許俊齊，謝春芹*，曹婷，凡軍民，宋金俤

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院茶與食品科技學院（句容 212400）

羊肚菌（Morchella）又名美味羊肚菌，俗稱羊雀菌、包谷菌等，按Ainsworth分類系統(tǒng)隸屬于子囊菌亞門、盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬[1-2]。據(jù)《本草綱目》記載，羊肚菌具有化痰理氣、補腦提神、潤胃健脾、補腎強身之功效[3]。

羊肚菌富含多糖、氨基酸、甾醇、有機酸等活性物質(zhì)。文獻檢索表明，羊肚菌多糖具有調(diào)節(jié)免疫能力、抗腫瘤、抗氧化、抗HIV、降血壓等生物活性[4-6]。羊肚菌多糖主要來源于固態(tài)發(fā)酵中的子實體和孢子以及液體發(fā)酵中的菌絲體和胞外發(fā)酵液，其產(chǎn)量的高低與試驗菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等因素密切相關(guān)。

羊肚菌作為中國的四大名菌之首，其應(yīng)用價值受到各方關(guān)注。對于羊肚菌方面的研究僅限于栽培技術(shù)、羊肚菌子實體提取多糖和營養(yǎng)成分功效研究等方面，而利用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)羊肚菌菌絲體并提取多糖方面的研究，鮮有報道。液體深層發(fā)酵具有穩(wěn)定性高、操作簡便、生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)和氣候等外界因素限制等優(yōu)點，是取代固體栽培種植的必然趨勢[7]。通過液體發(fā)酵羊肚菌菌絲體，營養(yǎng)價值及有效成分指標不亞于子實體，因而具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。試驗通過對羊肚菌菌種進行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，探討相應(yīng)碳源、氮源及培養(yǎng)溫度與裝液量對其菌絲干質(zhì)量與總多糖含量的影響。通過單因素試驗及正交試驗研究探討提取溫度、料液比、浸提時間等，為羊肚菌菌絲液體培養(yǎng)基多糖提取的深層次開發(fā)提供借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌種及羊肚菌（江蘇食用菌研究所）；黃豆粉、玉米粉、馬鈴薯等（市售食品級）；葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀（國藥集團化學試劑有限公司）。

恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；FA 2104 N分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；DHG-9123 A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；L 520微波爐（合肥榮事達三洋電器股份有限公司）；CH 2176電磁爐（杭州九陽生活電器有限公司）；HS-6恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；FD-2C真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康儀器有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 平板培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

1.2.2 一級搖瓶培養(yǎng)基

葡萄糖0.2%，蛋白胨0.2%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，VB110片，水1 000 mL。

1.2.3 二級搖瓶培養(yǎng)基

葡萄糖0.2%，蛋白胨0.2%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0.1%，VB110片，水1 000 mL。

1.2.4 三級搖瓶培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基）

參考聶建軍等[9]的培養(yǎng)基配方組成：葡萄糖0.2%，玉米粉0.2%，黃豆粉0.25%，蛋白胨0.25%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，水1 000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 羊肚菌菌絲培養(yǎng)步驟

1.3.1.1 菌種活化

參考江潔等[10]的方法，將保存的羊肚菌菌種用接種針接種到平板培養(yǎng)基上，在20～25 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d左右，菌絲可長滿試管。

1.3.1.2 一級搖瓶培養(yǎng)

將經(jīng)過活化的羊肚菌菌種接種到一級搖瓶培養(yǎng)基中（500 mL的三角瓶裝液150 mL），一級搖瓶培養(yǎng)條件為接入經(jīng)過斜面培養(yǎng)的羊肚菌菌種2 cm2，在28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)5～6 d。

1.3.1.3 二級搖瓶培養(yǎng)

將一級搖瓶培養(yǎng)的羊肚菌菌種接種到二級搖瓶培養(yǎng)基中進行二級搖瓶培養(yǎng)，在28～30 ℃條件下培養(yǎng)8 d，所得羊肚菌菌種為生產(chǎn)搖瓶二級種。

