班雯婷，胡彪，康佩姿，劉娟

(廣東省科學院生物工程研究所，廣州 510310)

隨著人們對健康的重視，國內外對研發(fā)安全性高、無熱量、成本低、適于糖尿病與肥胖癥患者食用的甜味劑如低聚果糖的需求迫在眉睫。低聚果糖又稱蔗果低聚糖[1-4]，是由1～3個果糖基通過糖苷鍵與蔗糖分子相連構成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。低聚果糖具有優(yōu)越的生理功能：調節(jié)腸道菌群， 降低血脂，增強免疫力，低熱量，抗齲齒，潤腸通便，促進礦物質的吸收。

低聚果糖的來源主要有兩種：一種來自植物，一種來自微生物酶法合成。微生物酶法合成是指以微生物發(fā)酵產果糖基轉移酶來轉化蔗糖生產低聚果糖的方法。果糖基轉移酶主要來源于酵母[5]和霉菌[6-7]。微生物發(fā)酵法不受季節(jié)性限制且成本低、效率高，是目前工業(yè)生產低聚果糖的主要方式。

法夫酵母是一種高附加值菌種，能發(fā)酵生產葡萄糖、胡蘿卜素、蝦青素等，為進一步的聯產實驗提供了支持，此外有報道證明[8]，法夫酵母在蔗糖培養(yǎng)基的生長過程中會發(fā)生果糖基轉移作用而生成一種新型三糖，這種新型蔗果三糖被命名為新科斯糖(neokestose)，研究表明[9]，新科斯糖增殖雙歧桿菌的能力比一般商業(yè)用低聚果糖更優(yōu)越。

目前，法夫酵母生產新科斯糖的研究在國外較少涉及，國內主要是江南大學進行研究[10]，法夫酵母生物量最高達到11.46 g/L，發(fā)酵生產新科斯糖最高產量為 250.37 g/L，蔗糖轉化率達到85%。

催化合成新科斯糖的酶是6G-果糖苷酶，研究表明[11]，底物濃度、底物pH、接種量、酶處理溫度和時間等單因素對蔗糖的轉化和生成新科斯糖均有影響，溫度對6G-果糖苷酶產新科斯糖的現象與胞外半乳糖酶的類似[12]；過高的接種量使黏度增加，不利于酵母呼吸，抑制酵母生長[13-16]；6G-果糖苷酶既有果糖基轉移作用又有水解作用，蔗糖濃度增加，水分活度降低，水解作用減弱，果糖基轉移作用增強，新科斯糖產量升高，但蔗糖增加，新科斯糖產率下降[17]；磷酸鹽和檸檬酸鹽對法夫酵母的生長有促進作用。

目前新科斯糖的生產都采用微生物法，微生物法又可以分為酶法和全細胞法。由于游離全細胞可以避免固定化導致的酶活損失，且與固定化細胞相比，在產糖過程中糖的轉化不受質量轉移限制，因此顯示了較好的工業(yè)化生產潛力。

金屬離子參與多種生化反應[18-19]，可使底物結合到酶的活性部位，也可間接使酶的活性部位保持在易結合底物的構象。金屬離子直接影響酶的活性，進而影響發(fā)酵生物量，最終影響目標產物的積累量。

真菌誘導子(fungal elicitor)是一類能誘導植物和微生物產生次級代謝產物的活性物質，它一經識別，將通過信號轉導途徑，引起相關基因表達發(fā)生變化，從而調節(jié)次級代謝產物合成途徑中相關酶的活性，誘導特定次級代謝產物的積累。Wang等[20]研究表明真菌誘導子對法夫酵母生長和類胡蘿卜素合成有一定影響。本文以此為依據，考察不同生物和化學誘導子對法夫酵母生長和新科斯糖合成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種

法夫酵母：購于廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

法夫酵母種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨0.5%，pH 7。

法夫酵母發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，硫酸銨0.7%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.2%，氯化鈣0.03%，酵母粉0.2%，YNB 0.1%，pH 7。

生物誘導子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，氯化銨1%，磷酸二氫鉀0.4%，磷酸二氫鈉0.1%，硫酸鎂0.2%，pH 5。

1.3 真菌誘導子的制備

靈芝、平菇、秀珍菇、茶樹菇培養(yǎng)7 d后，分別收集20 g濕菌體，用蒸餾水、0.1 mol/L和0.5 mol/L PBS緩沖液(pH 7.2)分別洗滌3次，超聲破碎細胞，離心(4000 r/min，5 min)收集沉淀，用0.5 mol/L PBS緩沖液(pH 7.2)洗滌沉淀3次，重懸于蒸餾水中，121 ℃，20 min高壓蒸汽滅菌后，于-20 ℃保存。

1.4 化學誘導子的制備

金屬離子、硝酸鈰、氯化鎘、茉莉酸甲酯配成一定濃度備用。

1.5 細胞的制備

將法夫酵母接種于裝有25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于25 ℃，200 r/min培養(yǎng)48 h作為種子液。然后以10%的接種量接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，恒定pH 7.0，30 ℃下發(fā)酵 72 h，將菌體細胞用無菌水洗滌2次，3000 g，10 min離心收集濕細胞。

