張靜，李海萍

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

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卡那霉素對(duì)蘿卜種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響

張靜1，李海萍2

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

[目的]為了篩選蘿卜種子卡那霉素最佳致死濃度。[方法]以2個(gè)蘿卜自交系為試材，研究了不同濃度卡那霉素對(duì)蘿卜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響。[結(jié)果]卡那霉素對(duì)不同蘿卜自交系種子的萌發(fā)影響不同，但對(duì)蘿卜幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育都有明顯的抑制作用，隨著卡那霉素濃度的升高，致死率升高、主根和下胚軸長(zhǎng)度變短。不同蘿卜品種對(duì)卡那霉素的敏感性不同，各自的致死濃度也不一樣。[結(jié)論]在經(jīng)卡那霉素溶液浸泡后播種時(shí)，07Lb36-9和07Lb39的卡那霉素致死濃度分別為150 mg·L-1和300 mg·L-1，這2個(gè)濃度可以作為蘿卜自交系07Lb36-9和07Lb39的轉(zhuǎn)基因種子的篩選濃度。

蘿卜； 卡那霉素； 敏感性

蘿卜(RaphnussativusL.)屬于十字花科蘿卜屬一年或兩年生草本植物[1]，是油菜的近緣物種[2]。蘿卜在世界范圍內(nèi)均有種植，且有著十分悠久的歷史，在人們?nèi)粘Ｉ钪腥找嬷匾?，逐漸成為科學(xué)研究的重要對(duì)象。隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，許多物種基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成。2014年日本學(xué)者公布了蘿卜全基因組序列[3]，為深入分析蘿卜基因功能，進(jìn)而改良蘿卜種質(zhì)資源提供了極大便利。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于蘿卜的遺傳轉(zhuǎn)化研究起步較晚。Kim等[4]首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組織培養(yǎng)方法對(duì)蘿卜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究并且獲得了成功。李海萍等[5]初步建立了基于組織培養(yǎng)的蘿卜遺傳轉(zhuǎn)化體系。但是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組織培養(yǎng)遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程比較復(fù)雜，影響其轉(zhuǎn)化效率的因素較多。因此，不依賴于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)以及熱點(diǎn)。植株原位真空滲入法避開(kāi)了組織培養(yǎng)的過(guò)程，具有很多優(yōu)點(diǎn)，目前已在蘿卜[2]、油菜[6, 7]、甘藍(lán)型油菜[8]、擬南芥[9]、芥菜[10]、不結(jié)球白菜[11]和大白菜[12]上進(jìn)行了嘗試，并獲得了成功。

植物原位真空滲入法轉(zhuǎn)化的假陽(yáng)性率也很高，收獲的種子不可能全部進(jìn)行分子檢測(cè)，所以對(duì)種子抗性篩選尤為重要。利用標(biāo)記基因?qū)Υ罅哭D(zhuǎn)基因后代進(jìn)行鑒定和篩選是一種經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的方法[13]。本研究以2個(gè)蘿卜自交系為試材，研究不同濃度卡那霉素對(duì)其發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，確定卡那霉素最佳致死濃度，以期為后續(xù)真空滲入法轉(zhuǎn)化蘿卜得到的種子進(jìn)行抗生素篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2份蘿卜(RaphanussativusL.)材料，分別是自交系07Lb36-9和07Lb39，由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院大白菜研究室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

分別制備含0、50、100、150、200、250和300 mg·L-1共7個(gè)梯度的卡那霉素MS選擇培養(yǎng)基(含蔗糖20 g·L-1、瓊脂7.5 g·L-1)。挑選顆粒飽滿的蘿卜種子，在超凈工作臺(tái)上首先用70%乙醇消毒1 min，其次用0.8%次氯酸鈉溶液消毒15 min，無(wú)菌水沖洗4～5次。然后將消毒的種子進(jìn)行以下2種處理：(1)直接播種于含有相應(yīng)濃度卡那霉素的MS選擇培養(yǎng)基上，對(duì)照為種子消毒后直接播種于不含卡那霉素的MS選擇培養(yǎng)基上，每個(gè)處理100粒，重復(fù)3次；(2)將消毒好的種子在含有相應(yīng)濃度卡那霉素的水溶液中4 ℃浸泡36 h，然后播種于含相應(yīng)濃度卡那霉素的MS選擇培養(yǎng)基上，對(duì)照為種子消毒后在無(wú)菌水中4 ℃浸泡36 h，然后播種于不含卡那霉素的MS選擇培養(yǎng)基上，每個(gè)處理100粒，重復(fù)3次。置于室溫25 ℃、光照時(shí)間為16 h·d-1、光照強(qiáng)度為2000 lux條件下培養(yǎng)。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)測(cè)定結(jié)果用SAS軟件和Excel軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素對(duì)蘿卜種子發(fā)芽率的影響

