馮必鈞

(吉首大學(xué)藥學(xué)院，湖南 吉首 416000)

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是一種由嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)引發(fā)的傳染病，具有傳播速度快、感染性強、致死人數(shù)多等特點.COVID-19是單鏈的RNA beta冠狀病毒，其基因組編碼為結(jié)構(gòu)蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白[1].COVID-19的癥狀多種多樣，通常包括發(fā)燒，咳嗽，疲勞，呼吸困難以及嗅覺或味覺喪失，大多數(shù)患者(81%)感染后會出現(xiàn)輕至中度癥狀(輕度肺炎)，14%患者出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀(如呼吸困難，缺氧或影像學(xué)上肺部受累超過50%)，5%患者出現(xiàn)更為嚴(yán)重的癥狀(如呼吸衰竭，休克或多器官功能障礙)[2].目前，國內(nèi)外學(xué)者還未發(fā)現(xiàn)針對COVID-19的特異性治愈方法[3].傳統(tǒng)中藥(Traditional Chinese Medicine，TCM)的臨床驗證表現(xiàn)良好，是許多嚴(yán)重疾病(如嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS))的補充治療方法[4].許多臨床實踐結(jié)果表明，中藥在COVID-19的治療中也起著重要作用[5].連花清瘟膠囊，金花清感顆粒，血必凈注射液，清肺排毒湯，化濕敗毒方，宣肺敗毒方，簡稱“三藥三方”，均被證實對COVID-19治療有效[6].研究表明，金花清感顆?？捎行Эs短COVID-19患者的核酸檢出時間，促進(jìn)肺炎性滲出物的吸收[7].有學(xué)者研究了使用連花清瘟膠囊治療COVID-19的安全性和有效性，他們發(fā)現(xiàn)連花清瘟膠囊能夠改善COVID-19的臨床癥狀[8].此外，有研究證實了，血必凈注射液可有效改善重癥COVID-19患者的炎癥指標(biāo)[9].清肺排毒湯是張仲景研制的中藥復(fù)方，具有抗病毒，抗炎，免疫調(diào)節(jié)和退燒等多種藥效功能，臨床證明清肺排毒湯對COVID-19有良好的治療作用.黃連(Coptischinensis)是一種在中國被廣泛用于治療腸胃炎的草藥，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中便有記載，書中記載的黃連主要用于治療寒熱互結(jié)，濕熱中陰，痞滿嘔吐等癥.2019年COVID-19爆發(fā)時，網(wǎng)傳雙黃連口服液可以治療COVID-19，但沒有確切的證據(jù).中藥黃連的成分較為復(fù)雜，因此在發(fā)揮藥效的過程中往往有多種成分共同參與其中.目前，沒有單獨用黃連治療COVID-19的相關(guān)報道，也沒有學(xué)者研究黃連治療COVID-19的作用機理，因而探尋一種全面綜合分析和解釋黃連治療COVID-19機理的方法具有重要意義.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是利用系統(tǒng)生物學(xué)和計算機技術(shù)，構(gòu)建“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析藥物活性成分及靶點在網(wǎng)絡(luò)模塊中的相互作用，了解相關(guān)通路網(wǎng)絡(luò)存在的潛在機制，解釋藥物作用于人體的奧秘.分子對接能夠預(yù)測小分子配體與適當(dāng)目標(biāo)靶標(biāo)結(jié)合位點的結(jié)合構(gòu)象，其結(jié)合行為的表征在藥物的合理設(shè)計以及闡明基本的生化過程中起著重要作用[11-12].基于此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，篩選出中藥黃連的成分，探究其治療COVID-19的潛在作用靶點及作用機制，以期為臨床上使用中藥黃連治療或輔助治療COVID-19提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(TCMSP)(https:∥tcmspw.com/tcmsp.php)，Uniprot數(shù)據(jù)庫(https:∥www.uniprot.org/)，GeneCards(https:∥www.genecards.org/)，OMIM(https:∥www.omim.org/)，功能蛋白聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)(STRING)數(shù)據(jù)庫(https:∥string-db.org/)，R語言軟件Rx64.4.0.3(https:∥www.r-project.org/)，R語言部分插件來源于Bioconductor(https:∥www.bioconductor.org/).