1.6 新科斯糖的制備

將濕細胞加入1 L蔗糖溶液中，置于搖床中25 ℃，細胞濃度100 g/L，蔗糖濃度400 g/L，150 r/min振蕩反應 6 h。反應液于10000 g離心10 min，收集上清液，測定新科斯糖的產量。

1.7 法夫酵母生物量的測定

取5 mL菌液離心(4000 r/min，5 min)后用蒸餾水洗滌3次，在60 ℃烘箱中烘干至恒重后稱重。

1.8 新科斯糖含量的測定

采用HPLC分析上清液，條件為色譜柱：安捷倫5NH2-MS(4.6 mm×250 mm)；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈∶水為75∶25；流速：1 mL/min；檢測器：示差折光檢測器；進樣體積：10 μL。

2 結果與分析

在法夫酵母生長和新科斯糖積累階段分別在培養(yǎng)基中添加不同真菌、化學誘導子，研究它們對法夫酵母生長和新科斯糖合成的影響。

2.1 生物誘導子對發(fā)酵生產新科斯糖的影響

2.1.1 靈芝添加量對發(fā)酵生產新科斯糖的影響

由圖1可知，添加靈芝作為真菌誘導子時，對法夫酵母生物量和新科斯糖積累量有一定的影響，當靈芝添加量為10 mg/L時，生物量達到最大值13.90 g/L，提高了12.50%；當靈芝添加量大于或小于10 mg/L時，對酵母細胞生長的促進作用并不明顯；當靈芝添加量小于10 mg/L時，新科斯糖積累量逐漸升高；當靈芝添加量為10 mg/L時，新科斯糖積累量達到219.23 g/L；相比對照組提高了11.85%；當靈芝添加量大于10 mg/L時，新科斯糖積累量逐漸降低，可見誘導體系中靈芝作為真菌誘導子存在最適質量濃度。

圖1 靈芝對生物量和新科斯糖積累量的影響Fig.1 The effect of Ganoderma lucidum on the biomass and neokestose accumulation

2.1.2 平菇添加量對發(fā)酵生產新科斯糖的影響

圖2 平菇對生物量和新科斯糖積累量的影響

由圖2可知，添加平菇作為真菌誘導子時，隨著平菇添加量的增加，法夫酵母的生物量逐漸升高，當平菇添加量為20 mg/L時，生物量達到最大值13.48 g/L，相比對照組提高了12.11%，然后生物量略有降低，但變化不大；隨著平菇添加量的增加，新科斯糖的積累量逐漸升高，當平菇添加量為30 mg/L時，新科斯糖的積累量達到最大值224.56 g/L，相比對照組提高了15.08%，然后隨著濃度的繼續(xù)增加，新科斯糖的積累量降低，可見過高的質量濃度反而影響了新科斯糖的合成。

2.1.3 秀珍菇添加量對發(fā)酵生產新科斯糖的影響

圖3 秀珍菇對生物量和新科斯糖積累量的影響

由圖3可知，添加秀珍菇作為真菌誘導子時，隨著秀珍菇添加量的增加，法夫酵母的生物量逐漸升高，當秀珍菇添加量為5 mg/L時，生物量達到最大值12.03 g/L，相比對照組提高了7.81%，雖然生物量有所增加，但是增加并不明顯，可見秀珍菇作為真菌誘導子對細胞生長的促進作用有限；但隨著秀珍菇添加量的增加，新科斯糖的積累量逐漸升高，當秀珍菇添加量為10 mg/L時，新科斯糖積累量達到最大值232.70 g/L，相比對照組提高了19.03 %，然后隨著濃度的繼續(xù)增加，新科斯糖的積累量降低。

2.1.4 茶樹菇添加量對發(fā)酵生產新科斯糖的影響

圖4 茶樹菇對生物量和新科斯糖積累量的影響

由圖4可知，添加茶樹菇作為真菌誘導子時，隨著茶樹菇添加量的增加，法夫酵母的生物量逐漸升高，當荼樹菇添加量為10 mg/L時，生物量達到最大值12.06 g/L，相比對照組提高了7.99%；隨著茶樹菇添加量的增加，新科斯糖的積累量逐漸升高，當茶樹菇添加量為20 mg/L時，新科斯糖的積累量達到最大值215.59 g/L，相比對照組提高了9.87%，然后隨著濃度的繼續(xù)增加，新科斯糖的積累量降低，相比其他真菌誘導子，茶樹菇對細胞的生長和新科斯糖的積累都沒有明顯的促進作用。

