林榮發(fā)，鐘曉芳，戴美娜，劉祖文，馬穆彪，江 洲，傅 紅*

（1 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 福州 350108 2 福建天馬科技集團(tuán)股份有限公司 福州 350308）

利用有機(jī)凝膠劑構(gòu)筑晶體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以固化液態(tài)油脂，是重要的代替反式脂肪和飽和脂肪的油脂凝膠化技術(shù)[1]。植物甾醇具有降低膽固醇、免疫調(diào)節(jié)等生理功能，是許多國(guó)家認(rèn)可的食品添加劑或新資源食品[2-3]。2006年，Bot 等[4]首次研究β-谷甾醇和γ-谷維素混合物在植物油中的凝膠性能，與其它單一組分的凝膠劑（如乙基纖維素[5]等大分子凝膠劑和12-羥基硬脂酸[6]等小分子凝膠劑）不同，β-谷甾醇的羥基與γ-谷維素的羰基形成分子間氫鍵，在β-谷甾醇和γ-谷維素質(zhì)量比為2∶3時(shí)，產(chǎn)生最大的氫鍵效應(yīng)[7]，兩者通過氫鍵相互吸引形成自組裝晶體并構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)將液態(tài)油脂包裹其中[8]。

目前，植物甾醇凝膠劑的研究主要集中于凝膠機(jī)理、微觀結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能等方面[9-11]，然而，其凝膠化油脂的氧化特性未見報(bào)道。有研究表明，β-谷甾醇對(duì)氧自由基具有抑制作用[12]，γ-谷維素的阿魏酸基團(tuán)和共軛體系能夠阻斷油脂氧化自由基的鏈?zhǔn)絺鬟f[13]，然而，等物質(zhì)的量的β-谷甾醇和γ-谷維素的自組裝凝膠對(duì)油脂氧化的影響尚未明確。凝膠化油脂的氧化狀態(tài)可能與有機(jī)凝膠劑含量、凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和加工方式等因素相關(guān)[5，14-15]。本文以大豆油為基料油，研究β-谷甾醇和γ-谷維素自組裝的植物甾醇凝膠劑對(duì)油脂氧化的影響，包括凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、β-谷甾醇和γ-谷維素各自對(duì)油脂氧化的影響以及植物甾醇凝膠化油脂在貯藏加工過程中的氧化特性，并利用核磁共振氫譜分析其熱氧化行為，以期為植物甾醇凝膠化油脂的工業(yè)化生產(chǎn)及產(chǎn)品的氧化穩(wěn)定性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆油，嘉里特種油脂（上海）有限公司；β-谷甾醇（純度95%），西安開來生物工程有限公司；γ-谷維素（純度95%），隨州佳科醫(yī)藥化工有限公司；氘代氯仿（光譜純），美國(guó)CIL 公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S 集熱式加熱攪拌器，鞏義市予華儀器公司；DNP-9052 恒溫培養(yǎng)箱，上海偵翔機(jī)電科技公司；MCR302 旋轉(zhuǎn)流變儀，奧地利安東帕公司；BK-POLR 偏振光顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器公司；5977A 氣相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；500 MHz 核磁共振波譜儀，德國(guó)布魯克科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 分別向大豆油中添加2%，4%，6%，8%，10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的植物甾醇凝膠劑（β-谷甾醇與γ-谷維素質(zhì)量比2∶3），在130 ℃下加熱攪拌11 min，冷卻至室溫后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保存24 h[16]。對(duì)照組只含有大豆油，單獨(dú)添加β-谷甾醇或γ-谷維素的樣品步驟同上。

1.3.2 加速氧化 模擬貯藏組：分別將不同植物甾醇凝膠劑添加量的樣品置于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱貯藏1～10 d。模擬加工組：分別將6%植物甾醇凝膠油置于30～180 ℃烤箱加熱0～2.5 h。熱氧化組：將6%植物甾醇凝膠油置于70 ℃烤箱避光貯藏35 d。

1.3.3 頂空耗氧量的測(cè)定 氣相色譜儀參數(shù)：TCD 檢測(cè)器，進(jìn)樣口溫度120 ℃，檢測(cè)器溫度230℃，柱溫25 ℃，載氣（He2）流速5 mL/min，尾吹氣（He2）流速3 mL/min，分流比50∶1[17]。頂空耗氧量按公式（1）計(jì)算。

