李思迪，葉祖光，曾星銚，周明高，譚曉文，范泰平，譚欣欣，盛益華

(1.吉首大學藥學院，湖南 吉首 416000；2.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700；3.湘西自治州民族中醫(yī)院，湖南 吉首 416000；4.吉首大學醫(yī)學院，湖南 吉首 416000)

目前瘧疾在全球尤其是一些不發(fā)達地區(qū)流行形勢依然十分嚴峻，急需研發(fā)抗瘧新藥和探索新的藥物治療方案.常山是我國中醫(yī)藥寶庫中經(jīng)典的抗瘧藥物，其抗瘧療效卓著.常山為虎耳草科植物黃常山(RadixDichroae)的干燥根[1].中醫(yī)認為，常山苦、辛、寒，歸肝、脾、心經(jīng)，常用于寒熱往來、日瘧、間日瘧、新久瘧疾、老痰積飲等癥[2].現(xiàn)代研究證實，常山具有抗阿米巴原蟲、抗鉤端螺旋體、抗病毒、抗腫瘤、抗心律失常、降壓、催吐以及興奮子宮平滑肌等作用，臨床上主要用于治療瘧疾、雞球蟲、藍氏賈第鞭毛蟲病等疾病.常山是中醫(yī)重要的抗瘧中藥之一，在明、清以前大多數(shù)中藥抗瘧方劑均以常山為主藥，但由于常山具有強烈的致嘔吐副作用，在明、清時期，人們建立了以小柴胡湯為主的“和法”來治療瘧疾，以期代替以常山為主的“峻烈”的抗瘧中藥方劑.雖然小柴胡湯減少了毒副作用，但其抗瘧療效明顯不如常山.現(xiàn)代化學研究表明，常山具有良好的抗瘧疾活性[3]，其主要的活性成分是常山堿和異常山堿，其中常山堿的活性比奎寧高100倍.Kobayashi等研究發(fā)現(xiàn)常山堿、異常山堿抗惡性瘧原蟲的EC50值分別為2.0×10-7，1.6×10-7mol/L；抗瘧原蟲的EC50分別為7.6×10-11，2.9×10-10mol/L.常山堿、異常山堿及衍生物體外抗兩種惡性瘧原蟲活性(FCR-3和K1)均比對照藥品氯喹和青蒿素好，其中常山堿的EC50分別為7.0×10-10(FCR-3)，1.2×10-9(K1)mol/L，異常山堿的EC50值分別為3.4×10-9(FCR-3)，1.8×10-9(K1)mol/L，而氯喹的EC50分別為1.8×10-9(FCR-3)，1.3×10-7(K1)mol/L[4-5].常山抗瘧療效顯著，但具有強烈的致嘔吐副作用[6]，在《中華人民共和國藥典》(2005年版一部)中被列為有毒藥材.目前有關常山致嘔吐毒性機制研究較為匱乏，這限制了常山藥物的發(fā)展.

因此有必要利用能快速評價并篩選常山減毒增效目的藥物品種及劑量的斑馬魚作為模式動物，本研究通過系統(tǒng)分析常山主要活性成分對消化道的毒性作用，明確常山主要活性成分的毒性劑量特點、消化道蠕動影響、消化道毒性表型以及組織病理特征，為常山消化道毒性方面的探索提供新的可靠的模式動物、藥物篩選及機制研究的思路，以期克服其毒副作用.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

以自然成對交配方式繁殖的AB系斑馬魚共660尾，其中180尾用于10%致死濃度(LC10)和最大非致死濃度(MNLC)測定實驗，180尾用于腸蠕動抑制作用評價實驗，150尾用于腸道毒性表型觀察實驗，150尾用于腸道病理組織學檢查實驗.每個實驗每個濃度組為30尾，年齡為受精后5天(5 dpf).AB系斑馬魚飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中(水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為480～510 μS/cm，pH值為6.9～7.2，硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3).實驗動物使用許可證號為：SYXK(浙)2012-0171.飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認證的要求.

1.2 實驗藥物

常山堿鹽，白色粉末，純度為98%，由中國中醫(yī)科學院中藥研究所提供，置于4 ℃干燥器內(nèi)保存.使用時現(xiàn)配現(xiàn)用，溶劑為超純水.

