馮必鈞
(吉首大學(xué)藥學(xué)院,湖南 吉首 416000)
新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)是一種由嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)引發(fā)的傳染病,具有傳播速度快、感染性強(qiáng)、致死人數(shù)多等特點(diǎn).COVID-19是單鏈的RNA beta冠狀病毒,其基因組編碼為結(jié)構(gòu)蛋白,非結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白[1].COVID-19的癥狀多種多樣,通常包括發(fā)燒,咳嗽,疲勞,呼吸困難以及嗅覺或味覺喪失,大多數(shù)患者(81%)感染后會(huì)出現(xiàn)輕至中度癥狀(輕度肺炎),14%患者出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀(如呼吸困難,缺氧或影像學(xué)上肺部受累超過50%),5%患者出現(xiàn)更為嚴(yán)重的癥狀(如呼吸衰竭,休克或多器官功能障礙)[2].目前,國內(nèi)外學(xué)者還未發(fā)現(xiàn)針對(duì)COVID-19的特異性治愈方法[3].傳統(tǒng)中藥(Traditional Chinese Medicine,TCM)的臨床驗(yàn)證表現(xiàn)良好,是許多嚴(yán)重疾病(如嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS))的補(bǔ)充治療方法[4].許多臨床實(shí)踐結(jié)果表明,中藥在COVID-19的治療中也起著重要作用[5].連花清瘟膠囊,金花清感顆粒,血必凈注射液,清肺排毒湯,化濕敗毒方,宣肺敗毒方,簡(jiǎn)稱“三藥三方”,均被證實(shí)對(duì)COVID-19治療有效[6].研究表明,金花清感顆??捎行Эs短COVID-19患者的核酸檢出時(shí)間,促進(jìn)肺炎性滲出物的吸收[7].有學(xué)者研究了使用連花清瘟膠囊治療COVID-19的安全性和有效性,他們發(fā)現(xiàn)連花清瘟膠囊能夠改善COVID-19的臨床癥狀[8].此外,有研究證實(shí)了,血必凈注射液可有效改善重癥COVID-19患者的炎癥指標(biāo)[9].清肺排毒湯是張仲景研制的中藥復(fù)方,具有抗病毒,抗炎,免疫調(diào)節(jié)和退燒等多種藥效功能,臨床證明清肺排毒湯對(duì)COVID-19有良好的治療作用.黃連(Coptischinensis)是一種在中國被廣泛用于治療腸胃炎的草藥,最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中便有記載,書中記載的黃連主要用于治療寒熱互結(jié),濕熱中陰,痞滿嘔吐等癥.2019年COVID-19爆發(fā)時(shí),網(wǎng)傳雙黃連口服液可以治療COVID-19,但沒有確切的證據(jù).中藥黃連的成分較為復(fù)雜,因此在發(fā)揮藥效的過程中往往有多種成分共同參與其中.目前,沒有單獨(dú)用黃連治療COVID-19的相關(guān)報(bào)道,也沒有學(xué)者研究黃連治療COVID-19的作用機(jī)理,因而探尋一種全面綜合分析和解釋黃連治療COVID-19機(jī)理的方法具有重要意義.
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是利用系統(tǒng)生物學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù),構(gòu)建“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò),分析藥物活性成分及靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)模塊中的相互作用,了解相關(guān)通路網(wǎng)絡(luò)存在的潛在機(jī)制,解釋藥物作用于人體的奧秘.分子對(duì)接能夠預(yù)測(cè)小分子配體與適當(dāng)目標(biāo)靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合構(gòu)象,其結(jié)合行為的表征在藥物的合理設(shè)計(jì)以及闡明基本的生化過程中起著重要作用[11-12].基于此,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法,篩選出中藥黃連的成分,探究其治療COVID-19的潛在作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制,以期為臨床上使用中藥黃連治療或輔助治療COVID-19提供理論依據(jù).