2.2 化學誘導子對發(fā)酵生產新科斯糖的影響

2.2.1 金屬離子對發(fā)酵生產新科斯糖的影響

將2 mg/L的金屬離子分別添加到細胞培養(yǎng)過程和新科斯糖的積累過程中，其結果見圖5。

圖5 金屬離子對生物量和新科斯糖積累量的影響

由圖5可知，在培養(yǎng)基中添加Zn2+和Mn2+能明顯促進細胞生長，法夫酵母生物量分別提高了26.71%和16.71%，添加K+、Ca2+、Al3+和Mg2+對細胞生長的作用并不明顯，添加Ag+離子后細胞生物量降低，可見酵母對重金屬Ag+離子的吸附作用抑制了其生長。在新科斯糖積累過程中，Mg2+和Zn2+的作用最為明顯，新科斯糖積累量分別增加了8.49%和5.95%，可見Mg2+和Zn2+作為多種酶的激活劑，可顯著提高法夫酵母產新科斯糖的果糖基轉移酶活性，而其他金屬離子提高果糖基轉移酶活性的作用并不明顯。

2.2.2 硝酸鈰添加量對發(fā)酵生產新科斯糖的影響

由圖6可知，添加硝酸鈰作為化學誘導子時，隨著硝酸鈰添加量的增加，法夫酵母的生物量逐漸降低，可見添加硝酸鈰會抑制細胞生長，而在新科斯糖積累過程中，當硝酸鈰添加量為0.16 mg/L時，新科斯糖積累量最高，為211.23 g/L，相比對照組提高了9.97%，然后隨著硝酸鈰濃度的增加，新科斯糖的積累量顯著降低，可見硝酸鈰在添加量小于0.16 mg/L時，可以增強果糖基轉移酶的活性，當濃度升高時，會抑制酶的活性。

圖6 硝酸鈰對生物量和新科斯糖積累量的影響

2.2.3 氯化鎘添加量對發(fā)酵生產新科斯糖的影響

圖7 氯化鎘對生物量和新科斯糖積累量的影響

由圖7可知，添加氯化鎘作為化學誘導子時，隨著氯化鎘添加量的增加，法夫酵母的生物量逐漸降低，可見添加氯化鎘會抑制細胞生長，而在新科斯糖積累過程中，當氯化鎘添加量為0.12 mg/L時，新科斯糖的積累量最高，為218.72 g/L，相比對照組提高了14.08%，然后隨著氯化鎘濃度的增加，新科斯糖的積累量顯著降低，可見氯化鎘在添加量小于0.16 mg/L時，可以增強果糖基轉移酶的活性，當濃度升高時，會抑制酶的活性。

2.2.4 茉莉酸甲酯添加量對發(fā)酵生產新科斯糖的影響

圖8 茉莉酸甲酯對生物量和新科斯糖積累量的影響

由圖8可知，添加茉莉酸甲酯作為化學誘導子時，隨著茉莉酸甲酯添加量的增加，法夫酵母的生物量逐漸升高，當茉莉酸甲酯添加量為0.08 mg/L時，生物量達到最大值12.62 g/L，相比對照組提高了12.12%；在新科斯糖積累過程中，當茉莉酸甲酯添加量為0.08 mg/L時，新科斯糖的積累量最高，為202.13 g/L，相比對照組提高了5.91%。

3 結論與討論

供試真菌誘導子對法夫酵母新科斯糖積累均有一定的促進作用，靈芝、平菇、秀珍菇和茶樹菇制備的誘導子分別在添加濃度為10，20，5，10 mg/L時法夫酵母生物量最高，分別比對照提高了12.50%、12.11%、7.81%和7.99%；靈芝、平菇、秀珍菇和茶樹菇制備的誘導子分別在添加濃度為10，30，10，20 mg/L時新科斯糖含量最高，分別比對照提高了11.85%、15.08%、19.03%和9.87%?？梢姡谧罴褲舛认?，靈芝和平菇對法夫酵母細胞生長比較有利，平菇和秀珍菇對新科斯糖的積累比較有利，推測真菌能夠促進新科斯糖的生物合成是由于誘導子中含有促進法夫酵母類生長和新科斯糖合成的因子，它們能夠產生一些特殊的酶系而可利用木質素生長，但其機理尚不明確，還需要進一步探究分析。

供試化學誘導子均有利于新科斯糖的積累，2 mg/L的Mn2+和Zn2+能明顯促進細胞生長，法夫酵母的生物量分別提高了26.71%和16.71%，新科斯糖的積累量增加了9.56%和5.18%。

添加硝酸鈰和氯化鎘后，均會抑制法夫酵母細胞生長，可見硝酸鈰和氯化鎘對細胞生長具有一定的毒性，添加茉莉酸甲酯后，在最佳濃度0.08 mg/L下，生物量比對照組提高了12.12%，硝酸鈰、氯化鎘和茉莉酸甲酯誘導子在添加濃度為0.16，0.12，0.08 mg/L時，新科斯糖的積累量最高，分別比對照提高了9.97%、14.08%和5.91%，推測低濃度的硝酸鈰和氯化鎘能夠與影響法夫酵母中果糖基轉移酶表達的某些蛋白相互作用，其機理還需要進一步研究，茉莉酸甲酯本身具有誘導作用，可以促進細胞的生長和新科斯糖的積累。

綜上所述，生物誘導子能促進法夫酵母的生長，從而顯著提高新科斯糖的產量。化學誘導子對生長有一定的促進或抑制作用，但均可以提高新科斯糖的積累量。