張 慧，黃蘇南，杜建武，王 韋，楊鉞戈，羅 瓊，曾千春*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南辣木研究所，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

【研究意義】多油辣木(Moringaoleifera)為辣木科Moringaceae，辣木屬M(fèi)oringa，多年生喬木。原產(chǎn)于印度北部喜馬拉雅山南麓，是一種熱帶、亞熱帶多功能植物[1-2]。多油辣木營養(yǎng)豐富，在印度有近千年食用史[3]。近年從多油辣木中選育出來的新品種PKM-1，由于干熱生態(tài)區(qū)種植時(shí)蟲害較為嚴(yán)重，其推廣及生產(chǎn)應(yīng)用受到限制。【前人研究進(jìn)展】隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已廣泛應(yīng)用于提高作物抗蟲性[4]。在植物轉(zhuǎn)基因的初步檢測(cè)中，篩選劑主要分為2大類：抗生素類和氨基酸類，在抗生素類中，卡那霉素是目前植物遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最廣泛篩選劑之一[5]。為了提高篩選效率，遺傳轉(zhuǎn)化中，確定合適的抗生素篩選濃度是其重要環(huán)節(jié)?？敲顾厥且环N蛋白質(zhì)生物合成抑制劑，通過干擾植物細(xì)胞中葉綠體及線粒體的蛋白質(zhì)合成，引起植物綠色器官的黃化，最終導(dǎo)致植物細(xì)胞的死亡[6]。因此，卡那霉素以其選擇效率高、副作用小及成本較低等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，已報(bào)道利用卡那霉素進(jìn)行篩選的植物超過50個(gè)屬，其中包含棉花[7]、桑樹[8]、番木瓜[9]、橡膠[10]等雙子葉植物，以及玉米[11-12]等極少數(shù)單子葉植物。雖然有學(xué)者開始對(duì)多油辣木PKM-1組織培養(yǎng)進(jìn)行探索[13-14]，但辣木遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)研究迄今未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析多油辣木無菌苗上胚軸、嫩葉以及由上胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織在增殖階段及其愈傷組織分化階段，對(duì)5種卡那霉素濃度的耐受性，確定nptII為篩選標(biāo)記遺傳轉(zhuǎn)化多油辣木PKM-1時(shí)，愈傷組織階段和分化植株階段合適的卡那霉素篩選濃度，為辣木遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)卡那霉素篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

多油辣木PKM-1種籽由云南省元江縣依江風(fēng)辣木產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司提供。主要器材：超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2D，上海希而科有限公司制造)，高壓滅菌鍋(MLS-3780，日本三洋公司制造)，光照培養(yǎng)箱(LRH-70，上海一恒科學(xué)儀器有限公司制造)，電子分析天平等(LRH-70，上海一恒科學(xué)儀器有限公司制造)。主要試劑：卡那霉素、1/2 MS培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂、6-BA、NAA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2 MS，不添加激素；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS，添加6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1；分化培養(yǎng)基為MS，添加6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1。所有培養(yǎng)基附加蔗糖3 %，瓊脂0.6 %，pH值調(diào)節(jié)至5.5～6.0，0.1～0.15 kP，121 ℃滅菌20 min。所有激素在超凈工作臺(tái)內(nèi)過濾滅菌，再添加于滅菌后的培養(yǎng)基中，充分搖勻分裝于組培瓶中。

1.2.2 辣木無菌苗的獲得 選取籽粒飽滿的辣木籽，于超凈臺(tái)中剝?nèi)シN殼，用75 %酒精消毒10 s，倒去酒精，再用20 %次氯酸鈉震蕩消毒5 min，無菌水沖洗3～5次，種仁置于無菌濾紙上吸去水分，接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中，每瓶4粒。(25±2)℃，光照12 h/d，弱光照培養(yǎng)10 d左右即可得到株高3～5 cm的無菌苗。