中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)(TCMSP)(https:∥tcmspw.com/tcmsp.php),Uniprot數(shù)據(jù)庫(https:∥www.uniprot.org/),GeneCards(https:∥www.genecards.org/),OMIM(https:∥www.omim.org/),功能蛋白聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)(STRING)數(shù)據(jù)庫(https:∥string-db.org/),R語言軟件Rx64.4.0.3(https:∥www.r-project.org/),R語言部分插件來源于Bioconductor(https:∥www.bioconductor.org/).
利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái),結(jié)合中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)檢索中藥黃連的所有活性成分.根據(jù)研究結(jié)果,以口服生物利用度(oralbioavailability,OB)不小于30%,類藥性(drug likeness,DL)不小于0.18作為藥物化學(xué)成分的篩選條件,得到黃連的生物活性成分.用Uniprot將黃連(TCMSP數(shù)據(jù)庫中收錄)有效活性成分的靶點(diǎn)“蛋白名”統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為“基因名”.
將“COVID-19”作為檢索詞,在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索,限定物種為“人類(Homo sapiens)”,獲得疾病的相關(guān)靶點(diǎn).
使用R語言軟件取黃連活性成分作用靶點(diǎn)和COVID-19疾病靶點(diǎn)的交集,獲得藥物與疾病的共同靶點(diǎn),并繪制韋恩圖.
利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物—活性成分—靶點(diǎn)—疾病”互作網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)圖中以“節(jié)點(diǎn)(node)”代表藥物、活性成分、疾病和靶點(diǎn),“邊(edge)”代表以上節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系.使用的R包通過R和Bioconductor網(wǎng)站下載.
將藥物與疾病的共同靶點(diǎn)上傳至STRING11.0數(shù)據(jù)庫中,選取Multiple protein,選擇研究物種為“Homo sapiens”,構(gòu)建共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)中“node”代表不同靶點(diǎn),“edge”代表不同靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系.所用R包通過R和Bioconductor網(wǎng)站下載.
通過R語言的“clusterProfiler”包對(duì)藥物與疾病的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析,即對(duì)黃連作用于COVID-19的靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析,結(jié)果以條形圖呈現(xiàn).此外,應(yīng)用R語言軟件對(duì)以上共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,定義P<0.05,Q<0.05.同時(shí)根據(jù)富集因子值進(jìn)一步分析核心通路的富集程度,以探究中藥黃連治療COVID-19的潛在作用機(jī)制.
從黃連的有效成分中選取標(biāo)志性成分與其治療COVID-19的主要靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,從RCSB數(shù)據(jù)庫(https:∥www.rcsb.org/)下載相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu),使用Pymol軟件去除其溶劑分子與配體,從pubchem數(shù)據(jù)庫(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載配體化合物結(jié)構(gòu),使用Auto Dockvina進(jìn)行分子對(duì)接.
從TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索黃連的活性成分以及相關(guān)靶點(diǎn),以O(shè)B不小于30%和DL不小于0.18作為篩選條件,篩選出黃連的活性化合物14個(gè),見表1.TCMSP數(shù)據(jù)庫收錄了黃連的成分作用靶點(diǎn)共596個(gè).利用Uniprot將靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的基因名,剔除重復(fù)非人源以及無標(biāo)準(zhǔn)基因名的靶點(diǎn),最終獲得黃連有效活性成分作用靶點(diǎn)235個(gè).
表1 黃連的活性成分
通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到與COVID-19相關(guān)的基因共341個(gè),其中GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索到COVID-19靶點(diǎn)基因339個(gè),OMIN數(shù)據(jù)庫搜索到COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)基因2個(gè).
使用R軟件獲取中藥黃連的潛在作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)之間的交集基因,得到8個(gè)藥物與疾病的互作基因(圖1),分別是EGFR,VEGFA,IL10,IL6,POR,HMOX1,PLAT,CRP.將8個(gè)互作基因定義為黃連治療COVID-19的“關(guān)鍵靶點(diǎn)”.