1.3 儀器與試劑

解剖顯微鏡(Szx7,Olympus,Japan)；與顯微鏡相連的相機(TK-C1481EC)；精密電子天平(CP214,Ohaus,America)；六孔板(Nest Biotech,Shanghai,China)；甲基纖維素(Aladdin,Shanghai,China).

1.4 實驗分組

(1)LC10和MNLC測定實驗

實驗1組：正常對照組

實驗2組：常山堿鹽2.5 mg/L

實驗3組：常山堿鹽5 mg/L

實驗4組：常山堿鹽10 mg/L

實驗5組：常山堿鹽20 mg/L

實驗6組：常山堿鹽40 mg/L

(2)腸蠕動抑制作用評價實驗

實驗1組：正常對照組

實驗2組：模型對照組

實驗3組：常山堿鹽0.5 mg/L(1/10 MNLC)

實驗4組：常山堿鹽1.67 mg/L(1/3 MNLC)

實驗5組：常山堿鹽5 mg/L(MNLC)

實驗6組：常山堿鹽10 mg/L(LC10)

(3)腸道毒性表型觀察實驗

實驗1組：正常對照組

實驗2組：常山堿鹽0.5 mg/L(1/10 MNLC)

實驗3組：常山堿鹽1.67 mg/L(1/3 MNLC)

實驗4組：常山堿鹽5 mg/L(MNLC)

實驗5組：常山堿鹽10 mg/L(LC10)

(4)腸道組織病理學檢查實驗

實驗1組：正常對照組

實驗2組：常山堿鹽0.5 mg/L(1/10 MNLC)

實驗3組：常山堿鹽1.67 mg/L(1/3 MNLC)

實驗4組：常山堿鹽5 mg/L(MNLC)

實驗5組：常山堿鹽10 mg/L(LC10)

1.5 實驗指標檢測

1.5.1 常山堿鹽對斑馬魚的LC10和MNLC測定 隨機選取5 dpf正常野生型AB品系斑馬魚180尾于六孔板中，每孔30尾，分別水溶給予不同質(zhì)量濃度的常山堿鹽：2.5，5，10，20，40 mg/L，每孔藥液容量為3 mL，同時設置正常對照組(養(yǎng)魚用水處理組).用常山堿鹽處理斑馬魚24 h至6 dpf，統(tǒng)計各實驗組斑馬魚累計死亡數(shù)量，使用Origin統(tǒng)計學分析軟件，繪制最佳的“死亡率-濃度”效應曲線，得出常山堿鹽對斑馬魚的LC10(10%致死濃度)和MNLC(最大非致死濃度).

1.5.2 常山堿鹽對斑馬魚腸蠕動抑制作用評價 對5 dpf正常野生型AB品系斑馬魚喂飼2%蛋黃粉3 h，建立斑馬魚腸蠕動抑制作用評價模型.隨機選取180尾模型斑馬魚于六孔板中，每孔30尾，分別水溶給予不同質(zhì)量濃度的常山堿鹽：1/10 MNLC(0.5 mg/L)、1/3 MNLC(1.67 mg/L)、MNLC(5 mg/L)和LC10(10 mg/L)，每孔藥液容量為3 mL，同時設置模型對照組和正常對照組(未喂食正常斑馬魚).常山堿鹽處理斑馬魚18 h后，將各實驗組斑馬魚進行整體染色和脫色，每組隨機選取15尾斑馬魚在顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，分析統(tǒng)計斑馬魚腸道染色強度平均值(M)，定量評價常山堿鹽對斑馬魚腸蠕動的抑制作用，計算公式為：腸蠕動抑制率(%)=(M(藥物處理組)-M(模型對照組))/(M(模型對照組)-M(正常對照組))×100%.統(tǒng)計學分析采用方差分析和Dunnett’s T-檢驗，P<0.05表明數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學意義.

