許俊齊，謝春芹*，曹婷，凡軍民，宋金俤

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院茶與食品科技學(xué)院（句容 212400）

羊肚菌（Morchella）又名美味羊肚菌，俗稱羊雀菌、包谷菌等，按Ainsworth分類(lèi)系統(tǒng)隸屬于子囊菌亞門(mén)、盤(pán)菌綱、盤(pán)菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬[1-2]。據(jù)《本草綱目》記載，羊肚菌具有化痰理氣、補(bǔ)腦提神、潤(rùn)胃健脾、補(bǔ)腎強(qiáng)身之功效[3]。

羊肚菌富含多糖、氨基酸、甾醇、有機(jī)酸等活性物質(zhì)。文獻(xiàn)檢索表明，羊肚菌多糖具有調(diào)節(jié)免疫能力、抗腫瘤、抗氧化、抗HIV、降血壓等生物活性[4-6]。羊肚菌多糖主要來(lái)源于固態(tài)發(fā)酵中的子實(shí)體和孢子以及液體發(fā)酵中的菌絲體和胞外發(fā)酵液，其產(chǎn)量的高低與試驗(yàn)菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等因素密切相關(guān)。

羊肚菌作為中國(guó)的四大名菌之首，其應(yīng)用價(jià)值受到各方關(guān)注。對(duì)于羊肚菌方面的研究?jī)H限于栽培技術(shù)、羊肚菌子實(shí)體提取多糖和營(yíng)養(yǎng)成分功效研究等方面，而利用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)羊肚菌菌絲體并提取多糖方面的研究，鮮有報(bào)道。液體深層發(fā)酵具有穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)周期短、不受季節(jié)和氣候等外界因素限制等優(yōu)點(diǎn)，是取代固體栽培種植的必然趨勢(shì)[7]。通過(guò)液體發(fā)酵羊肚菌菌絲體，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及有效成分指標(biāo)不亞于子實(shí)體，因而具有廣闊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)羊肚菌菌種進(jìn)行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，探討相應(yīng)碳源、氮源及培養(yǎng)溫度與裝液量對(duì)其菌絲干質(zhì)量與總多糖含量的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)研究探討提取溫度、料液比、浸提時(shí)間等，為羊肚菌菌絲液體培養(yǎng)基多糖提取的深層次開(kāi)發(fā)提供借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌種及羊肚菌（江蘇食用菌研究所）；黃豆粉、玉米粉、馬鈴薯等（市售食品級(jí)）；葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；FA 2104 N分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；DHG-9123 A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；L 520微波爐（合肥榮事達(dá)三洋電器股份有限公司）；CH 2176電磁爐（杭州九陽(yáng)生活電器有限公司）；HS-6恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；FD-2C真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康儀器有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 平板培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

1.2.2 一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基

葡萄糖0.2%，蛋白胨0.2%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，VB110片，水1 000 mL。

1.2.3 二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基

葡萄糖0.2%，蛋白胨0.2%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0.1%，VB110片，水1 000 mL。

1.2.4 三級(jí)搖瓶培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基）

參考聶建軍等[9]的培養(yǎng)基配方組成：葡萄糖0.2%，玉米粉0.2%，黃豆粉0.25%，蛋白胨0.25%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，水1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羊肚菌菌絲培養(yǎng)步驟

1.3.1.1 菌種活化

參考江潔等[10]的方法，將保存的羊肚菌菌種用接種針接種到平板培養(yǎng)基上，在20～25 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d左右，菌絲可長(zhǎng)滿試管。

1.3.1.2 一級(jí)搖瓶培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)活化的羊肚菌菌種接種到一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基中（500 mL的三角瓶裝液150 mL），一級(jí)搖瓶培養(yǎng)條件為接入經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)的羊肚菌菌種2 cm2，在28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)5～6 d。

1.3.1.3 二級(jí)搖瓶培養(yǎng)

將一級(jí)搖瓶培養(yǎng)的羊肚菌菌種接種到二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行二級(jí)搖瓶培養(yǎng)，在28～30 ℃條件下培養(yǎng)8 d，所得羊肚菌菌種為生產(chǎn)搖瓶二級(jí)種。