圖1 藥物與疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn Diagram of Drugs and Disease Targets
將獲得的黃連治療COVID-19的8個(gè)“關(guān)鍵靶點(diǎn)”以及藥物的活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中,構(gòu)建“藥物—活性成分—靶點(diǎn)—疾病”互作網(wǎng)絡(luò),見圖2.在網(wǎng)絡(luò)圖中,六邊形代表藥物黃連,三角形代表黃連所含的活性成分,菱形代表疾病COVID-19,橢圓形代表藥物活性成分所作用的靶點(diǎn)映射到疾病的靶點(diǎn),圖2中共包含節(jié)點(diǎn)11個(gè),其中代表黃連活性成分的節(jié)點(diǎn)1個(gè),代表作用靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)10個(gè),節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連線(17條邊)代表“藥物—活性成分—疾病—靶點(diǎn)”的作用關(guān)系.網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果表明,黃連有效成分中的槲皮素是該網(wǎng)絡(luò)中自由度最高的成分,是治療COVID-19的主要活性成分.
圖2 “藥物—活性成分—疾病—靶點(diǎn)”互作網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 "Drug-Active Ingredient-Disease-Target" Interaction Network
在STRING數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入藥物黃連作用于疾病的8個(gè)靶點(diǎn)基因,獲取蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,如圖3所示.圖中含有8個(gè)節(jié)點(diǎn)和17條互作邊,平均節(jié)點(diǎn)4.25,其中邊代表作用靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián),節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn).在該網(wǎng)絡(luò)中,圓形節(jié)點(diǎn)表示藥物和疾病相互作用的靶點(diǎn),每條邊代表靶點(diǎn)之間的靶向相互作用關(guān)系.在該網(wǎng)絡(luò)中起主導(dǎo)作用的核心基因是VEGFA,IL6,POR,PLAT,它們位于PPI網(wǎng)絡(luò)的中心位置.說明中藥黃連活性成分槲皮素與它們有較高的結(jié)合活性,可作為黃連治療COVID-19的潛在靶點(diǎn).
圖3 黃連治療COVID-19關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 PPI Network Diagram of the Key Targets of Coptis chinensis Treatment of COVID-19
使用R軟件對(duì)黃連作用于COVID-19的靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析.GO富集分析發(fā)現(xiàn),有22個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的生物過程,通過對(duì)8個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行功能富集,以GO功能為縱坐標(biāo),以在GO上富集的基因數(shù)為橫坐標(biāo),以矯正P值(紅色的深淺)為標(biāo)值,對(duì)前20個(gè)GO基因富集做GO功能富集條形圖,見圖4.由圖4可知,基因主要在生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體激活劑、氧化還原酶活性(作用于成對(duì)供體,結(jié)合或還原分子氧)等功能上富集,在這些功能上富集的基因主要有VEGFA,IL6,POR,PLAT.結(jié)果表明,黃連可能主要通過VEGFA,IL6,POR,PLAT等基因調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等功能進(jìn)而達(dá)到治療COVID-19的目的.
圖4 黃連治療COVID-19的主要生物學(xué)過程(前20個(gè))Fig. 4 Main Biological Process of Coptis chinensis Treatment of COVID-19 (Top 20)
KEGG通路富集分析得到34條信號(hào)通路(P<0.05),排除廣泛通路后,表2中列出了排名前20的信號(hào)通路.由表2可知,共同靶點(diǎn)主要富集于HIF-1信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、FoxO信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、JAK-STAT信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等相關(guān)信號(hào)通路上.基因在HIF-1信號(hào)通路中富集圖見圖5(圖中紅色框內(nèi)的基因表示在本通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的藥物與疾病互作基因),此通路調(diào)節(jié)與血管生成有關(guān)的VEGF的表達(dá),調(diào)節(jié)與血管張力有關(guān)的HMOC1的表達(dá).基因在EGFR信號(hào)通路中的富集圖見圖6(圖中紅色框內(nèi)的基因表示在本通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的藥物與疾病互作基因),此通路調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子IL6的表達(dá),表皮生長(zhǎng)因子EGFR的表達(dá),調(diào)節(jié)表皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化,細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、生存和血管的生成.基因在JAK-STAT信號(hào)通路中的富集圖見圖7(圖中紅色框內(nèi)的基因表示在本通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的藥物與疾病互作基因),此通路促進(jìn)細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、生存和細(xì)胞周期.基因在FoxO信號(hào)通路中的富集圖見圖10(圖中紅色框內(nèi)的基因表示在本通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的藥物與疾病互作基因),此通路促進(jìn)炎性因子IL-6,IL-10和表皮生長(zhǎng)因子EGFR的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,細(xì)胞的凋亡、自噬、氧化應(yīng)激及DNA的修復(fù)和代謝,以此達(dá)到治療COVID-19的目的.
