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        羊肚菌液體培養(yǎng)基及多糖提取工藝的優(yōu)化

        2022-02-21 01:30:48許俊齊謝春芹曹婷凡軍民宋金俤
        食品工業(yè) 2022年1期
        關(guān)鍵詞:黃豆粉玉米粉羊肚

        許俊齊,謝春芹*,曹婷,凡軍民,宋金俤

        江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院茶與食品科技學(xué)院(句容 212400)

        羊肚菌(Morchella)又名美味羊肚菌,俗稱羊雀菌、包谷菌等,按Ainsworth分類(lèi)系統(tǒng)隸屬于子囊菌亞門(mén)、盤(pán)菌綱、盤(pán)菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬[1-2]。據(jù)《本草綱目》記載,羊肚菌具有化痰理氣、補(bǔ)腦提神、潤(rùn)胃健脾、補(bǔ)腎強(qiáng)身之功效[3]。

        羊肚菌富含多糖、氨基酸、甾醇、有機(jī)酸等活性物質(zhì)。文獻(xiàn)檢索表明,羊肚菌多糖具有調(diào)節(jié)免疫能力、抗腫瘤、抗氧化、抗HIV、降血壓等生物活性[4-6]。羊肚菌多糖主要來(lái)源于固態(tài)發(fā)酵中的子實(shí)體和孢子以及液體發(fā)酵中的菌絲體和胞外發(fā)酵液,其產(chǎn)量的高低與試驗(yàn)菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等因素密切相關(guān)。

        羊肚菌作為中國(guó)的四大名菌之首,其應(yīng)用價(jià)值受到各方關(guān)注。對(duì)于羊肚菌方面的研究?jī)H限于栽培技術(shù)、羊肚菌子實(shí)體提取多糖和營(yíng)養(yǎng)成分功效研究等方面,而利用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)羊肚菌菌絲體并提取多糖方面的研究,鮮有報(bào)道。液體深層發(fā)酵具有穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)和氣候等外界因素限制等優(yōu)點(diǎn),是取代固體栽培種植的必然趨勢(shì)[7]。通過(guò)液體發(fā)酵羊肚菌菌絲體,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及有效成分指標(biāo)不亞于子實(shí)體,因而具有廣闊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)羊肚菌菌種進(jìn)行液體深層發(fā)酵培養(yǎng),探討相應(yīng)碳源、氮源及培養(yǎng)溫度與裝液量對(duì)其菌絲干質(zhì)量與總多糖含量的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)研究探討提取溫度、料液比、浸提時(shí)間等,為羊肚菌菌絲液體培養(yǎng)基多糖提取的深層次開(kāi)發(fā)提供借鑒意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        羊肚菌種及羊肚菌(江蘇食用菌研究所);黃豆粉、玉米粉、馬鈴薯等(市售食品級(jí));葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

        恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);FA 2104 N分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);DHG-9123 A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);L 520微波爐(合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司);CH 2176電磁爐(杭州九陽(yáng)生活電器有限公司);HS-6恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司);電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);FD-2C真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康儀器有限公司)。

        1.2 培養(yǎng)基

        1.2.1 平板培養(yǎng)基

        馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1 000 mL。

        1.2.2 一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基

        葡萄糖0.2%,蛋白胨0.2%,磷酸氫二鉀0.1%,硫酸鎂0.05%,磷酸二氫鉀0.05%,VB110片,水1 000 mL。

        1.2.3 二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基

        葡萄糖0.2%,蛋白胨0.2%,磷酸二氫鉀0.05%,硫酸鎂0.1%,VB110片,水1 000 mL。

        1.2.4 三級(jí)搖瓶培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基)

        參考聶建軍等[9]的培養(yǎng)基配方組成:葡萄糖0.2%,玉米粉0.2%,黃豆粉0.25%,蛋白胨0.25%,磷酸二氫鉀0.1%,硫酸鎂0.05%,水1 000 mL。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 羊肚菌菌絲培養(yǎng)步驟

        1.3.1.1 菌種活化

        參考江潔等[10]的方法,將保存的羊肚菌菌種用接種針接種到平板培養(yǎng)基上,在20~25 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d左右,菌絲可長(zhǎng)滿試管。

        1.3.1.2 一級(jí)搖瓶培養(yǎng)