1.3.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

將二級種與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)5 d，進行擴大培養(yǎng)，得到一級發(fā)酵羊肚菌菌種。

1.3.1.5 發(fā)酵罐培養(yǎng)

一級發(fā)酵羊肚菌菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)24～36 h后，過濾，得羊肚菌菌絲[11]。

1.3.1.6 羊肚菌菌絲多糖提取工藝流程

參考任嘉興等[4]的方法，稱取定量真空干燥后的羊肚菌菌絲體置于錐形瓶，恒溫水浴，按4 500 r/min離心15 min，上清液濃縮，加入4倍體積無水乙醇，4 ℃冰箱中醇沉12 h，離心，沉淀干燥得粗多糖。

1.3.2 液體培養(yǎng)基成分單因素試驗

在前期試驗基礎(chǔ)上，判定液體培養(yǎng)基中碳源葡萄糖及玉米粉添加量、氮源中蛋白胨及黃豆粉的添加量，礦質(zhì)元素中KH2PO4及MgSO4對羊肚菌液體菌絲生長情況存在顯著影響，故設(shè)定：葡萄糖及玉米粉添加量為0.10%+0.10%，0.15%+0.15%，0.20%+0.20%，0.25%+0.25%，0.30%+0.30%和0.35%+0.35%；微量元素中KH2PO4及MgSO4添加量為0.15%+0.10%，0.20%+0.15%，0.25%+0.2%，0.30%+0.25%，0.35%+0.30%和0.40%+0.35%；蛋白胨及黃豆粉添加量為0.15%+0.15%，0.20%+0.20%，0.25%+0.25%，0.30%+0.30%，0.35%+0.35%和0.40%+0.40%；并以菌絲體干質(zhì)量為評價指標，試驗重復(fù)3次，取平均值，確定三者最優(yōu)添加量。

1.3.3 羊肚菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

從單因素中篩選出不同水平的葡萄糖及玉米粉添加量、礦質(zhì)元素中KH2PO4及MgSO4、氮源中蛋白胨及黃豆粉的添加量，并設(shè)置空列，進行L9(34)正交試驗，因素及水平設(shè)定見表1。每個處理3次重復(fù)，進行振蕩培養(yǎng)，測定其菌絲體鮮質(zhì)量及總多糖含量。

表1 培養(yǎng)基正交L9(34)試驗因素與水平 單位：%

1.3.4 羊肚菌菌絲多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗

在參考文獻[12-13]及前期單因素基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、料液比、浸提時間作為試驗因素，并設(shè)置一空白列，并以羊肚菌菌絲多糖提取得率作為評價指標，進行L9(34)正交試驗。正交試驗因素及水平設(shè)定見表2。

表2 多糖提取正交L9(34)試驗因素與水平

1.4 試驗指標測定方法

1.4.1 羊肚菌菌絲體干質(zhì)量測定方法

羊肚菌菌絲體發(fā)酵液，采用0.150 mm孔徑（100目）篩網(wǎng)過濾，用稱過質(zhì)量后的干燥濾紙抽濾，將菌絲體用蒸餾水抽濾3次，烘干至恒質(zhì)量后稱其質(zhì)量，即得羊肚菌菌絲體干重[14]。

1.4.2 總多糖測定

參照苯酚-硫酸法[15]。

1.4.3 多糖得率[16]

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖及玉米粉添加量對羊肚菌菌絲體干重的影響

羊肚菌菌絲生長可利用多種碳源，其中復(fù)合碳源相比單一碳源更具有價格優(yōu)勢。葡萄糖屬于單糖，菌絲生長前期，有利于菌絲快速萌發(fā)生長，降低污染率，玉米粉屬多糖，伴隨菌絲分解代謝同時，逐步提供所需碳源，保證菌絲后期生長[17]。