式中，頂空原始氧氣含量為（20.8±0.1）%。

1.3.4 傳統(tǒng)氧化指標(biāo)的測(cè)定 過氧化值的測(cè)定：參照GB 5009.227-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》[18]；丙二醛含量的測(cè)定：參照GB 5009.181-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙二醛的測(cè)定》[19]；茴香胺值的測(cè)定：參照GB/T 24304-2009《動(dòng)植物油脂 茴香胺值的測(cè)定》[20]?？傃趸禐檐钕惆分蹬c4 倍的過氧化值之和[21]。

1.3.5 流變學(xué)性質(zhì) 45 ℃條件下，保持應(yīng)變?yōu)?.01%（線性黏彈區(qū)域內(nèi)），頻率范圍0.1～100 Hz[22]，測(cè)定樣品的彈性模量（G′）和黏性模量（G"）隨頻率變化的曲線。

1.3.6 偏振光顯微鏡的觀察 取適量樣品于載玻片上，蓋上蓋玻片輕壓成透明均勻的薄片，用偏振光顯微鏡觀察樣品的微觀晶體形態(tài)，放大倍數(shù)為200。

1.3.7 核磁共振氫譜的測(cè)定 取1 mL 樣品溶解于5 mL 氘代氯仿中，渦旋5 s 混勻后，取0.6 mL移入核磁管，室溫靜置5 min。1H NMR 譜測(cè)定參數(shù)為：掃描次數(shù)16 次，以四甲基硅烷（TMS，δ=0）為內(nèi)標(biāo)，譜寬δ 0～20，脈沖間隔2 s，脈沖序列zg30[23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3 次，利用SPSS 19 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 表明存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物甾醇添加量對(duì)凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響

質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，6%，8%，10%的植物甾醇凝膠劑（β-谷甾醇與γ-谷維素質(zhì)量比2∶3）對(duì)凝膠化大豆油頻率和黏彈性模量曲線關(guān)系的影響如圖1所示。在10-1～102Hz 掃描范圍內(nèi)，4%添加量樣品的G′和G" 隨頻率的增加而增加，表現(xiàn)為頻率依賴性，說明還未形成穩(wěn)定的凝膠。6%～10%添加量時(shí)，樣品的G′和G"不依賴于頻率變化，且G′始終大于G"，表現(xiàn)為類固體狀態(tài)，說明體系已形成穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)。從凝膠機(jī)理看，β-谷甾醇和γ-谷維素在大豆油中形成的氫鍵數(shù)量隨著凝膠劑添加量的增加而增多，自組裝晶體密度增大，形成穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并最終呈現(xiàn)出類似固體的流變學(xué)行為。

圖1 不同植物甾醇凝膠劑添加量對(duì)大豆油頻率-黏彈性模量曲線的影響Fig.1 Effect of different additions of phytosterol organogelators on the curves of frequency and storage and loss modulus of soybean oil

用偏振光顯微鏡觀察4%和6%的植物甾醇凝膠劑對(duì)凝膠化大豆油晶體形態(tài)的影響。如圖2所示，在45 ℃下貯藏1～10 d（2～4 d，6～9 d 的偏振光顯微鏡圖未列出），添加4%凝膠劑的油脂體系幾乎沒有成型的晶體，6%植物甾醇凝膠化油脂存在大量簇狀聚集針狀晶體，呈現(xiàn)出規(guī)則且緊密的形似蒲公英的聚集態(tài)，這與圖1顯示的類固體流變特征相對(duì)應(yīng)。另外，圖像顯示貯藏10 d 時(shí)，6%植物甾醇凝膠化油脂的晶體充分形成并聚集延伸為致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.2 植物甾醇凝膠劑添加量對(duì)大豆油氧化的影響

在45 ℃貯藏10 d，植物甾醇凝膠劑的添加量對(duì)油脂過氧化值、丙二醛含量和頂空耗氧量的影響如圖3所示。已有研究表明，頂空耗氧法能動(dòng)態(tài)反映油脂氧化過程中氧氣的消耗量，適用于準(zhǔn)確直觀反映凝膠化油脂的氧化程度[5，17]。數(shù)據(jù)顯示，過氧化值隨著凝膠劑添加量（2%～10%）的增加呈增大趨勢(shì)，而在添加量為6%時(shí)，與4%添加量相比，過氧化值下降了0.21 mmol/kg；頂空耗氧量和丙二醛含量的變化趨勢(shì)一致，當(dāng)添加量為2%，4%時(shí)，顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。在6%添加量時(shí)，頂空耗氧量和丙二醛含量均表現(xiàn)為最低，與4%添加量相比頂空耗氧量下降11.60%（P<0.05），丙二醛含量下降0.77 mg/kg （P<0.05）。當(dāng)添加量為8%，10%時(shí)，頂空耗氧量基本不變，丙二醛含量雖然有所增加，但仍顯著小于4%添加量（P<0.05）。由此可見，添加6%植物甾醇凝膠劑的凝膠化大豆油的氧化穩(wěn)定性最好。這一結(jié)論與圖1和圖2的數(shù)據(jù)相對(duì)應(yīng)，表明此時(shí)大豆油凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，阻礙油脂和氧氣的分子運(yùn)動(dòng)，提高了油脂氧化穩(wěn)定性。