        將經(jīng)過(guò)活化的羊肚菌菌種接種到一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基中(500 mL的三角瓶裝液150 mL),一級(jí)搖瓶培養(yǎng)條件為接入經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)的羊肚菌菌種2 cm2,在28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)5~6 d。

        1.3.1.3 二級(jí)搖瓶培養(yǎng)

        將一級(jí)搖瓶培養(yǎng)的羊肚菌菌種接種到二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行二級(jí)搖瓶培養(yǎng),在28~30 ℃條件下培養(yǎng)8 d,所得羊肚菌菌種為生產(chǎn)搖瓶二級(jí)種。

        1.3.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

        將二級(jí)種與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)5 d,進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),得到一級(jí)發(fā)酵羊肚菌菌種。

        1.3.1.5 發(fā)酵罐培養(yǎng)

        一級(jí)發(fā)酵羊肚菌菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)24~36 h后,過(guò)濾,得羊肚菌菌絲[11]。

        1.3.1.6 羊肚菌菌絲多糖提取工藝流程

        參考任嘉興等[4]的方法,稱取定量真空干燥后的羊肚菌菌絲體置于錐形瓶,恒溫水浴,按4 500 r/min離心15 min,上清液濃縮,加入4倍體積無(wú)水乙醇,4 ℃冰箱中醇沉12 h,離心,沉淀干燥得粗多糖。

        1.3.2 液體培養(yǎng)基成分單因素試驗(yàn)

        在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上,判定液體培養(yǎng)基中碳源葡萄糖及玉米粉添加量、氮源中蛋白胨及黃豆粉的添加量,礦質(zhì)元素中KH2PO4及MgSO4對(duì)羊肚菌液體菌絲生長(zhǎng)情況存在顯著影響,故設(shè)定:葡萄糖及玉米粉添加量為0.10%+0.10%,0.15%+0.15%,0.20%+0.20%,0.25%+0.25%,0.30%+0.30%和0.35%+0.35%;微量元素中KH2PO4及MgSO4添加量為0.15%+0.10%,0.20%+0.15%,0.25%+0.2%,0.30%+0.25%,0.35%+0.30%和0.40%+0.35%;蛋白胨及黃豆粉添加量為0.15%+0.15%,0.20%+0.20%,0.25%+0.25%,0.30%+0.30%,0.35%+0.35%和0.40%+0.40%;并以菌絲體干質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo),試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值,確定三者最優(yōu)添加量。

        1.3.3 羊肚菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)

        從單因素中篩選出不同水平的葡萄糖及玉米粉添加量、礦質(zhì)元素中KH2PO4及MgSO4、氮源中蛋白胨及黃豆粉的添加量,并設(shè)置空列,進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),因素及水平設(shè)定見(jiàn)表1。每個(gè)處理3次重復(fù),進(jìn)行振蕩培養(yǎng),測(cè)定其菌絲體鮮質(zhì)量及總多糖含量。

        表1 培養(yǎng)基正交L9(34)試驗(yàn)因素與水平 單位:%

        1.3.4 羊肚菌菌絲多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

        在參考文獻(xiàn)[12-13]及前期單因素基礎(chǔ)上,選擇提取溫度、料液比、浸提時(shí)間作為試驗(yàn)因素,并設(shè)置一空白列,并以羊肚菌菌絲多糖提取得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)定見(jiàn)表2。

        表2 多糖提取正交L9(34)試驗(yàn)因素與水平

        1.4 試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定方法

        1.4.1 羊肚菌菌絲體干質(zhì)量測(cè)定方法

        羊肚菌菌絲體發(fā)酵液,采用0.150 mm孔徑(100目)篩網(wǎng)過(guò)濾,用稱過(guò)質(zhì)量后的干燥濾紙抽濾,將菌絲體用蒸餾水抽濾3次,烘干至恒質(zhì)量后稱其質(zhì)量,即得羊肚菌菌絲體干重[14]。

        1.4.2 總多糖測(cè)定

        參照苯酚-硫酸法[15]。

        1.4.3 多糖得率[16]

        2 結(jié)果與分析

        2.1 葡萄糖及玉米粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲體干重的影響

        羊肚菌菌絲生長(zhǎng)可利用多種碳源,其中復(fù)合碳源相比單一碳源更具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)。葡萄糖屬于單糖,菌絲生長(zhǎng)前期,有利于菌絲快速萌發(fā)生長(zhǎng),降低污染率,玉米粉屬多糖,伴隨菌絲分解代謝同時(shí),逐步提供所需碳源,保證菌絲后期生長(zhǎng)[17]。