1.2 中藥黃連的活性成分和作用靶點

利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺，結(jié)合中藥整合藥理學(xué)平臺檢索中藥黃連的所有活性成分.根據(jù)研究結(jié)果，以口服生物利用度(oralbioavailability，OB)不小于30%，類藥性(drug likeness，DL)不小于0.18作為藥物化學(xué)成分的篩選條件，得到黃連的生物活性成分.用Uniprot將黃連(TCMSP數(shù)據(jù)庫中收錄)有效活性成分的靶點“蛋白名”統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為“基因名”.

1.3 COVID-19的疾病靶點

將“COVID-19”作為檢索詞，在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索，限定物種為“人類(Homo sapiens)”，獲得疾病的相關(guān)靶點.

1.4 藥物與疾病共同靶點的篩選

使用R語言軟件取黃連活性成分作用靶點和COVID-19疾病靶點的交集，獲得藥物與疾病的共同靶點，并繪制韋恩圖.

1.5 “藥物—活性成分—疾病—靶點”互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物—活性成分—靶點—疾病”互作網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)圖中以“節(jié)點(node)”代表藥物、活性成分、疾病和靶點，“邊(edge)”代表以上節(jié)點之間的相互關(guān)系.使用的R包通過R和Bioconductor網(wǎng)站下載.

1.6 藥物與疾病互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物與疾病的共同靶點上傳至STRING11.0數(shù)據(jù)庫中，選取Multiple protein，選擇研究物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中“node”代表不同靶點，“edge”代表不同靶點之間的相互關(guān)系.所用R包通過R和Bioconductor網(wǎng)站下載.

1.7 ClueGO生物功能分析和KEGG通路富集分析

通過R語言的“clusterProfiler”包對藥物與疾病的共同靶點進(jìn)行GO分析，即對黃連作用于COVID-19的靶點進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果以條形圖呈現(xiàn).此外，應(yīng)用R語言軟件對以上共同靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，定義P<0.05，Q<0.05.同時根據(jù)富集因子值進(jìn)一步分析核心通路的富集程度，以探究中藥黃連治療COVID-19的潛在作用機制.

1.8 分子對接

從黃連的有效成分中選取標(biāo)志性成分與其治療COVID-19的主要靶點進(jìn)行分子對接，從RCSB數(shù)據(jù)庫(https:∥www.rcsb.org/)下載相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)，使用Pymol軟件去除其溶劑分子與配體，從pubchem數(shù)據(jù)庫(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載配體化合物結(jié)構(gòu)，使用Auto Dockvina進(jìn)行分子對接.

2 結(jié)果

2.1 黃連活性成分及其相關(guān)靶點

從TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索黃連的活性成分以及相關(guān)靶點，以O(shè)B不小于30%和DL不小于0.18作為篩選條件，篩選出黃連的活性化合物14個，見表1.TCMSP數(shù)據(jù)庫收錄了黃連的成分作用靶點共596個.利用Uniprot將靶點名稱轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的基因名，剔除重復(fù)非人源以及無標(biāo)準(zhǔn)基因名的靶點，最終獲得黃連有效活性成分作用靶點235個.

表1 黃連的活性成分

2.2 COVID-19疾病相關(guān)基因

通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到與COVID-19相關(guān)的基因共341個，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索到COVID-19靶點基因339個，OMIN數(shù)據(jù)庫搜索到COVID-19相關(guān)靶點基因2個.

2.3 黃連作用于COVID-19的潛在靶點

使用R軟件獲取中藥黃連的潛在作用靶點與疾病靶點之間的交集基因，得到8個藥物與疾病的互作基因(圖1)，分別是EGFR，VEGFA，IL10，IL6，POR，HMOX1，PLAT，CRP.將8個互作基因定義為黃連治療COVID-19的“關(guān)鍵靶點”.