圖2 不同凝膠劑添加量和貯藏時(shí)間的凝膠化大豆油偏振光顯微鏡圖Fig.2 Polarized light microscopy images of oleogels with different organogelators addition and storage periods

圖3 植物甾醇凝膠劑添加量對(duì)油脂氧化的影響Fig.3 Effect of the addition of phytosterol organogelators on the oxidation of soybean oil

2.3 β-谷甾醇和γ-谷維素分別對(duì)油脂氧化的影響

在45 ℃貯藏10 d，β-谷甾醇、γ-谷維素及其凝膠態(tài)對(duì)油脂氧化的影響如圖4所示。數(shù)據(jù)顯示，單獨(dú)添加β-谷甾醇的頂空耗氧量與添加量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.866，P<0.01），在添加量為8%，10%時(shí)，比對(duì)照組顯著降低（P<0.05），表現(xiàn)出一定的抗氧化作用。單獨(dú)添加γ-谷維素的頂空耗氧量均比對(duì)照組顯著升高（P<0.05），與添加量呈正相關(guān)（r=0.912，P<0.01），說明γ-谷維素具有促氧化作用。雖然有研究表明，添加適量（約1%以內(nèi)）谷維素能提高油脂的氧化穩(wěn)定性[24-25]，但是為使大豆油凝膠化，本試驗(yàn)考察的γ-谷維素添加量均大于1%（2%～10%的植物甾醇凝膠劑，其中β-谷甾醇與γ-谷維素質(zhì)量比2∶3）。因此，γ-谷維素的促氧化作用可能與其它鏈阻斷型酚類抗氧化劑類似，即添加量超過最佳水平的酚類化合物及其酚基會(huì)參與氧化副反應(yīng)，促進(jìn)油脂氧化[26]。

圖4 植物甾醇凝膠劑及其成分對(duì)油脂頂空耗氧量的影響Fig.4 Effect of phytosterol organogelators and its components on the headspace oxygen consumption of oil

同時(shí)，數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)添加量為2%，4%時(shí)，植物甾醇凝膠劑的頂空耗氧量約等于β-谷甾醇與γ-谷維素各自的頂空耗氧量按2∶3 比例的疊加之和，如2%添加量時(shí)，β-谷甾醇、γ-谷維素油脂體系的頂空耗氧量分別為28.70%，34.41%，兩者按2∶3 疊加之和約等于植物甾醇凝膠劑的真實(shí)頂空耗氧量32.22%。當(dāng)添加量為6%～10%時(shí)，凝膠劑的頂空耗氧量遠(yuǎn)低于兩者按比例疊加之和（降低約10%），暗示植物甾醇凝膠劑在6%以上的添加量后，形成的穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)更加充分地阻礙油脂氧化。以上結(jié)果顯示，β-谷甾醇和γ-谷維素凝膠劑的抗氧化效應(yīng)主要是β-谷甾醇和穩(wěn)定的凝膠化網(wǎng)絡(luò)共同貢獻(xiàn)的結(jié)果。

2.4 加工溫度和時(shí)間對(duì)油脂氧化的影響

凝膠化油脂應(yīng)用于特種油脂時(shí)，將隨著復(fù)雜的食品制作過程經(jīng)歷不同的加工溫度和時(shí)間。其中，不同加熱溫度（30～180 ℃）對(duì)6%植物甾醇凝膠化油脂的頂空耗氧量的影響如圖5所示。數(shù)據(jù)顯示，30～120 ℃下加熱1 h，植物甾醇凝膠化大豆油的頂空耗氧量與對(duì)照組基本相當(dāng)；在150，180℃下加熱1 h，雖然頂空耗氧量均顯著增加（P<0.05），但6%植物甾醇凝膠化油脂的頂空耗氧量略低于對(duì)照組。為進(jìn)一步研究植物甾醇凝膠化油脂在高溫條件下的氧化穩(wěn)定性，對(duì)其進(jìn)行不同時(shí)間的加熱處理。圖6數(shù)據(jù)顯示，180 ℃下加熱0～2.5 h，6%植物甾醇凝膠化油脂的頂空耗氧量始終低于對(duì)照組，且隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，兩者的頂空耗氧量差距逐漸增大，在2.5 h 時(shí)，頂空耗氧量相差5.00%，說明在高溫加工條件下6%的植物甾醇凝膠劑有利于減緩油脂氧化的程度。