        葡萄糖及玉米粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲體干重的影響具體見(jiàn)圖1。隨著葡萄糖及玉米粉添加量增加,羊肚菌菌絲體干重呈現(xiàn)逐步升高趨勢(shì)。葡萄糖及玉米粉添加量均為0.3%,菌絲干重量達(dá)到最高值1.21 g/L。繼續(xù)添加此2種碳源則干質(zhì)量有所下降,分析原因在于較高濃度的培養(yǎng)基,導(dǎo)致溶氧量減少,影響羊肚菌菌絲的正常生長(zhǎng)。

        圖1 葡萄糖及玉米粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲體干重的影響

        2.2 KH2PO4及MgSO4添加量對(duì)羊肚菌菌絲體干重的影響

        KH2PO4及MgSO4添加量對(duì)羊肚菌菌絲干重的影響見(jiàn)圖2。兩者為羊肚菌菌絲生長(zhǎng)提供必需的礦質(zhì)元素,是不可或缺的一類(lèi)物質(zhì)。隨著KH2PO4及MgSO4的適量添加,羊肚菌菌絲干重呈現(xiàn)平穩(wěn)增加,而后又逐漸下降。添加量為0.3%和0.25%時(shí),菌絲干重達(dá)到最高值1.16 g/L,繼續(xù)添加量增加,菌絲干重卻無(wú)明顯增加,而后出現(xiàn)下降,分析原因在于,較高濃度的礦質(zhì)元素,影響菌絲的正常生長(zhǎng)。據(jù)此分析認(rèn)為,KH2PO4及MgSO4最佳添加量為0.3%及0.25%。

        圖2 KH2PO4及MgSO4添加量對(duì)羊肚菌菌絲干重的影響

        2.3 蛋白胨及黃豆粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲體干重的影響

        氮源作為羊肚菌菌絲合成氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等的前體物質(zhì),在液體培養(yǎng)基中具有非常重要的作用。蛋白胨富含有機(jī)氮化合物,亦含有一些維生素和糖類(lèi),常被作為微生物培養(yǎng)基的主要原料。此外,黃豆粉屬于混合氮源,價(jià)格低廉,營(yíng)養(yǎng)豐富,可減少液體培養(yǎng)基制作成本[18]。蛋白胨及黃豆粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲體干重的影響見(jiàn)圖3。結(jié)果表明:蛋白胨及黃豆風(fēng)添加量對(duì)羊肚菌菌絲重影響較為明顯,蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%時(shí),每升培養(yǎng)液中的菌絲干質(zhì)量達(dá)1.42 g;繼續(xù)添加量增加,羊肚菌菌絲干質(zhì)量增加不明顯,分析原因可能在于,過(guò)量營(yíng)養(yǎng)對(duì)于菌絲增長(zhǎng)并無(wú)明顯作用,據(jù)此蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%是最適液體培養(yǎng)基氮源添加量。

        圖3 蛋白胨及黃豆粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲干重的影響

        2.4 羊肚菌液體培養(yǎng)基工藝優(yōu)化

        2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

        液體培養(yǎng)基L9(34)試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表3。由表3液體培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)表中的R值可知,影響羊肚菌菌絲干質(zhì)量為C>A>B>D,即蛋白胨及黃豆粉添加量>葡萄糖及玉米粉添加量>KH2PO4及MgSO4添加量。根據(jù)液體培養(yǎng)基配方優(yōu)化的結(jié)果分析得出,優(yōu)化后的配方為A3B2C2,即葡萄糖及玉米粉添加量均為0.35%、KH2PO4添加量0.30%及MgSO4添加量為0.25%、蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%。羊肚菌菌絲在此配方條件下生長(zhǎng)狀況良好,羊肚菌菌絲干質(zhì)量保持在較高水平。

        表3 液體培養(yǎng)基L9(34)試驗(yàn)結(jié)果分析

        對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,即在試驗(yàn)條件下,葡萄糖及玉米粉添加量、蛋白胨及黃豆粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲干質(zhì)量影響顯著(p<0.05),微量元素KH2PO4及MgSO4添加量對(duì)羊肚菌菌絲干質(zhì)量影響不顯著。

        2.4.2 擴(kuò)大性驗(yàn)證試驗(yàn)