圖1 藥物與疾病靶點韋恩圖Fig.1 Venn Diagram of Drugs and Disease Targets

2.4 “藥物—活性成分—靶點—疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)

將獲得的黃連治療COVID-19的8個“關(guān)鍵靶點”以及藥物的活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建“藥物—活性成分—靶點—疾病”互作網(wǎng)絡(luò)，見圖2.在網(wǎng)絡(luò)圖中，六邊形代表藥物黃連，三角形代表黃連所含的活性成分，菱形代表疾病COVID-19，橢圓形代表藥物活性成分所作用的靶點映射到疾病的靶點，圖2中共包含節(jié)點11個，其中代表黃連活性成分的節(jié)點1個，代表作用靶點的節(jié)點10個，節(jié)點與節(jié)點之間的連線(17條邊)代表“藥物—活性成分—疾病—靶點”的作用關(guān)系.網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果表明，黃連有效成分中的槲皮素是該網(wǎng)絡(luò)中自由度最高的成分，是治療COVID-19的主要活性成分.

圖2 “藥物—活性成分—疾病—靶點”互作網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 "Drug-Active Ingredient-Disease-Target" Interaction Network

2.5 關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

在STRING數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入藥物黃連作用于疾病的8個靶點基因，獲取蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示.圖中含有8個節(jié)點和17條互作邊，平均節(jié)點4.25，其中邊代表作用靶點之間的關(guān)聯(lián)，節(jié)點代表作用靶點.在該網(wǎng)絡(luò)中，圓形節(jié)點表示藥物和疾病相互作用的靶點，每條邊代表靶點之間的靶向相互作用關(guān)系.在該網(wǎng)絡(luò)中起主導(dǎo)作用的核心基因是VEGFA，IL6，POR，PLAT，它們位于PPI網(wǎng)絡(luò)的中心位置.說明中藥黃連活性成分槲皮素與它們有較高的結(jié)合活性，可作為黃連治療COVID-19的潛在靶點.

圖3 黃連治療COVID-19關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 PPI Network Diagram of the Key Targets of Coptis chinensis Treatment of COVID-19

2.6 靶點的GO功能富集分析

使用R軟件對黃連作用于COVID-19的靶點進(jìn)行GO功能富集分析.GO富集分析發(fā)現(xiàn)，有22個具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)的生物過程，通過對8個交集靶點進(jìn)行功能富集，以GO功能為縱坐標(biāo)，以在GO上富集的基因數(shù)為橫坐標(biāo)，以矯正P值(紅色的深淺)為標(biāo)值，對前20個GO基因富集做GO功能富集條形圖，見圖4.由圖4可知，基因主要在生長因子受體結(jié)合、生長因子活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體激活劑、氧化還原酶活性(作用于成對供體，結(jié)合或還原分子氧)等功能上富集，在這些功能上富集的基因主要有VEGFA，IL6，POR，PLAT.結(jié)果表明，黃連可能主要通過VEGFA，IL6，POR，PLAT等基因調(diào)節(jié)生長因子受體結(jié)合、生長因子活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等功能進(jìn)而達(dá)到治療COVID-19的目的.

圖4 黃連治療COVID-19的主要生物學(xué)過程(前20個)Fig. 4 Main Biological Process of Coptis chinensis Treatment of COVID-19 (Top 20)

2.7 靶點的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析得到34條信號通路(P<0.05)，排除廣泛通路后，表2中列出了排名前20的信號通路.由表2可知，共同靶點主要富集于HIF-1信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、FoxO信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、JAK-STAT信號通路、PI3K-Akt信號通路等相關(guān)信號通路上.基因在HIF-1信號通路中富集圖見圖5(圖中紅色框內(nèi)的基因表示在本通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的藥物與疾病互作基因)，此通路調(diào)節(jié)與血管生成有關(guān)的VEGF的表達(dá)，調(diào)節(jié)與血管張力有關(guān)的HMOC1的表達(dá).基因在EGFR信號通路中的富集圖見圖6(圖中紅色框內(nèi)的基因表示在本通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的藥物與疾病互作基因)，此通路調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子IL6的表達(dá)，表皮生長因子EGFR的表達(dá)，調(diào)節(jié)表皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，細(xì)胞的生長、增殖、生存和血管的生成.基因在JAK-STAT信號通路中的富集圖見圖7(圖中紅色框內(nèi)的基因表示在本通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的藥物與疾病互作基因)，此通路促進(jìn)細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、生存和細(xì)胞周期.基因在FoxO信號通路中的富集圖見圖10(圖中紅色框內(nèi)的基因表示在本通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的藥物與疾病互作基因)，此通路促進(jìn)炎性因子IL-6，IL-10和表皮生長因子EGFR的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，細(xì)胞的凋亡、自噬、氧化應(yīng)激及DNA的修復(fù)和代謝，以此達(dá)到治療COVID-19的目的.