1.5.3 常山堿鹽對斑馬魚腸道毒性表型評價和組織病理學檢查 隨機選取150尾5 dpf正常野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔30尾，分別水溶給予不同質(zhì)量濃度的常山堿鹽：1/10 MNLC(0.5 mg/L)、1/3 MNLC(1.67 mg/L)、MNLC(5 mg/L)和 LC10(10 mg/L)，每孔藥液容量為3 mL，同時設置正常對照組；實驗設置兩個平行，分別為平行1和平行2.在平行1實驗中，用常山堿鹽處理斑馬魚24 h至6 dpf，在顯微鏡下觀察每個實驗組斑馬魚腸道有無異常，包括腸腔大小、腸腔顏色、腸道褶皺數(shù)量，并統(tǒng)計各指標發(fā)生率；在平行2實驗中，用常山堿鹽處理斑馬魚24 h至6 dpf，將每個實驗組斑馬魚用4%多聚甲醛固定，固定后將斑馬魚轉移到體積分數(shù)70%乙醇中，切片、HE染色，進行腸道組織病理學檢查.

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MNLC和LC10測定結果

如表1所示，常山堿鹽對斑馬魚的MNLC和LC10約為5 mg/L和10 mg/L.

表1 常山堿鹽處理斑馬魚后死亡率

2.2 腸蠕動抑制作用

模型對照組腸道染色強度(0.85)與正常對照組(0.55)比較，P<0.001，提示模型構建成功.用0.5，1.67，5，10 mg/L質(zhì)量濃度常山堿鹽處理斑馬魚后，可見斑馬魚腸道內(nèi)容物含量明顯增加，其腸道染色強度M分別為0.93，1.03，1.08，1.09，腸蠕動抑制率分別為27.78%，61.11%，77.11%，80.89%；常山堿鹽實驗組與模型對照組比較，P<0.001，常山堿鹽各質(zhì)量濃度對斑馬魚腸蠕動均有較明顯的抑制作用.詳見表2和圖1.

圖1 常山堿鹽對斑馬魚腸蠕動的抑制作用Fig. 1 Inhibition of Intestinal Peristalsis by Dichroa Alkali Salt in Zebrafish

表2 常山堿鹽對斑馬魚腸道蠕動和抑制作用評價(n=15)

2.3 腸道毒性表型觀察和腸道病理組織學分析

2.3.1 腸道毒性表型觀察 在0.5，1.67，5，10 mg/L質(zhì)量濃度常山堿鹽處理條件下，斑馬魚腸道褶皺減少或消失，腸道黏膜細胞變性，腸腔模糊，腸腔變窄，且嚴重程度和發(fā)生率呈較明顯的濃度正相關性.其中0.5 mg/L質(zhì)量濃度常山堿鹽實驗組有3.3%(1尾)斑馬魚腸腔變黑，其他指標未見顯著異常；1.67 mg/L質(zhì)量濃度常山堿鹽實驗組有26.7%斑馬魚腸道變黑，其他指標未見明顯異常；5和10 mg/L質(zhì)量濃度常山堿鹽實驗組斑馬魚腸道出現(xiàn)褶皺減少或消失，腸道黏膜細胞變性、腸腔模糊，腸腔變窄等異常變化.5 mg/L質(zhì)量濃度實驗組斑馬魚腸腔變黑、腸腔變窄和腸褶皺異常發(fā)生率分別為63.3%，73.3%，73.3%；10 mg/L質(zhì)量濃度實驗組斑馬魚腸腔變黑、腸腔變窄和腸褶皺異常發(fā)生率分別為85.2%，92.6%，96.3%；而正常對照組斑馬魚腸腔正常，可見淡黃色膽汁，腸道褶皺清晰(圖2、圖3和表3).

圖2 常山堿鹽誘發(fā)斑馬魚腸道毒性表型Fig. 2 Typical Figures of Phenotype with Intestinal Toxicity Induced by Dichroa Alkali Salt in Zebrafish

圖3 常山堿鹽誘發(fā)斑馬魚腸道毒性表型局部放大Fig. 3 Typical Enlarged Figures of Phenotype with Intestinal Toxicity Induced by Dichroa Alkali Salt in Zebrafish

表3 斑馬魚常山堿鹽腸道毒性表型觀察指標發(fā)生率(n=30)

2.3.2 腸道病理組織學觀察 在0.5，1.67，5，10 mg/L質(zhì)量濃度常山堿鹽處理條件下，斑馬魚出現(xiàn)腸道黏膜破壞(壞死、脫落)，腸腔消失等現(xiàn)象，嚴重程度呈現(xiàn)出較明顯的濃度正相關性.其中0.5，1.67 mg/L質(zhì)量濃度實驗組斑馬魚腸道組織結構未見顯著異常；5 mg/L質(zhì)量濃度實驗組斑馬魚腸道褶皺減少，腸黏膜水腫；10 mg/L質(zhì)量濃度實驗組斑馬魚腸道黏膜破壞(壞死、脫落)，腸腔消失；而正常對照組斑馬魚腸道結構清晰(圖4、圖5).