        獲得的優(yōu)化方案A3B2C2在9組試驗(yàn)之外,為進(jìn)一步驗(yàn)證確認(rèn)其在實(shí)際生產(chǎn)中的可靠性與可行性,故以其為條件,即葡萄糖及玉米粉添加量均為0.35%、KH2PO4添加量0.30%及MgSO4添加量為0.25%、蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%,進(jìn)行擴(kuò)大性(中試)驗(yàn)證試驗(yàn),試驗(yàn)重復(fù)3次,測(cè)定其菌絲干質(zhì)量平均值為1.57±0.02 g/L,試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于9組試驗(yàn)組,表明該配方為較佳的羊肚菌液體培養(yǎng)基組成條件。

        2.5 羊肚菌菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化

        2.5.1 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

        由表4羊肚菌菌絲多糖提取正交試驗(yàn)表中的R值可知,羊肚菌菌絲多糖提取率的影響因素A>C>B>D,即提取溫度>料液比>提取時(shí)間。根據(jù)羊肚菌菌絲多糖提取工藝優(yōu)化的結(jié)果分析得出,優(yōu)化后的工藝為A2B1C3,即控制提取溫度70 ℃、提取時(shí)間70 min、料液比控制1∶35(mg/mL)。在此條件下,羊肚菌菌絲多糖提取率保持在最高水平。

        表4 多糖提取L9(34)試驗(yàn)結(jié)果分析

        接表4

        此外,對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,即在該試驗(yàn)條件下,提取溫度、提取時(shí)間及料液比皆對(duì)羊肚菌菌絲多糖提取影響顯著(0.01<p<0.05)。

        2.5.2 擴(kuò)大性驗(yàn)證試驗(yàn)

        獲得的優(yōu)化方案A2B1C3未在9組試驗(yàn)之列,為驗(yàn)證確認(rèn)其在實(shí)際生產(chǎn)中的可靠性與可行性,故以其為條件,即提取溫度70 ℃、提取時(shí)間70 min、料液比1∶35(mg/mL),進(jìn)行擴(kuò)大性(中試)驗(yàn)證試驗(yàn),試驗(yàn)重復(fù)3次,測(cè)定其菌絲多糖提取率為4.02%±0.12%,試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于9組試驗(yàn)組,表明該工藝為較佳的羊肚菌菌絲多糖提取工藝。

        3 結(jié)論

        對(duì)羊肚菌液體培養(yǎng)基碳源、氮源及微量元素進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,葡萄糖及玉米粉添加量均為0.35%、KH2PO4添加量為0.30%及MgSO4添加量為0.25%、蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%,羊肚菌菌絲體菌絲干質(zhì)量平均值為1.57±0.02 g/L,保持在較高水平;王云龍[19]通過(guò)研究認(rèn)為,羊肚菌液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基條件為麥芽汁9.5%、玉米粉40 mg/L、黃豆粉20 mg/L、酵母粉30 mg/L,與試驗(yàn)采用相似混合碳源及氮源,對(duì)于降低液體培養(yǎng)基制作成本、滿足羊肚菌菌絲后期生長(zhǎng)需要具有重要作用。

        在對(duì)羊肚菌菌絲多糖提取工藝研究過(guò)程中,通過(guò)正交試驗(yàn)分析得出,最優(yōu)組合為提取溫度70 ℃,提取時(shí)間70 min、料液比控制1∶35(mg/mL)。以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),該工藝條件可明顯提高羊肚菌菌絲多糖的提取率達(dá)4.02%±0.12%。任嘉興等[4]研究認(rèn)為在對(duì)于羊肚菌子實(shí)體多糖進(jìn)行提取時(shí),液料比41∶1 mL/g、提取溫度88 ℃、提取時(shí)間3 h,在此條件下重復(fù)3次,羊肚菌多糖得率穩(wěn)定在4.24%±0.17%。與試驗(yàn)的區(qū)別在于原料不同,選用干燥后的羊肚菌菌絲體,能縮短提取時(shí)間,多糖提取效率基本相近。周益帆等[5]采用堿液提取羊肚菌多糖,控制溫度90 ℃、提取時(shí)間5 h、添加堿液濃度0.7 mol/L、料液比1∶20 g/mL條件下得到的羊肚菌多糖得率為5.39%,但提取時(shí)間長(zhǎng)。此外,后期可對(duì)得到的羊肚菌菌絲多糖的安全性及抗氧化性等方面進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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