劉艷梅，許妍，張靜，洪挺

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

復(fù)方鮮竹瀝液為甲類非處方藥，由鮮竹瀝、魚腥草等七味中藥組成，臨床用于痰熱咳嗽、痰黃黏稠的治療［1］。全國生產(chǎn)該制劑的生產(chǎn)企業(yè)共計十家，其中江西企業(yè)占據(jù)八家，屬于江西特色中藥制劑。復(fù)方鮮竹瀝液為液體制劑，液體制劑多以水為溶媒，易被微生物污染而發(fā)霉變質(zhì)，尤其制法中加入矯味劑蔗糖或甜菊素，更易引起微生物的滋生與繁殖。復(fù)方鮮竹瀝液制法中加入0.3%的苯甲酸鈉作為防腐劑，但有關(guān)資料顯示pH 值對苯甲酸及其鈉鹽的抑菌效果影響很大，苯甲酸的最佳抑菌pH 值為2.0～4.0，一般以＜5.0 為宜，苯甲酸鈉的最適pH 值為≤4［2-5］，而復(fù)方鮮竹瀝液的pH 值為4.8～6.0［1］。為考察企業(yè)是否規(guī)范使用防腐劑，本實驗選擇了中藥液體制劑中常用的防腐劑苯甲酸、山梨酸、尼泊金酯類防腐劑（羥苯酯類）以及脫氫乙酸共計9 種進行考察，建立了HPLC-DAD 法同時測定復(fù)方鮮竹瀝液中9 種防腐劑含量,并對6 家企業(yè)共計94 批樣品和8 批次鮮竹瀝原料藥進行防腐劑的篩查和定量測定,以期為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 lnfinity Ⅱ高效液相色譜儀，DAD檢測器，OpenLAB CDS 化學工作站（美國安捷倫公司）；Secura125-1CN 電子天平（德國賽托利斯公司）。

1.2 試藥

苯甲酸（批號：100419-201302，含量：100%），山梨酸（批號：190126-201501，含量：99.6%），羥苯甲酯（批號：100278-201404，含量：100%），羥苯乙酯（批號：100847-201203，含量：100%），羥苯丙酯（批號：100444-201403，含量：99.6%），羥苯丁酯（批號：110792-200503，含量：100%）購自中國食品藥品檢定研究院。脫氫乙酸（批號：BCBF0386V，含量：98.0%）購自ALDRICH。羥苯異丙酯（批號25192，含量：99.4%），羥苯異丁酯（批號41110，含量：99.7%）購自AccuStandard。復(fù)方鮮竹瀝液共94 批，來源于國家藥品抽檢計劃抽樣；鮮竹瀝原料藥8 批，由生產(chǎn)企業(yè)提供。乙酸銨為分析純，甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗［6-10］

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.02 mol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～23 min，5%A；23～65 min，55%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm（苯甲酸、脫氫乙酸），256 nm（山梨酸、羥苯酯類）；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。在上述色譜條件下，9 種防腐劑的理論板數(shù)均大于3 000，分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備分別取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯、羥苯異丙酯和羥苯異丁酯對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL 各含16 μg 的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備精密吸取樣品1 mL，置100 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗按處方取各味藥材，按制法制備不含防腐劑的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制得陰性樣品溶液。取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液分別按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果顯示陰性無干擾，圖譜見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察取各對照品適量，精密稱定，加水分別制成6 個質(zhì)量濃度的系列溶液，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件分析。以各防腐劑成分濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），擬合標準曲線并進行回歸分析。結(jié)果顯示，各防腐劑成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果詳見表1。

表1 防腐劑線性關(guān)系

2.3.3 重復(fù)性試驗取樣品（批號B190708），平行精密量取6 份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，測得苯甲酸平均含量為0.29%，RSD 為0.6%，其余8 種防腐劑均未檢出，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 回收率試驗精密量取已知防腐劑含量的樣品6 份,加入混合對照品儲備液適量,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果表明該方法準確可靠，結(jié)果見表2。