圖4 斑馬魚常山堿鹽腸道毒性病理切片(10×10倍)Fig.4 Pathological Sections of Intestinal Toxicity of Zebrafish Treated with Different Concentrations of Dichroa Alkali Salt (10×10 times)

圖5 斑馬魚常山堿鹽腸道毒性病理切片(10×40倍)Fig. 5 Pathological Sections of Intestinal Toxicity of Zebrafish Treated with Different Concentrations of Dichroa Alkali Salt (10×40 times)

3 討論

中藥常山是傳統(tǒng)中醫(yī)臨床治療瘧疾的首選藥物，但在發(fā)揮顯著的藥效的同時又常常伴隨著毒性[7].雖然常山抗瘧作用較好，但是其嚴重的消化系統(tǒng)毒性，尤其是嘔吐的毒性作用，使得其在用于臨床治療疾病時安全窗口窄，最終無法對其進行進一步開發(fā)利用并成藥，其中缺乏用于毒性評價及毒性拮抗藥物篩選的可靠模式動物是該藥物毒性難以準確評估的主要原因.以往常山毒性評價的常用實驗動物為大小鼠，屬于嚙齒類動物，沒有嘔吐反射，不能用于惡心嘔吐的實驗研究，因此將大小鼠用于常山胃腸毒性評價并不十分準確可靠.后來人們改用了鴿子嘔吐模型，但近年來由于禽流感的發(fā)生，實驗動物鴿子也不能穩(wěn)定供應[8].二十世紀末期以來，斑馬魚作為一種新穎的脊椎類模式動物快速進入了新藥篩選、新藥研發(fā)領域，并已在歐美國家得到越來越廣泛的應用[9].2009年，歐洲一家斑馬魚技術服務公司獲得了FDA以及EMA的GLP認證，標志著斑馬魚新藥篩選與評價技術已得到國際上權威部門的認可.OECD也已經(jīng)制訂了多個用斑馬魚評價化學品安全性的指導原則.中國也將斑馬魚技術列入“重大新藥創(chuàng)制”專項中的關鍵技術開發(fā)項目[10].目前，輝瑞、諾華、默克、羅氏、葛蘭素史克、阿斯利康等跨國醫(yī)藥巨頭都已經(jīng)在使用斑馬魚新藥篩選技術進行藥物開發(fā).與傳統(tǒng)的體外實驗方案和哺乳動物模型相比，斑馬魚藥物篩選平臺具有可靠、快速、高效、低廉等優(yōu)點，能夠縮短新藥研發(fā)周期、降低新藥研發(fā)成本、鑒別新藥的毒性、提高新藥研發(fā)成功率[11].本研究應用斑馬魚作為模式動物對常山堿鹽毒性進行評價研究，測得常山堿鹽對斑馬魚的LC10和MNLC約為10 mg/L和5 mg/L，并進行了腸蠕動抑制評價、腸道表型和腸道病理組織學觀察.在0.5，1.67，5，10 mg/L質(zhì)量濃度常山堿鹽處理條件下，斑馬魚腸道內(nèi)容物含量明顯增加，腸蠕動抑制率分別為27.78%，61.11%，77.11%，80.89%；腸道毒性表型和病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)，在0.5，1.67，5，10 mg/L質(zhì)量濃度常山堿鹽處理條件下，斑馬魚腸道褶皺減少或消失，腸道黏膜細胞變性，腸道黏膜破壞，腸腔模糊，腸腔變窄，且嚴重程度和發(fā)生率呈較明顯的濃度正相關性.綜上，常山堿鹽存在明確的胃腸道毒性，斑馬魚可作為模式動物應用于消化道毒性藥物的致毒作用研究，本研究結果為后期探究常山堿鹽等消化道致毒的關鍵分子機制提供了重要的技術保障.