由表1可見(jiàn)，直接播種時(shí)，低濃度的卡那霉素對(duì)07Lb36-9蘿卜種子的萌發(fā)有明顯促進(jìn)作用，卡那霉素濃度在50 mg·L-1時(shí)，07Lb36-9的發(fā)芽率達(dá)到了87.26%，其它濃度范圍內(nèi)對(duì)07Lb36-9蘿卜種子的萌發(fā)影響不顯著，各處理的發(fā)芽率均在65%以上；卡那霉素在0～150 mg·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)07Lb39蘿卜種子的萌發(fā)影響不顯著，各處理的發(fā)芽率均在80%以上，卡那霉素在200～300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)07Lb39蘿卜種子的萌發(fā)有顯著的抑制作用，且隨著卡那霉素濃度的升高，發(fā)芽率逐漸降低。

經(jīng)卡那霉素溶液浸泡后播種時(shí)，卡那霉素在50～300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)07Lb36-9蘿卜種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用，各處理的發(fā)芽率均在75%以上，且150～300 mg·L-1濃度范圍的卡那霉素對(duì)07Lb36-9蘿卜種子的萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用，隨著卡那霉素濃度的升高，發(fā)芽率逐漸升高；50～100 mg·L-1濃度范圍的卡那霉素對(duì)07Lb39蘿卜種子的萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用，而300 mg·L-1的卡那霉素對(duì)07Lb39蘿卜種子的萌發(fā)有顯著的抑制作用，其發(fā)芽率僅為69.38%，卡那霉素在150～250 mg·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)07Lb39蘿卜種子的萌發(fā)影響不顯著。

2.2 卡那霉素對(duì)蘿卜幼苗下胚軸和主根生長(zhǎng)的影響

2種播種方式下，卡那霉素在50～300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)2種蘿卜材料的主根生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，且隨著卡那霉素濃度的升高，主根長(zhǎng)度逐漸降低(圖1A)。

直接播種時(shí)，卡那霉素在50～300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)2個(gè)蘿卜材料的下胚軸生長(zhǎng)有抑制作用?？敲顾貪舛葹?50～300 mg·L-1時(shí)對(duì)07Lb36-9的下胚軸生長(zhǎng)有顯著抑制作用，而卡那霉素濃度在100～300 mg·L-1時(shí)對(duì)07Lb39的下胚軸生長(zhǎng)有顯著的抑制作用(圖1B)。

經(jīng)卡那霉素溶液浸泡后播種時(shí)，卡那霉素在50～300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)2個(gè)蘿卜材料的下胚軸生長(zhǎng)有抑制作用?？敲顾貪舛葹?00～300 mg·L-1濃度時(shí)對(duì)07Lb36-9的下胚軸生長(zhǎng)有顯著抑制作用，卡那霉素濃度在50～300 mg·L-1時(shí)對(duì)07Lb39的下胚軸生長(zhǎng)有顯著的抑制作用(圖1B)。

表1 卡那霉素對(duì)蘿卜種子發(fā)芽率的影響

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Note:Different lowercase letters in a column mean significant difference (P<0.05)

圖1 卡那霉素對(duì)蘿卜子葉苗主根 (A)和下胚軸(B)生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of kanamycin on the growth of root (A) and hypocotyls (B) of radish seedling 注：Z：直接播種于培養(yǎng)基；P：經(jīng)卡那霉素溶液浸泡后播種于培養(yǎng)基。下同Note：Z: Seeds were sown in the medium directly without soaking in the kanamycin solution; P: Seeds were sown in the medium after soaking in the kanamycin solution. The same below