圖5 加熱1 h 時(shí)不同加熱溫度對(duì)凝膠化大豆油頂空耗氧量的影響Fig.5 Effect of heating temperatures on the headspace oxygen consumption of soybean oil for heating one hour

圖6 180 ℃下不同加工時(shí)間對(duì)凝膠化大豆油頂空耗氧量的影響Fig.6 Effect of different processing times on the headspace oxygen consumption of soybean oil at 180 ℃

2.5 植物甾醇凝膠化油脂的熱氧化分析

圖7是新鮮制備的6%植物甾醇凝膠化油脂的核磁共振氫譜（1H NMR）圖，δ 0～5.5 區(qū)間的9個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)甘油三酯中不同結(jié)構(gòu)的氫質(zhì)子。70℃熱氧化過程中，1H NMR 位于δ 5.7～6.6（代表共軛二烯質(zhì)子）和δ 9.5～9.8（代表醛質(zhì)子）[27-28]區(qū)間的信號(hào)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，如圖8所示。這表明在植物甾醇凝膠化油脂的熱氧化過程中，隨著大豆油不飽和脂肪酸的氧化分解，烯族類（峰A）和二烯丙基（峰C）質(zhì)子逐漸減少，飽和脂肪族質(zhì)子（峰D、E、F、G、H）則相應(yīng)增加，同時(shí)生成新的初級(jí)氧化產(chǎn)物和次級(jí)氧化產(chǎn)物，如共軛二烯和醛。

圖7 植物甾醇凝膠化油脂的核磁共振氫譜譜圖Fig.7 1H NMR spectra of phytosterol oleogels

圖9為70 ℃貯藏過程中6%植物甾醇凝膠油的過氧化值和茴香胺值變化，兩數(shù)值隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)與圖8油脂氧化產(chǎn)物的1H NMR 一致。為進(jìn)一步定量分析凝膠油的氧化，將脂肪族質(zhì)子（δ 0.6～2.5）與烯質(zhì)子（δ 5.1～5.4）峰面積積分的比值記為Rao，脂肪族質(zhì)子與二烯丙基亞甲基質(zhì)子（δ 2.6～2.9）峰面積積分的比值記為Rad[5]，并分別與總氧化值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖10所示?？傃趸蹬cRao、Rad的相關(guān)系數(shù)分別為0.9300，0.9185，具有較高的正相關(guān)性。因此，高場(chǎng)核磁共振技術(shù)可用于快速、無損估計(jì)植物甾醇凝膠化油脂在貯藏過程中的氧化穩(wěn)定性。

圖8 70 ℃貯藏過程中1H NMR 在δ 5.7～6.6和δ 9.5～9.8 的圖Fig.8 1H NMR spectra at δ 5.7～6.6 and δ 9.5～9.8 during different storage periods at 70 ℃

圖9 在70 ℃不同貯藏時(shí)間的過氧化值和茴香胺值變化Fig.9 Changes of peroxide value and anisidine value during different storage periods at 70 ℃

圖10 植物甾醇凝膠化油脂總氧化值與Rao、Rad的相關(guān)性分析Fig.10 Correlation analysis of the total oxidation value of phytosterol oleogels with Rao and Rad

3 結(jié)論

β-谷甾醇和γ-谷維素植物甾醇型凝膠劑的氧化研究顯示，45 ℃貯藏10 d 時(shí)，6%植物甾醇型凝膠劑添加量的凝膠化大豆油G′和G"不依賴于頻率變化，且G′始終大于G"，說明體系已形成穩(wěn)定的類固體凝膠結(jié)構(gòu)。過氧化值、丙二醛含量和頂空耗氧量的油脂氧化數(shù)據(jù)顯示，添加6%植物甾醇凝膠劑的凝膠化大豆油的氧化穩(wěn)定性最好；其中β-谷甾醇表現(xiàn)出一定的抗氧化作用，γ-谷維素具有促氧化作用，植物甾醇凝膠劑的抗氧化效應(yīng)主要是β-谷甾醇和穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)共同貢獻(xiàn)的結(jié)果。同時(shí)，植物甾醇凝膠化油脂在180 ℃高溫加工的氧化程度比對(duì)照組低，表現(xiàn)出較好的熱氧化穩(wěn)定性。70 ℃熱氧化過程中，基于核磁共振氫譜的Rao、Rad值與總氧化值具有良好的正相關(guān)性。