表2 靶點通路富集結(jié)果(前20個)

圖5 基因在HIF-1信號通路中富集圖Fig. 5 Gene Enrichment Map in the HIF-1 Signaling Pathway

圖6 基因在EGFR信號通路中的富集圖Fig. 6 Enrichment Map of Genes in the EGFR Signaling Pathway

圖7 基因在JAK-STAT信號通路中的富集圖Fig. 7 Enrichment Map of Genes in JAK-STAT Signaling Pathway

圖8 基因在FoxO信號通路中的富集圖Fig. 8 Gene Enrichment Map in FoxO Signaling Pathway

2.8 黃連活性成分與其治療COVID-19的主要靶點蛋白的分子對接結(jié)果

用黃連活性成分榭皮素分別與其治療COVID-19的主要靶點VEGFA，IL6，POR，PLAT對接，最佳結(jié)果如表3所示.結(jié)果表明：榭皮素與PLAT不能形成氫鍵，但能與IL6，POR和VEGFA形成氫鍵，榭皮素和VEGFA，IL6，POR，PLAT的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，因此，它們可能在黃連治療COVID-19中起主要作用.

表3 黃連活性成分與其治療COVID-19的主要靶點蛋白的分子對接結(jié)果

3 討論

本研究通過對黃連有效活性成分的挖掘，發(fā)現(xiàn)黃連中主要活性成分榭皮素為“藥物—成分—疾病—靶點”網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點，是該網(wǎng)絡(luò)中自由度最高的成分.據(jù)報道，榭皮素是一種多酚類化合物，其生理作用包括抗氧化，抗炎，抗病原和免疫調(diào)節(jié).動物和體外研究表明，榭皮素對免疫活性有影響，包括嗜中性粒細(xì)胞趨化性增強，巨噬細(xì)胞吞噬作用，NK細(xì)胞裂解活性和促有絲分裂原刺激的淋巴細(xì)胞增殖.榭皮素可調(diào)節(jié)與細(xì)胞因子產(chǎn)生有關(guān)的某些基因的表達(dá)[14].榭皮素具有抗病毒和抗菌特性，包括抑制甲型流感病毒H1N1，H3N2和抑制H5N1的侵入[16]，這提示榭皮素在治療COVID-19中可能發(fā)揮著重要作用.

PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，VEGFA，IL6，POR，PLAT位于PPI網(wǎng)絡(luò)的中心位置.說明中藥黃連活性成分與它們有較高的結(jié)合活性，這些靶點可作為黃連治療COVID-19的潛在靶點.IL-6是白介素超家族的主要成員[17]，既可作為促炎性細(xì)胞因子，又可作為抗炎性肌因子[18].成骨細(xì)胞分泌IL-6以刺激破骨細(xì)胞形成.許多血管的中膜介質(zhì)中的平滑肌細(xì)胞也產(chǎn)生IL-6作為促炎性細(xì)胞因子.IL-6作為抗炎性肌動蛋白的作用是通過其對TNF-α和IL-1的抑制作用以及IL-1ra和IL-10的激活而介導(dǎo)的.IL-6可以用作嚴(yán)重COVID-19感染的炎性標(biāo)志物[18].IL-6作為肌肉因子具有廣泛的抗炎功能[19].RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶是一種酶，在人中編碼AKT1基因.該酶屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的AKT亞家族[20].VEGF是急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征的關(guān)鍵因素，缺氧和嚴(yán)重炎癥會增加VEGF的水平，在COVID-19患者中顯著升高.VEGF的低氧上調(diào)通常通過ACE2的上調(diào)來抵抗[21].