1.3.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

將二級(jí)種與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)5 d，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到一級(jí)發(fā)酵羊肚菌菌種。

1.3.1.5 發(fā)酵罐培養(yǎng)

一級(jí)發(fā)酵羊肚菌菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)24～36 h后，過(guò)濾，得羊肚菌菌絲[11]。

1.3.1.6 羊肚菌菌絲多糖提取工藝流程

參考任嘉興等[4]的方法，稱取定量真空干燥后的羊肚菌菌絲體置于錐形瓶，恒溫水浴，按4 500 r/min離心15 min，上清液濃縮，加入4倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃冰箱中醇沉12 h，離心，沉淀干燥得粗多糖。

1.3.2 液體培養(yǎng)基成分單因素試驗(yàn)

在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上，判定液體培養(yǎng)基中碳源葡萄糖及玉米粉添加量、氮源中蛋白胨及黃豆粉的添加量，礦質(zhì)元素中KH2PO4及MgSO4對(duì)羊肚菌液體菌絲生長(zhǎng)情況存在顯著影響，故設(shè)定：葡萄糖及玉米粉添加量為0.10%+0.10%，0.15%+0.15%，0.20%+0.20%，0.25%+0.25%，0.30%+0.30%和0.35%+0.35%；微量元素中KH2PO4及MgSO4添加量為0.15%+0.10%，0.20%+0.15%，0.25%+0.2%，0.30%+0.25%，0.35%+0.30%和0.40%+0.35%；蛋白胨及黃豆粉添加量為0.15%+0.15%，0.20%+0.20%，0.25%+0.25%，0.30%+0.30%，0.35%+0.35%和0.40%+0.40%；并以菌絲體干質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，確定三者最優(yōu)添加量。

1.3.3 羊肚菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)

從單因素中篩選出不同水平的葡萄糖及玉米粉添加量、礦質(zhì)元素中KH2PO4及MgSO4、氮源中蛋白胨及黃豆粉的添加量，并設(shè)置空列，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素及水平設(shè)定見(jiàn)表1。每個(gè)處理3次重復(fù)，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，測(cè)定其菌絲體鮮質(zhì)量及總多糖含量。

表1 培養(yǎng)基正交L9(34)試驗(yàn)因素與水平 單位：%

1.3.4 羊肚菌菌絲多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在參考文獻(xiàn)[12-13]及前期單因素基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、料液比、浸提時(shí)間作為試驗(yàn)因素，并設(shè)置一空白列，并以羊肚菌菌絲多糖提取得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)定見(jiàn)表2。

表2 多糖提取正交L9(34)試驗(yàn)因素與水平

1.4 試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定方法

1.4.1 羊肚菌菌絲體干質(zhì)量測(cè)定方法

羊肚菌菌絲體發(fā)酵液，采用0.150 mm孔徑（100目）篩網(wǎng)過(guò)濾，用稱過(guò)質(zhì)量后的干燥濾紙抽濾，將菌絲體用蒸餾水抽濾3次，烘干至恒質(zhì)量后稱其質(zhì)量，即得羊肚菌菌絲體干重[14]。

1.4.2 總多糖測(cè)定

參照苯酚-硫酸法[15]。

1.4.3 多糖得率[16]

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖及玉米粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲體干重的影響

羊肚菌菌絲生長(zhǎng)可利用多種碳源，其中復(fù)合碳源相比單一碳源更具有價(jià)格優(yōu)勢(shì)。葡萄糖屬于單糖，菌絲生長(zhǎng)前期，有利于菌絲快速萌發(fā)生長(zhǎng)，降低污染率，玉米粉屬多糖，伴隨菌絲分解代謝同時(shí)，逐步提供所需碳源，保證菌絲后期生長(zhǎng)[17]。

葡萄糖及玉米粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲體干重的影響具體見(jiàn)圖1。隨著葡萄糖及玉米粉添加量增加，羊肚菌菌絲體干重呈現(xiàn)逐步升高趨勢(shì)。葡萄糖及玉米粉添加量均為0.3%，菌絲干重量達(dá)到最高值1.21 g/L。繼續(xù)添加此2種碳源則干質(zhì)量有所下降，分析原因在于較高濃度的培養(yǎng)基，導(dǎo)致溶氧量減少，影響羊肚菌菌絲的正常生長(zhǎng)。