1.2.3 卡那霉素耐受性試驗(yàn) 設(shè)上胚軸和嫩葉誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)卡那霉素濃度梯度：0、30、50、70、90、110 mg·L-1，愈傷組織分化植株時(shí)卡那霉素濃度梯度：0、10、20、30、40、50 mg·L-1，在超凈工作臺(tái)中，滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右時(shí)加入卡那霉素，充分搖勻，分裝于培養(yǎng)皿中。取生長(zhǎng)良好的PKM-1無菌苗上胚軸與嫩葉，分別接種于前述卡那霉素濃度梯度的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，(25±2)℃，遮光培養(yǎng)，每20 d繼代1次，30 d后統(tǒng)計(jì)出愈率和死亡率。取上胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織，分別接種于不同濃度卡那霉素的分化培養(yǎng)基中，(25±2)℃，每天光照12 h，弱光照培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)死亡率。試驗(yàn)重復(fù)3次。外植體膨大至接種時(shí)2倍視為產(chǎn)生愈傷組織，未膨大和褐化定為死亡?！?”愈傷組織直徑小于等于0.5 cm；“+”愈傷組織直徑為0.5～1.0 cm；“++”愈傷組織直徑為1.0～1.5 cm；“+++”愈傷組織直徑大于等于1.5 cm，同時(shí)按下式統(tǒng)計(jì)出愈率、死亡率。

出愈率(%)=出愈外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100

死亡率(%)=外植體死亡數(shù)/接種外植體總數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和顯著性檢驗(yàn)等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素對(duì)PKM-1上胚軸誘導(dǎo)愈傷組織的影響

由圖1和表1可知，與對(duì)照相比，添加卡那霉素的培養(yǎng)基對(duì)上胚軸誘導(dǎo)愈傷組織均具有一定的抑制作用。上胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織誘導(dǎo)率均低于對(duì)照，且隨著卡那霉素濃度的提高，出愈率逐漸降低，死亡率迅速上升。對(duì)照培養(yǎng)10 d左右即可誘導(dǎo)出淡綠、較緊實(shí)的愈傷組織(圖2-A)。卡那霉素30 mg·L-1時(shí)，出愈率80.00 %，極顯著低于對(duì)照94.82 %；卡那霉素50 mg·L-1時(shí)，上胚軸細(xì)胞團(tuán)膨大變緩，出愈率下降為49.63 %，與其他處理呈極顯著差異；卡那霉素70 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞團(tuán)膨大明顯受到抑制，外植體呈黃褐色，出愈率為20.74 %，與其他組別間呈極顯著差異；卡那霉素90和110 mg·L-1時(shí)，上胚軸不膨大，未誘導(dǎo)出愈傷組織，且逐漸死亡?？梢姡琍KM-1上胚軸誘導(dǎo)愈傷組織階段的卡那霉素耐受濃度為50～70 mg·L-1。

表1 不同卡那霉素濃度對(duì)PKM-1愈傷組織誘導(dǎo)和分化植株的影響

2.2 卡那霉素對(duì)PKM-1嫩葉誘導(dǎo)愈傷組織的影響

與對(duì)照相比，添加卡那霉素的培養(yǎng)基對(duì)嫩葉誘導(dǎo)愈傷組織均具有一定的抑制作用(圖3)。由表1可知，嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)率均低于對(duì)照，且隨著卡那霉素濃度的提高，出愈率逐漸降低，死亡率迅速上升。對(duì)照培養(yǎng)30 d左右，嫩葉卷曲膨大，葉表面或葉緣處形成淡綠色愈傷組織，且愈傷組織緊實(shí)，有小顆粒狀突起(圖2-B)，出愈率為93.33 %?？敲顾?0 mg·L-1時(shí)，嫩葉膨大變緩，出愈率為70.37 %，極顯著低于對(duì)照；50 mg·L-1卡那霉素時(shí)，嫩葉膨大受到嚴(yán)重抑制，出愈率28.89 %，與其他處理呈極顯著差異；卡那霉素70 mg·L-1時(shí)，嫩葉無卷曲膨大，且逐漸褪綠變白，出愈率為6.67 %，極顯著低于對(duì)照、30 mg·L-1處理和50 mg·L-1處理；卡那霉素90和110 mg·L-1時(shí)，嫩葉褪綠變白的比例也逐步提高，無愈傷組織形成。因此，PKM-1嫩葉誘導(dǎo)愈傷組織階段的卡那霉素耐受濃度為30～50 mg·L-1。