2.3 卡那霉素對(duì)蘿卜幼苗子葉顏色的影響

不同蘿卜品種的卡那霉素致死濃度不同。直接播種時(shí)，當(dāng)卡那霉素濃度達(dá)到300 mg·L-1時(shí)對(duì)2個(gè)蘿卜品種的致死率雖然達(dá)到了90%以上，但是未達(dá)到100%(表1，圖2)。浸泡后播種時(shí)，07Lb36-9在卡那霉素篩選濃度為150 mg·L-1以上時(shí)幼苗子葉全部黃化，卡那霉素濃度在50 mg·L-1時(shí)的蘿卜幼苗生長(zhǎng)狀況基本正常，部分子葉出現(xiàn)黃化(圖2)；因此，可以確定07Lb36-9在浸泡后播種的最低卡那霉素致死濃度為150 mg·L-1。而07Lb39對(duì)卡那霉素有較強(qiáng)的耐受性，卡那霉素濃度為300 mg·L-1時(shí)幼苗子葉全部變黃(圖2)。

圖2 不同蘿卜材料對(duì)卡那霉素的敏感性分析Fig.2 Analysis of the resistance to kanamycin of different radish inbred-line

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，科研工作者對(duì)蘿卜的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究，方法有組織培養(yǎng)法[4,5]和蘸花法[2,14]，說(shuō)明應(yīng)用真空滲入法進(jìn)行蘿卜遺傳轉(zhuǎn)化是可以實(shí)現(xiàn)的。

卡那霉素對(duì)不同蘿卜自交系種子的萌發(fā)影響

不同。直接播種時(shí)，卡那霉素在50～150 mg·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)07Lb36-9和07Lb39蘿卜種子的萌發(fā)影響不顯著，低濃度的卡那霉素對(duì)07Lb36-9蘿卜種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用，卡那霉素在200～300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)對(duì)07Lb39蘿卜種子的萌發(fā)有顯著的抑制作用；浸泡后接種時(shí)，150～300 mg·L-1濃度范圍的卡那霉素對(duì)07Lb36-9蘿卜種子的萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用，各處理的發(fā)芽率均在80%以上，50～100 mg·L-1濃度范圍的卡那霉素對(duì)07Lb39蘿卜種子的萌發(fā)促進(jìn)作用顯著，而300 mg·L-1的卡那霉素對(duì)07Lb39蘿卜種子的萌發(fā)有顯著的抑制作用。這與油菜上[7]的研究結(jié)果有所差異。另外，2個(gè)蘿卜自交系均表現(xiàn)出隨著卡那霉素濃度的提高，致死率升高、主根和下胚軸長(zhǎng)度變短的趨勢(shì)。這與油菜[7]、大白菜、小白菜和菜心的研究結(jié)果[13]一致。

本試驗(yàn)研究了不同濃度卡那霉素對(duì)蘿卜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，初步確立了2個(gè)蘿卜自交系的卡那霉素致死濃度。不同蘿卜品種對(duì)卡那霉素的敏感性不同，各自的致死濃度也不一樣。在經(jīng)卡那霉素溶液浸泡后播種的情況下，07Lb36-9和07Lb39的卡那霉素致死濃度分別為150和300 mg·L-1，這個(gè)濃度可以作為蘿卜轉(zhuǎn)基因種子的篩選濃度。

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(編輯：馬榮博)

Effect of Kanamycin on the seed germination and seedling growth of radish (RaphnussativusL.)

Zhang Jing1, Li Haiping2

(1.CollegeofHorticulture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801，China; 2.CollegeofHorticulture,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100，China)

[Objective]The best lethal concentration of kanamycin in radish seeds was screened.[Methods]The two radish inbred lines including 07Lb36-9 and07Lb39 were used as materials, the effect of different concentration of kanamycin on the seed germination and seedling growth of radish were studied.[Result]The result showed that the effect of kanamycin on the seed germination of different radish inbred lines were different. But the seedling growth was inhibited. The lethal rate became higher and the lengths of root and hypocotyl became shorter with the increase of the concentration of kanamycin. There was different kanamycin sensitivity of the two radish inbred lines. Therefore, the lethal concentration of kanamycin differed between the two radish inbred lines.[Conclusion]When the seeds were sowed on MS select medium after soaking by kanamycin solution, the lethal concentrations of 07Lb36-9 and 07Lb39 were 150 and 300 mg·L-1, respectively. These concentrations can be used as the screening concentration of the radish transgenic seeds.

Radish, Kanamycin, Sensitivity

2016-12-30

2017-06-13

張靜(1982-)，女(漢)，寧夏中衛(wèi)人，講師，博士，研究方向：蔬菜育種與生物技術(shù)

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(2014019)

S631

A

1671-8151(2017)09-0640-04