圖1 葡萄糖及玉米粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲體干重的影響

2.2 KH2PO4及MgSO4添加量對(duì)羊肚菌菌絲體干重的影響

KH2PO4及MgSO4添加量對(duì)羊肚菌菌絲干重的影響見(jiàn)圖2。兩者為羊肚菌菌絲生長(zhǎng)提供必需的礦質(zhì)元素，是不可或缺的一類(lèi)物質(zhì)。隨著KH2PO4及MgSO4的適量添加，羊肚菌菌絲干重呈現(xiàn)平穩(wěn)增加，而后又逐漸下降。添加量為0.3%和0.25%時(shí)，菌絲干重達(dá)到最高值1.16 g/L，繼續(xù)添加量增加，菌絲干重卻無(wú)明顯增加，而后出現(xiàn)下降，分析原因在于，較高濃度的礦質(zhì)元素，影響菌絲的正常生長(zhǎng)。據(jù)此分析認(rèn)為，KH2PO4及MgSO4最佳添加量為0.3%及0.25%。

圖2 KH2PO4及MgSO4添加量對(duì)羊肚菌菌絲干重的影響

2.3 蛋白胨及黃豆粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲體干重的影響

氮源作為羊肚菌菌絲合成氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等的前體物質(zhì)，在液體培養(yǎng)基中具有非常重要的作用。蛋白胨富含有機(jī)氮化合物，亦含有一些維生素和糖類(lèi)，常被作為微生物培養(yǎng)基的主要原料。此外，黃豆粉屬于混合氮源，價(jià)格低廉，營(yíng)養(yǎng)豐富，可減少液體培養(yǎng)基制作成本[18]。蛋白胨及黃豆粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲體干重的影響見(jiàn)圖3。結(jié)果表明：蛋白胨及黃豆風(fēng)添加量對(duì)羊肚菌菌絲重影響較為明顯，蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%時(shí)，每升培養(yǎng)液中的菌絲干質(zhì)量達(dá)1.42 g；繼續(xù)添加量增加，羊肚菌菌絲干質(zhì)量增加不明顯，分析原因可能在于，過(guò)量營(yíng)養(yǎng)對(duì)于菌絲增長(zhǎng)并無(wú)明顯作用，據(jù)此蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%是最適液體培養(yǎng)基氮源添加量。

圖3 蛋白胨及黃豆粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲干重的影響

2.4 羊肚菌液體培養(yǎng)基工藝優(yōu)化

2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

液體培養(yǎng)基L9(34)試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表3。由表3液體培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)表中的R值可知，影響羊肚菌菌絲干質(zhì)量為C＞A＞B＞D，即蛋白胨及黃豆粉添加量＞葡萄糖及玉米粉添加量＞KH2PO4及MgSO4添加量。根據(jù)液體培養(yǎng)基配方優(yōu)化的結(jié)果分析得出，優(yōu)化后的配方為A3B2C2，即葡萄糖及玉米粉添加量均為0.35%、KH2PO4添加量0.30%及MgSO4添加量為0.25%、蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%。羊肚菌菌絲在此配方條件下生長(zhǎng)狀況良好，羊肚菌菌絲干質(zhì)量保持在較高水平。

表3 液體培養(yǎng)基L9(34)試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，即在試驗(yàn)條件下，葡萄糖及玉米粉添加量、蛋白胨及黃豆粉添加量對(duì)羊肚菌菌絲干質(zhì)量影響顯著（p＜0.05），微量元素KH2PO4及MgSO4添加量對(duì)羊肚菌菌絲干質(zhì)量影響不顯著。

2.4.2 擴(kuò)大性驗(yàn)證試驗(yàn)