表2 靶點(diǎn)通路富集結(jié)果(前20個(gè))
圖5 基因在HIF-1信號(hào)通路中富集圖Fig. 5 Gene Enrichment Map in the HIF-1 Signaling Pathway
圖6 基因在EGFR信號(hào)通路中的富集圖Fig. 6 Enrichment Map of Genes in the EGFR Signaling Pathway
圖7 基因在JAK-STAT信號(hào)通路中的富集圖Fig. 7 Enrichment Map of Genes in JAK-STAT Signaling Pathway
圖8 基因在FoxO信號(hào)通路中的富集圖Fig. 8 Gene Enrichment Map in FoxO Signaling Pathway
用黃連活性成分榭皮素分別與其治療COVID-19的主要靶點(diǎn)VEGFA,IL6,POR,PLAT對(duì)接,最佳結(jié)果如表3所示.結(jié)果表明:榭皮素與PLAT不能形成氫鍵,但能與IL6,POR和VEGFA形成氫鍵,榭皮素和VEGFA,IL6,POR,PLAT的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol,因此,它們可能在黃連治療COVID-19中起主要作用.
表3 黃連活性成分與其治療COVID-19的主要靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接結(jié)果
本研究通過對(duì)黃連有效活性成分的挖掘,發(fā)現(xiàn)黃連中主要活性成分榭皮素為“藥物—成分—疾病—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn),是該網(wǎng)絡(luò)中自由度最高的成分.據(jù)報(bào)道,榭皮素是一種多酚類化合物,其生理作用包括抗氧化,抗炎,抗病原和免疫調(diào)節(jié).動(dòng)物和體外研究表明,榭皮素對(duì)免疫活性有影響,包括嗜中性粒細(xì)胞趨化性增強(qiáng),巨噬細(xì)胞吞噬作用,NK細(xì)胞裂解活性和促有絲分裂原刺激的淋巴細(xì)胞增殖.榭皮素可調(diào)節(jié)與細(xì)胞因子產(chǎn)生有關(guān)的某些基因的表達(dá)[14].榭皮素具有抗病毒和抗菌特性,包括抑制甲型流感病毒H1N1,H3N2和抑制H5N1的侵入[16],這提示榭皮素在治療COVID-19中可能發(fā)揮著重要作用.
PPI網(wǎng)絡(luò)顯示,VEGFA,IL6,POR,PLAT位于PPI網(wǎng)絡(luò)的中心位置.說明中藥黃連活性成分與它們有較高的結(jié)合活性,這些靶點(diǎn)可作為黃連治療COVID-19的潛在靶點(diǎn).IL-6是白介素超家族的主要成員[17],既可作為促炎性細(xì)胞因子,又可作為抗炎性肌因子[18].成骨細(xì)胞分泌IL-6以刺激破骨細(xì)胞形成.許多血管的中膜介質(zhì)中的平滑肌細(xì)胞也產(chǎn)生IL-6作為促炎性細(xì)胞因子.IL-6作為抗炎性肌動(dòng)蛋白的作用是通過其對(duì)TNF-α和IL-1的抑制作用以及IL-1ra和IL-10的激活而介導(dǎo)的.IL-6可以用作嚴(yán)重COVID-19感染的炎性標(biāo)志物[18].IL-6作為肌肉因子具有廣泛的抗炎功能[19].RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶是一種酶,在人中編碼AKT1基因.該酶屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的AKT亞家族[20].VEGF是急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征的關(guān)鍵因素,缺氧和嚴(yán)重炎癥會(huì)增加VEGF的水平,在COVID-19患者中顯著升高.VEGF的低氧上調(diào)通常通過ACE2的上調(diào)來抵抗[21].
