nèi)快速檢測(cè)，檢測(cè)限0.06 μmol/L。JIANG等[22]用生物相容性更高的殼聚糖納米金(CS-AuNPs)檢測(cè)水中的Hg2+，檢測(cè)限為0.04 μmol/L。

3.3 食品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)

蔬菜、水果、谷物等農(nóng)作物表面易殘留種植過(guò)程中施用的農(nóng)藥。HU等[9]發(fā)現(xiàn)樂(lè)果農(nóng)藥的分子結(jié)構(gòu)中含有酰胺鍵，可能起著與巰基相似的作用，能螯合Au+來(lái)抑制AuNPs的酶活性，因此可用AuNPs檢測(cè)黃瓜、西紅柿、卷心菜等農(nóng)產(chǎn)品中的樂(lè)果農(nóng)藥，檢測(cè)限為4.7 μg/L。WEERATHUNGE等[29]和 YANG等[34]利用啶蟲(chóng)脒與適配體結(jié)合從而恢復(fù)AuNPs酶活性，分別以TMB和ABTS為顯色底物，開(kāi)發(fā)了檢測(cè)啶蟲(chóng)脒的適配體-AuNPs傳感器，各自的檢測(cè)限分別為120、1.02 μg/L。

3.4 食品中致病菌的檢測(cè)

食源性致病菌直接或間接污染食品及水源，是導(dǎo)致食品安全問(wèn)題的重要來(lái)源。DAS等[30]利用銅綠假單胞菌與其適配體的結(jié)合恢復(fù)AuNPs的酶活性構(gòu)建傳感器，可以在10 min內(nèi)完成快速檢測(cè)，檢測(cè)限為60 CFU/mL。CHEN等[37]也基于此原理建立了鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法，在雞蛋樣品中檢測(cè)限低至1 CFU/mL。YAO等[38]選擇金黃色葡萄球菌免疫球蛋白Y作為適配體，適配體修飾抑制了AuNPs催化活性，金黃色葡萄球菌的結(jié)合恢復(fù)AuNPs酶活性，催化TMB底物顯色。該方法對(duì)復(fù)雜食品基質(zhì)中金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)具有很強(qiáng)的抗干擾能力，在豬肉、牛奶中檢測(cè)限為10 CFU/mL，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要65 min。陳威風(fēng)等[39]發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌的適配體增強(qiáng)AuNPs酶活性，單增李斯特菌與適配體特異性結(jié)合使AuNPs酶活性降低，從而檢測(cè)豬肉中的單增李斯特菌，檢出限約為5 CFU/mL。

3.5 食品中其他非法成分的檢測(cè)

NI等[16]利用三聚氰胺使AuNPs過(guò)氧化物酶活性增強(qiáng)的原理簡(jiǎn)便快速地檢測(cè)原料奶和奶粉中的三聚氰胺，檢測(cè)限為0.2 nmol/L?；谙嗨频脑?，XUE等[17]建立了亞砷酸鹽的檢測(cè)方法，檢測(cè)限為0.01 mg/L。SUN等[31]報(bào)道了一種基于適配體的比色檢測(cè)法玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)，適配體抑制AuNPs酶活性，在ZEN存在的情況下，適配體與ZEN結(jié)合，不再抑制AuNPs酶活性，此方法可在15 min內(nèi)快速響應(yīng)，檢測(cè)限為10 ng/mL。而HU等[35]報(bào)道的相思子毒素(abrin)檢測(cè)原理則剛好相反，abrin的適配體活化AuNPs表面提高酶活性，abrin結(jié)合導(dǎo)致適配體從AuNPs表面脫附，導(dǎo)致酶活性降低。ZHAO等[40]用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)修飾AuNPs，適配體抑制CATB-AuNPs的酶活性，加入孔雀石綠后，酶活性恢復(fù)，此方法檢測(cè)限低至1.8 nmol/L。

