李煥婷，黃沂霖，楊慶瑞，韓梅，任浩蕊，高博聞*

（包頭醫(yī)學(xué)院·內(nèi)蒙古包頭·014040）

如達(dá)-6由木香、梔子、石榴皮、鬧羊花、蓽茇、豆蔻6味藥材組成，蒙醫(yī)常因病情需要，將鬧羊花用瞿麥[1-2]。根據(jù)這個(gè)方劑制成的成藥，在市場(chǎng)上銷售的有六味木香膠囊和六味木香丸，具有開(kāi)郁行氣，止痛的功效，用于胃痛、腹痛，噯氣嘔吐。其中木香具有行氣止痛、健脾消食的作用，可用于泄痢后重、不思飲食等癥狀[3]。木香中的主要有效成分為倍半萜內(nèi)酯類化合物木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯，具有抗炎、降血糖、抗腫瘤等作用[4-6]?！吨袊?guó)藥典》2020年版規(guī)定木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯為木香質(zhì)量控制的指標(biāo)[2]。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道了對(duì)如達(dá)-6中胡椒堿、梔子苷的含量測(cè)定的方法，但未見(jiàn)有同時(shí)測(cè)定如達(dá)-6中木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯含量的相關(guān)報(bào)道[7-9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定如達(dá)-6中木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯的含量，操作簡(jiǎn)單、精密度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好，為如達(dá)-6中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液性色譜儀(日本島津公司）；AS10200超聲波清洗機(jī)（北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司）；XS205DU十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

木香烴內(nèi)酯對(duì)照品（成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)AF20052305，純度98%）和去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品（成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)AF21060247，純度98%）；如達(dá)-6（供試品1：六味木香膠囊，江西仁豐藥業(yè)有限公司，批號(hào)210304；供試品2：六味木香丸，包頭市蒙中醫(yī)院制劑室制，批號(hào)2006051）。甲醇為色譜醇，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液制備

取對(duì)照品木香烴內(nèi)酯1.87 mg，精密稱定，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋到刻度線，搖勻，即得木香烴內(nèi)酯對(duì)照品溶液（濃度為0.187 mg/ml）；取對(duì)照品去氫木香內(nèi)酯1.57 mg，精密稱定，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋到刻度線，搖勻，即得去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品溶液(濃度為0.157 mg/ml)。

2.1.2 供試品溶液制備

取本品適量，研碎，取2.00 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理60 min,放冷，再次稱定重量，甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，離心后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Chrom Core 120-C18(4.6×250 mm,5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（65∶35）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：225 nm。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各20 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣并分析，根據(jù)保留時(shí)間和色譜圖定性。供試品溶液色譜圖中，在對(duì)照品溶液色譜圖中兩個(gè)對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處有相同的色譜峰，詳見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇分別制成濃度為0.998 mg/ml的木香烴內(nèi)酯對(duì)照品溶液和1.317 mg/ml的去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品溶液。分別精密稱取木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品溶液0.2、0.5、1、2、4 ml置10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，搖勻，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以濃度（C）為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，詳見(jiàn)表1。

表1 木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào)2006051），按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，分別于供試品溶液制備后0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣并記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯的RSD分別為1.02%和1.13%。表明供試品溶液在24h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液(批號(hào)2006051)，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，測(cè)得的木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯的RSD分別為0.57%和0.89%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批供試品（批號(hào)2006051）6份，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL并記錄峰面積。結(jié)果，木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的平均含量為7.95 mg/g和9.71 mg/g,RSD分別為1.52%和0.72%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯含量為7.95 mg/g和9.71 mg/g的同一批供試品（批號(hào)2006051）9份，各約0.2 g,精密稱定后放入具塞錐形瓶中，分成,3組，每組3份。各組分別加入木香烴內(nèi)酯（濃度為0.798 mg/g）和去氫木香內(nèi)酯（濃度為0.971 mg/g）的對(duì)照品溶液各1、2、3 ml(約相當(dāng)于供試品含有量的50%、100%、150%）及甲醇20 ml。按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣并記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2、3。

表2 木香烴內(nèi)酯加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 去氫木香內(nèi)酯加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9 供試品含量測(cè)定

取3批供試品，每批平行測(cè)定3次，每份約1.00 g，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4、5。

表4 供試品中木香烴內(nèi)酯含量測(cè)定結(jié)果

表5 供試品中去氫木香內(nèi)酯含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

參考《中國(guó)藥典》2015年版一部“木香”項(xiàng)下含量測(cè)定規(guī)定，以HPLC測(cè)定木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量，選用225 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 超聲提取時(shí)間的選擇

為保證被測(cè)組分提取完全，在供試品粉碎度、提取溶劑和超聲功率一致得情況下，分別考察了超聲提取時(shí)間為20、30、40 min的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯提取效率。結(jié)果顯示，超聲提取20、30、40 min時(shí)，供試品中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量基本相同，故選擇超聲提取時(shí)間為30 min,與《中國(guó)藥典》2015年版一部“木香”項(xiàng)下含量測(cè)定的提取時(shí)間一致。

3.3 柱溫的選擇

試驗(yàn)不同柱溫25、30、35、40℃對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，溫度越高，保留時(shí)間減短，出峰時(shí)間會(huì)整體前移，但是木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯的分離度并不會(huì)受到影響，故在保護(hù)色譜柱的前提下，選擇柱溫為30℃。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定如達(dá)-6中木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯的含量，操作簡(jiǎn)單，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，精密度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好，可作為如達(dá)-6中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的含量測(cè)定方法。