葡萄糖及玉米粉添加量對羊肚菌菌絲體干重的影響具體見圖1。隨著葡萄糖及玉米粉添加量增加，羊肚菌菌絲體干重呈現(xiàn)逐步升高趨勢。葡萄糖及玉米粉添加量均為0.3%，菌絲干重量達到最高值1.21 g/L。繼續(xù)添加此2種碳源則干質(zhì)量有所下降，分析原因在于較高濃度的培養(yǎng)基，導致溶氧量減少，影響羊肚菌菌絲的正常生長。

圖1 葡萄糖及玉米粉添加量對羊肚菌菌絲體干重的影響

2.2 KH2PO4及MgSO4添加量對羊肚菌菌絲體干重的影響

KH2PO4及MgSO4添加量對羊肚菌菌絲干重的影響見圖2。兩者為羊肚菌菌絲生長提供必需的礦質(zhì)元素，是不可或缺的一類物質(zhì)。隨著KH2PO4及MgSO4的適量添加，羊肚菌菌絲干重呈現(xiàn)平穩(wěn)增加，而后又逐漸下降。添加量為0.3%和0.25%時，菌絲干重達到最高值1.16 g/L，繼續(xù)添加量增加，菌絲干重卻無明顯增加，而后出現(xiàn)下降，分析原因在于，較高濃度的礦質(zhì)元素，影響菌絲的正常生長。據(jù)此分析認為，KH2PO4及MgSO4最佳添加量為0.3%及0.25%。

圖2 KH2PO4及MgSO4添加量對羊肚菌菌絲干重的影響

2.3 蛋白胨及黃豆粉添加量對羊肚菌菌絲體干重的影響

氮源作為羊肚菌菌絲合成氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等的前體物質(zhì)，在液體培養(yǎng)基中具有非常重要的作用。蛋白胨富含有機氮化合物，亦含有一些維生素和糖類，常被作為微生物培養(yǎng)基的主要原料。此外，黃豆粉屬于混合氮源，價格低廉，營養(yǎng)豐富，可減少液體培養(yǎng)基制作成本[18]。蛋白胨及黃豆粉添加量對羊肚菌菌絲體干重的影響見圖3。結(jié)果表明：蛋白胨及黃豆風添加量對羊肚菌菌絲重影響較為明顯，蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%時，每升培養(yǎng)液中的菌絲干質(zhì)量達1.42 g；繼續(xù)添加量增加，羊肚菌菌絲干質(zhì)量增加不明顯，分析原因可能在于，過量營養(yǎng)對于菌絲增長并無明顯作用，據(jù)此蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%是最適液體培養(yǎng)基氮源添加量。

圖3 蛋白胨及黃豆粉添加量對羊肚菌菌絲干重的影響

2.4 羊肚菌液體培養(yǎng)基工藝優(yōu)化

2.4.1 正交試驗結(jié)果的極差分析

液體培養(yǎng)基L9(34)試驗結(jié)果分析見表3。由表3液體培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗表中的R值可知，影響羊肚菌菌絲干質(zhì)量為C＞A＞B＞D，即蛋白胨及黃豆粉添加量＞葡萄糖及玉米粉添加量＞KH2PO4及MgSO4添加量。根據(jù)液體培養(yǎng)基配方優(yōu)化的結(jié)果分析得出，優(yōu)化后的配方為A3B2C2，即葡萄糖及玉米粉添加量均為0.35%、KH2PO4添加量0.30%及MgSO4添加量為0.25%、蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%。羊肚菌菌絲在此配方條件下生長狀況良好，羊肚菌菌絲干質(zhì)量保持在較高水平。

表3 液體培養(yǎng)基L9(34)試驗結(jié)果分析

對試驗結(jié)果進行方差分析，即在試驗條件下，葡萄糖及玉米粉添加量、蛋白胨及黃豆粉添加量對羊肚菌菌絲干質(zhì)量影響顯著（p＜0.05），微量元素KH2PO4及MgSO4添加量對羊肚菌菌絲干質(zhì)量影響不顯著。