通過對(duì)黃連有效成分作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)過程富集分析,基因主要在生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體激活劑、氧化還原酶活性(作用于成對(duì)供體,結(jié)合或還原分子氧)等功能上富集,顯示黃連可能通過VEGFA,IL6,POR,PLAT等基因調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等功能,進(jìn)而治療COVID-19.在KEGG富集分析中,證實(shí)黃連對(duì)HIF-1信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路具有調(diào)控作用.基因通過HIF-1信號(hào)通路,調(diào)節(jié)與血管生成有關(guān)的VEGF的表達(dá),調(diào)節(jié)與血管張力有關(guān)的HMOC1的表達(dá);通過EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥信號(hào)通路,調(diào)節(jié)表皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化,細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、生存和血管的生成;通過JAK-STAT信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、生存和細(xì)胞周期;通過FoxO信號(hào)通路,促進(jìn)炎性因子IL-6、IL-10和表皮生長(zhǎng)因子EGFR的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,細(xì)胞的凋亡、自噬、氧化應(yīng)激及DNA的修復(fù)和代謝,達(dá)到治療COVID-19的目的.
基因通過HIF-1信號(hào)通路治療COVID-19的可能機(jī)制是HIF-1α激活輕度缺氧條件下的信號(hào)通路,減少了ACE2和TMPRSS2的表達(dá),并增加了表面的ADAM17水平肺泡細(xì)胞,因此降低了SARSCoV-2的侵襲性.相反,HIF-1α的蛋白質(zhì)靶標(biāo)參與了嚴(yán)重的缺氧誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)激活,以及隨后的COVID-19炎癥過程和細(xì)胞因子風(fēng)暴期.此外,適量的間歇性缺氧可以減輕促炎過程[22].在哺乳動(dòng)物中,F(xiàn)OXO3a通過誘導(dǎo)DNA修復(fù)來調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的抵抗力,從而可能影響生物體的壽命[23].最近的研究表明,IL-6-JAK-STAT3軸與COVID-19發(fā)生的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[24].因此,對(duì)于COVID-19的治療可以選擇從黃連的有效成分入手,探究是否可以通過某些關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路發(fā)揮作用.
在此基礎(chǔ)上,本研究特別選用黃連的榭皮素分別與VEGFA,IL6,POR,PLAT對(duì)接.為了進(jìn)一步合理驗(yàn)證黃連治療COVID-19的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),在進(jìn)行分子對(duì)接時(shí),以結(jié)合能不超過-5.0 kJ/mol作為篩選標(biāo)準(zhǔn),榭皮素與VEGFA,IL6,POR,PLAT的對(duì)接結(jié)合能均符合篩選標(biāo)準(zhǔn),說明榭皮素可能直接作用于COVID-19的靶點(diǎn)從而治療COVID-19.
本研究黃連榭皮素與POR對(duì)接的結(jié)果與Derosa等[25]的發(fā)現(xiàn)基本一致,即榭皮素可抑制POR,榭皮素在理論上具有干擾SARS-CoV-2復(fù)制的能力.DI等[26]分子對(duì)接研究表明,槲皮素可抑制3CLpro,PLpro和S蛋白.最近有研究證實(shí),榭皮素是一種有效的3CLpro抑制劑.迄今為止,未見有榭皮素與PLAT,VEGFA,IL6分子對(duì)接的報(bào)道,本研究首次完成了榭皮素與PLAT,VEGFA,IL6的分子對(duì)接,對(duì)接結(jié)果顯示,榭皮素與PLAT,VEGFA,IL6均有較好的對(duì)接,其結(jié)合能均在-6.4 kcal/mol以下.本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究COVID-19的靶點(diǎn)PLAT,VEGFA,IL6提供了理論基礎(chǔ).