通過對黃連有效成分作用的關(guān)鍵靶點進(jìn)行生物學(xué)過程富集分析，基因主要在生長因子受體結(jié)合、生長因子活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體激活劑、氧化還原酶活性(作用于成對供體，結(jié)合或還原分子氧)等功能上富集，顯示黃連可能通過VEGFA，IL6，POR，PLAT等基因調(diào)節(jié)生長因子受體結(jié)合、生長因子活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等功能，進(jìn)而治療COVID-19.在KEGG富集分析中，證實黃連對HIF-1信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥信號通路、FoxO信號通路具有調(diào)控作用.基因通過HIF-1信號通路，調(diào)節(jié)與血管生成有關(guān)的VEGF的表達(dá)，調(diào)節(jié)與血管張力有關(guān)的HMOC1的表達(dá)；通過EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥信號通路，調(diào)節(jié)表皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，細(xì)胞的生長、增殖、生存和血管的生成；通過JAK-STAT信號通路，促進(jìn)細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、生存和細(xì)胞周期；通過FoxO信號通路，促進(jìn)炎性因子IL-6、IL-10和表皮生長因子EGFR的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，細(xì)胞的凋亡、自噬、氧化應(yīng)激及DNA的修復(fù)和代謝，達(dá)到治療COVID-19的目的.

基因通過HIF-1信號通路治療COVID-19的可能機制是HIF-1α激活輕度缺氧條件下的信號通路，減少了ACE2和TMPRSS2的表達(dá)，并增加了表面的ADAM17水平肺泡細(xì)胞，因此降低了SARSCoV-2的侵襲性.相反，HIF-1α的蛋白質(zhì)靶標(biāo)參與了嚴(yán)重的缺氧誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)激活，以及隨后的COVID-19炎癥過程和細(xì)胞因子風(fēng)暴期.此外，適量的間歇性缺氧可以減輕促炎過程[22].在哺乳動物中，F(xiàn)OXO3a通過誘導(dǎo)DNA修復(fù)來調(diào)節(jié)細(xì)胞對應(yīng)激的抵抗力，從而可能影響生物體的壽命[23].最近的研究表明，IL-6-JAK-STAT3軸與COVID-19發(fā)生的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[24].因此，對于COVID-19的治療可以選擇從黃連的有效成分入手，探究是否可以通過某些關(guān)鍵靶點和通路發(fā)揮作用.

在此基礎(chǔ)上，本研究特別選用黃連的榭皮素分別與VEGFA，IL6，POR，PLAT對接.為了進(jìn)一步合理驗證黃連治療COVID-19的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，在進(jìn)行分子對接時，以結(jié)合能不超過-5.0 kJ/mol作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，榭皮素與VEGFA，IL6，POR，PLAT的對接結(jié)合能均符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，說明榭皮素可能直接作用于COVID-19的靶點從而治療COVID-19.

本研究黃連榭皮素與POR對接的結(jié)果與Derosa等[25]的發(fā)現(xiàn)基本一致，即榭皮素可抑制POR，榭皮素在理論上具有干擾SARS-CoV-2復(fù)制的能力.DI等[26]分子對接研究表明，槲皮素可抑制3CLpro，PLpro和S蛋白.最近有研究證實，榭皮素是一種有效的3CLpro抑制劑.迄今為止，未見有榭皮素與PLAT，VEGFA，IL6分子對接的報道，本研究首次完成了榭皮素與PLAT，VEGFA，IL6的分子對接，對接結(jié)果顯示，榭皮素與PLAT，VEGFA，IL6均有較好的對接，其結(jié)合能均在-6.4 kcal/mol以下.本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究COVID-19的靶點PLAT，VEGFA，IL6提供了理論基礎(chǔ).