2.3 卡那霉素對(duì)PKM-1愈傷組織分化植株的影響

與對(duì)照相比，添加卡那霉素的培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織分化植株均具有一定的抑制作用(圖4)。由表1可知，愈傷組織分化植株增殖均低于對(duì)照，且隨著卡那霉素濃度的提高，愈傷組織增殖變差，死亡率上升。培養(yǎng)30 d，對(duì)照愈傷組織緊實(shí)，顏色深綠，表面有小顆粒狀突起，且增殖良好(圖2-C)，死亡率為19.26 %；卡那霉素10 mg·L-1時(shí)，愈傷組織增殖開始受到抑制，死亡率為30.56 %，極顯著高于對(duì)照；20 mg·L-1卡那霉素時(shí)，愈傷組織增殖受到較嚴(yán)重影響，死亡率上升為40.74 %；卡那霉素30 mg·L-1時(shí)，愈傷組織基本不增殖，死亡率上升為95.56 %，與對(duì)照、10和20 mg·L-1組別呈極顯著差異；卡那霉素40和50 mg·L-1時(shí)，愈傷組織完全死亡。因此，PKM-1愈傷組織分化植株時(shí)卡那霉素耐受性是20～30 mg·L-1。

3 討 論

植物基因工程中，愈傷組織誘導(dǎo)和分化植株階段的卡那霉素耐受性存在較大差異[15-17]。楸樹組培苗生根培養(yǎng)時(shí)卡那霉素耐受濃度為100～150 mg·L-1，濃度低于100 mg·L-1時(shí)部分莖段干枯，少部分為綠，濃度為150 mg·L-1以上時(shí)，極少上部為綠，且基部干枯[15]；無菌苗嫩葉卡那霉素篩選濃度為40 mg·L-1，低于30 mg·L-1時(shí)，嫩葉會(huì)產(chǎn)生愈傷組織，提高濃度至40 mg·L-1時(shí)，嫩葉大量褐化，無愈傷組織形成[16]；在山葡萄葉柄愈傷組織分化時(shí)，20 mg·L-1的卡那霉素濃度已開始抑制愈傷組織分化植株，提高濃度至30 mg·L-1時(shí)，未分化的愈傷組織幾乎不能生長(zhǎng)，故將篩選濃度定為20 mg·L-1[17]。通過試驗(yàn)，辣木PKM-1上胚軸誘導(dǎo)愈傷組織的卡那霉素耐受濃度為50～70 mg·L-1，過低則篩選效果不明顯，過高則會(huì)完全抑制愈傷組織的誘導(dǎo)；嫩葉誘導(dǎo)愈傷組織的卡那霉素耐受濃度為30～50 mg·L-1，嫩葉膨大受抑制，但仍可誘導(dǎo)出部分愈傷組織；愈傷組織分化植株的卡那霉素耐受濃度為20～30 mg·L-1，此時(shí)愈傷組織增殖變緩，但不會(huì)完全被抑制。

試驗(yàn)過程中注意到，添加卡那霉素的培養(yǎng)基中，隨著濃度的增加，上胚軸細(xì)胞團(tuán)膨大逐漸變緩，出愈率降低，部分上胚軸失水，逐漸褐化直至死亡，歐陽樂軍等[18]在抗生素對(duì)尾巨桉誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)外植體失水褐化情況。嫩葉誘導(dǎo)愈傷組織過程中，隨著卡那霉素濃度提高，嫩葉膨大受抑制，出愈率下降，褪綠變白的比例也逐漸升高。耿天龍[19]等也觀察到金發(fā)草的愈傷組織對(duì)卡那霉素敏感性很強(qiáng)，當(dāng)卡那霉素濃度為10 mg·L-1時(shí)，金發(fā)草愈傷組織的生長(zhǎng)和分化受到明顯抑制，并出現(xiàn)大量白化苗。

4 結(jié) 論

多油辣木PKM-1愈傷組織分化階段較之愈傷組織增殖階段對(duì)卡那霉素更敏感。多油辣木PKM-1上胚軸的卡那霉素篩選濃度宜為70 mg·L-1，葉片誘導(dǎo)愈傷階段為50 mg·L-1，愈傷組織分化階段為30 mg·L-1。這些結(jié)果為應(yīng)用nptII作為篩選標(biāo)記基因，開展多油辣木抗蟲轉(zhuǎn)基因研究，采用卡那霉素篩選提供了基礎(chǔ)和參考。