表2 防腐劑回收率結(jié)果 %

2.3.5 檢出限取對照品溶液，逐級稀釋至各對照品色譜峰信噪比（S/N）為3∶1，作為該防腐劑成分的檢出濃度（μg/mL），分別計算檢出限，結(jié)果苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、羥苯甲酯的檢出限為0.001%，羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯、羥苯異丙酯、羥苯異丁酯的檢出限為0.002%。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗取同一混合對照品溶液，室溫下放置0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果各防腐劑峰面積在48 h 內(nèi)無明顯變化，表明被測溶液48 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.7 耐用性試驗實驗選擇了三種不同品牌的色譜柱，分別為資生堂CAPCELL PAK C18（4.6mm×250mm，5 μm），Waters Sunfire C18 柱（4.6mm×250mm，5 μm）和依利特Supersil ODS2（4.6mm×250mm，5 μm），并取同一混合對照品溶液按“2.1”項下色譜條件進行分析測定。結(jié)果9 種防腐劑成分均分離良好且峰面積無明顯變化，表明該方法的耐用性較好。

2.4 樣品測定

取94 批次復(fù)方鮮竹瀝液樣品和8 批次鮮竹瀝原料藥，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果94 批次復(fù)方鮮竹瀝液和8 批次鮮竹瀝原料藥均檢出苯甲酸。94 批次復(fù)方鮮竹瀝液苯甲酸含量為0.13%～0.30%，8 批次鮮竹瀝原料藥苯甲酸含量為0.07%～0.22%，均未檢出其余8 種防腐劑。

3 討論

3.1 色譜條件篩選

本實驗采用DAD 檢測器進行掃描，發(fā)現(xiàn)苯甲酸、脫氫乙酸在230 nm 處有最大吸收，山梨酸、羥苯酯類防腐劑在256 nm 有最大吸收。為滿足9個化合物檢測靈敏度的要求，確定苯甲酸、脫氫乙酸的檢測波長為230 nm，山梨酸、羥苯酯類的檢測波長為256 nm。實驗選擇甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨溶液作為流動相，考察了不同流動相比例的分離情況，最終確定按“2.1”項下色譜條件進行梯度洗脫。

3.2 測定結(jié)果分析

本品種質(zhì)量標準收載于《中國藥典》2020 年版一部，質(zhì)量標準制法項規(guī)定每1 000 mL 使用苯甲酸鈉3 g，且依據(jù)《中國藥典》2020 年版四部通則0181 合劑項下有關(guān)規(guī)定，山梨酸和苯甲酸的用量不得超過0.3%（其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計），羥苯酯類的用量不得超過0.05%［11］。對本次抽檢的6 家生產(chǎn)企業(yè)共94 批次樣品和8 批次鮮竹瀝原料藥進行防腐劑測定，結(jié)果顯示，各企業(yè)添加的防腐劑均符合《中國藥典》2020 年版一部、四部有關(guān)規(guī)定，表明本品種防腐劑的使用情況良好。

3.3 防腐劑抑菌效能及毒性探討

目前，中藥液體制劑生產(chǎn)實際中常用防腐劑為苯甲酸的鈉鹽和山梨酸的鉀鹽，其次為苯甲酸、山梨酸、尼泊金酯類防腐劑（羥苯酯類）。有文獻報道苯甲酸鈉防腐能力小于苯甲酸，苯甲酸防止發(fā)酵效果好，但苯甲酸毒性較大，因此苯甲酸的使用受到了爭議，許多國家也已禁止使用［8］；山梨酸防腐能力強；尼泊金酯類防腐劑（羥苯酯類）防霉作用強、用量小，是大眾認可的毒性較低的防腐劑。另外，防腐劑的聯(lián)合應(yīng)用可增強防腐和抑菌效能，是解決防腐劑使用過量的途徑之一，應(yīng)推廣應(yīng)用［12-14］。

4 結(jié)論

本實驗建立HPLC-DAD 法同時測定復(fù)方鮮竹瀝液中9 種防腐劑的含量,該方法準確可靠、耐用性較好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。