2.4.2 擴大性驗證試驗

獲得的優(yōu)化方案A3B2C2在9組試驗之外，為進一步驗證確認其在實際生產(chǎn)中的可靠性與可行性，故以其為條件，即葡萄糖及玉米粉添加量均為0.35%、KH2PO4添加量0.30%及MgSO4添加量為0.25%、蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%，進行擴大性（中試）驗證試驗，試驗重復(fù)3次，測定其菌絲干質(zhì)量平均值為1.57±0.02 g/L，試驗結(jié)果優(yōu)于9組試驗組，表明該配方為較佳的羊肚菌液體培養(yǎng)基組成條件。

2.5 羊肚菌菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化

2.5.1 正交試驗結(jié)果的極差分析

由表4羊肚菌菌絲多糖提取正交試驗表中的R值可知，羊肚菌菌絲多糖提取率的影響因素A＞C＞B＞D，即提取溫度＞料液比＞提取時間。根據(jù)羊肚菌菌絲多糖提取工藝優(yōu)化的結(jié)果分析得出，優(yōu)化后的工藝為A2B1C3，即控制提取溫度70 ℃、提取時間70 min、料液比控制1∶35（mg/mL）。在此條件下，羊肚菌菌絲多糖提取率保持在最高水平。

表4 多糖提取L9(34)試驗結(jié)果分析

接表4

此外，對試驗結(jié)果進行方差分析，即在該試驗條件下，提取溫度、提取時間及料液比皆對羊肚菌菌絲多糖提取影響顯著（0.01＜p＜0.05）。

2.5.2 擴大性驗證試驗

獲得的優(yōu)化方案A2B1C3未在9組試驗之列，為驗證確認其在實際生產(chǎn)中的可靠性與可行性，故以其為條件，即提取溫度70 ℃、提取時間70 min、料液比1∶35（mg/mL），進行擴大性（中試）驗證試驗，試驗重復(fù)3次，測定其菌絲多糖提取率為4.02%±0.12%，試驗結(jié)果優(yōu)于9組試驗組，表明該工藝為較佳的羊肚菌菌絲多糖提取工藝。

3 結(jié)論

對羊肚菌液體培養(yǎng)基碳源、氮源及微量元素進行優(yōu)化，結(jié)果表明，葡萄糖及玉米粉添加量均為0.35%、KH2PO4添加量為0.30%及MgSO4添加量為0.25%、蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%，羊肚菌菌絲體菌絲干質(zhì)量平均值為1.57±0.02 g/L，保持在較高水平；王云龍[19]通過研究認為，羊肚菌液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基條件為麥芽汁9.5%、玉米粉40 mg/L、黃豆粉20 mg/L、酵母粉30 mg/L，與試驗采用相似混合碳源及氮源，對于降低液體培養(yǎng)基制作成本、滿足羊肚菌菌絲后期生長需要具有重要作用。

在對羊肚菌菌絲多糖提取工藝研究過程中，通過正交試驗分析得出，最優(yōu)組合為提取溫度70 ℃，提取時間70 min、料液比控制1∶35（mg/mL）。以多糖得率為評價指標，該工藝條件可明顯提高羊肚菌菌絲多糖的提取率達4.02%±0.12%。任嘉興等[4]研究認為在對于羊肚菌子實體多糖進行提取時，液料比41∶1 mL/g、提取溫度88 ℃、提取時間3 h，在此條件下重復(fù)3次，羊肚菌多糖得率穩(wěn)定在4.24%±0.17%。與試驗的區(qū)別在于原料不同，選用干燥后的羊肚菌菌絲體，能縮短提取時間，多糖提取效率基本相近。周益帆等[5]采用堿液提取羊肚菌多糖，控制溫度90 ℃、提取時間5 h、添加堿液濃度0.7 mol/L、料液比1∶20 g/mL條件下得到的羊肚菌多糖得率為5.39%，但提取時間長。此外，后期可對得到的羊肚菌菌絲多糖的安全性及抗氧化性等方面進行進一步研究。