獲得的優(yōu)化方案A3B2C2在9組試驗(yàn)之外，為進(jìn)一步驗(yàn)證確認(rèn)其在實(shí)際生產(chǎn)中的可靠性與可行性，故以其為條件，即葡萄糖及玉米粉添加量均為0.35%、KH2PO4添加量0.30%及MgSO4添加量為0.25%、蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%，進(jìn)行擴(kuò)大性（中試）驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定其菌絲干質(zhì)量平均值為1.57±0.02 g/L，試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于9組試驗(yàn)組，表明該配方為較佳的羊肚菌液體培養(yǎng)基組成條件。

2.5 羊肚菌菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化

2.5.1 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

由表4羊肚菌菌絲多糖提取正交試驗(yàn)表中的R值可知，羊肚菌菌絲多糖提取率的影響因素A＞C＞B＞D，即提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間。根據(jù)羊肚菌菌絲多糖提取工藝優(yōu)化的結(jié)果分析得出，優(yōu)化后的工藝為A2B1C3，即控制提取溫度70 ℃、提取時(shí)間70 min、料液比控制1∶35（mg/mL）。在此條件下，羊肚菌菌絲多糖提取率保持在最高水平。

表4 多糖提取L9(34)試驗(yàn)結(jié)果分析

接表4

此外，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，即在該試驗(yàn)條件下，提取溫度、提取時(shí)間及料液比皆對(duì)羊肚菌菌絲多糖提取影響顯著（0.01＜p＜0.05）。

2.5.2 擴(kuò)大性驗(yàn)證試驗(yàn)

獲得的優(yōu)化方案A2B1C3未在9組試驗(yàn)之列，為驗(yàn)證確認(rèn)其在實(shí)際生產(chǎn)中的可靠性與可行性，故以其為條件，即提取溫度70 ℃、提取時(shí)間70 min、料液比1∶35（mg/mL），進(jìn)行擴(kuò)大性（中試）驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定其菌絲多糖提取率為4.02%±0.12%，試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于9組試驗(yàn)組，表明該工藝為較佳的羊肚菌菌絲多糖提取工藝。

3 結(jié)論

對(duì)羊肚菌液體培養(yǎng)基碳源、氮源及微量元素進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，葡萄糖及玉米粉添加量均為0.35%、KH2PO4添加量為0.30%及MgSO4添加量為0.25%、蛋白胨及黃豆粉添加量均為0.35%，羊肚菌菌絲體菌絲干質(zhì)量平均值為1.57±0.02 g/L，保持在較高水平；王云龍[19]通過(guò)研究認(rèn)為，羊肚菌液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基條件為麥芽汁9.5%、玉米粉40 mg/L、黃豆粉20 mg/L、酵母粉30 mg/L，與試驗(yàn)采用相似混合碳源及氮源，對(duì)于降低液體培養(yǎng)基制作成本、滿足羊肚菌菌絲后期生長(zhǎng)需要具有重要作用。

在對(duì)羊肚菌菌絲多糖提取工藝研究過(guò)程中，通過(guò)正交試驗(yàn)分析得出，最優(yōu)組合為提取溫度70 ℃，提取時(shí)間70 min、料液比控制1∶35（mg/mL）。以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，該工藝條件可明顯提高羊肚菌菌絲多糖的提取率達(dá)4.02%±0.12%。任嘉興等[4]研究認(rèn)為在對(duì)于羊肚菌子實(shí)體多糖進(jìn)行提取時(shí)，液料比41∶1 mL/g、提取溫度88 ℃、提取時(shí)間3 h，在此條件下重復(fù)3次，羊肚菌多糖得率穩(wěn)定在4.24%±0.17%。與試驗(yàn)的區(qū)別在于原料不同，選用干燥后的羊肚菌菌絲體，能縮短提取時(shí)間，多糖提取效率基本相近。周益帆等[5]采用堿液提取羊肚菌多糖，控制溫度90 ℃、提取時(shí)間5 h、添加堿液濃度0.7 mol/L、料液比1∶20 g/mL條件下得到的羊肚菌多糖得率為5.39%，但提取時(shí)間長(zhǎng)。此外，后期可對(duì)得到的羊肚菌菌絲多糖的安全性及抗氧化性等方面進(jìn)行進(jìn)一步研究。