4 存在的問(wèn)題與展望

4.1 存在的問(wèn)題

不難發(fā)現(xiàn)，目前基于酶活性的適配體-AuNPs比色傳感器的核心原理是靶標(biāo)結(jié)合適配體使其從AuNPs上解吸附，從而調(diào)控酶活性。這種解釋基于一個(gè)假設(shè)前提：靶標(biāo)與適配體結(jié)合的親和力遠(yuǎn)大于適配體與AuNPs的結(jié)合力，只考慮到靶標(biāo)與適配體的結(jié)合，而忽略了靶標(biāo)與AuNPs之間潛在的相互作用。最近的一些研究表明，靶標(biāo)僅能解吸下來(lái)極少的預(yù)先吸附的適配體(解吸率<5%)[41]，也就是說(shuō)幾乎不可能通過(guò)靶標(biāo)-適配體結(jié)合從AuNPs表面解吸適配體；同時(shí)，靶標(biāo)可以吸附在AuNPs上，并且抑制適配體的吸附[42-46]。因此AuNPs酶活性的調(diào)控可能不依賴(lài)于靶標(biāo)-適配體的結(jié)合，而是取決于靶標(biāo)與AuNPs的吸附。如前文所述，SHARMA等[27]用適配體-AuNPs檢測(cè)卡那霉素，認(rèn)為卡那霉素通過(guò)特異性結(jié)合使適配體解吸，從而增強(qiáng)AuNPs酶活性。但根據(jù)ZHOU等[47]的報(bào)道，卡那霉素很難使適配體從AuNPs表面解吸(卡那霉素濃度為10 μmol/L時(shí)，適配體幾乎沒(méi)有解吸，濃度高達(dá)0.1 mmol/L時(shí)只有12%適配體解吸，而濃度再升高并沒(méi)有引起更多的適配體解吸)；同時(shí)，WANG等[7]發(fā)現(xiàn)卡那霉素通過(guò)靜電吸引和氨基-羧基相互作用強(qiáng)吸附在檸檬酸鹽包被的AuNPs表面。因此AuNPs酶活性的增強(qiáng)很可能歸功于卡那霉素在AuNPs上的吸附，而不是適配體從AuNPs表面解吸[48]。

因此我們?cè)谟懻摪袠?biāo)-適配體-AuNPs比色傳感的原理時(shí)，務(wù)必要考慮AuNPs對(duì)靶標(biāo)的吸附情況。對(duì)于AuNPs弱吸附的靶標(biāo)，如K+，可以用靶標(biāo)-適配體結(jié)合使適配體從AuNPs解吸，從而調(diào)控AuNPs酶活性來(lái)解釋[46]。但對(duì)于強(qiáng)吸附的靶標(biāo)，如卡那霉素[27]、氯霉素[42]、亞砷酸鹽[44]、ATP[45]、多巴胺[46]等，這種原理解釋只有部分正確。為了更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)亟忉專(zhuān)梢砸胍欢芜m配體的非結(jié)合突變序列作為對(duì)照[42]，或者對(duì)AuNPs進(jìn)行表面修飾使其對(duì)靶標(biāo)的吸附力減小[49]。

4.2 展望

基于AuNPs過(guò)氧化物酶活性構(gòu)建的比色傳感器已經(jīng)在應(yīng)用方面取得了很多優(yōu)秀的成果，但仍然面臨一些亟待解決的問(wèn)題，如下：

(1)吸附在AuNPs上的靶標(biāo)分子如何調(diào)節(jié)AuNPs的酶活性，還有待系統(tǒng)地研究。

(2)提高AuNPs在中性條件下的酶活性。AuNPs的最佳催化活性一般發(fā)生在強(qiáng)酸性條件下(pH值在3～4左右)，中性條件下的過(guò)氧化物酶活性可以忽略不計(jì)[50]。這一缺點(diǎn)導(dǎo)致AuNPs無(wú)法應(yīng)用于某些需要中性pH條件的靶標(biāo)(如蛋白質(zhì))，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在強(qiáng)酸性環(huán)境中會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，可能導(dǎo)致檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度變差。

(3)基于AuNPs酶活性構(gòu)建的比色傳感器，絕大多數(shù)利用的是AuNPs過(guò)氧化物酶性質(zhì)，其他酶性質(zhì)的利用還有待開(kāi)發(fā)，期待未來(lái)創(chuàng)造更多的響應(yīng)信號(hào)類(lèi)型。