鄭自強，衛(wèi)春會，張立偉，鄧杰，黃治國，劉美君，任志強*

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644000）（2.釀酒生物技術(shù)及應用四川省重點實驗室，四川宜賓644000）（3.長春工業(yè)大學化學工程學院，吉林長春 130000）

中國白酒在食品飲料行業(yè)具有重要地位。酒曲在白酒釀造的糖化、產(chǎn)酒、生香過程均有參與，被稱為“酒之骨”，有舉足輕重的作用[1]。大曲是酒曲的突出代表，其以小麥為主要原料，在釀造過程中作為微生物制劑和酶制劑參與風味物質(zhì)的形成[2]，霉菌是大曲中主要的菌種之一，可分泌糖化酶、蛋白酶等多種功能酶，可促進原料的分解利用，如糖化酶可將淀粉中的α-1,4鍵和α-1,6鍵切斷，使淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖[3]，而霉菌在釀造生產(chǎn)中一般是通過制作麩曲來體現(xiàn)其酶學功能。俞劍燊等[4]從曲塊中分離出2株高產(chǎn)糖化酶和淀粉酶的曲霉菌株BR84和BR88，混合制曲后其糖化酶和蛋白酶活力分別達1099.82 U/g和284.44 U/g；HUI X[5]通過優(yōu)化一株米曲霉的產(chǎn)酶條件使酶產(chǎn)量增加了17.50%；宋克偉[6]制作米根霉菌麩曲，應用于釀造，提高了成品酒的出酒率和優(yōu)質(zhì)酒率。麩曲是以麩皮為主要原料，蒸煮冷卻后接入微生物，經(jīng)培養(yǎng)繁殖產(chǎn)酶，然后低溫烘干而成的散曲[7]，由于麩曲制作簡單，原料成本低廉，且能夠作為微生物培養(yǎng)的優(yōu)良載體，在工業(yè)上已經(jīng)廣泛應用，包括菌種的改良、工藝的優(yōu)化和應用的多樣化等[8]。應用大曲進行白酒生產(chǎn)存在出酒率低的局限性，而出酒率取決于酒曲的糖化能力，故選育出能在實際釀造生產(chǎn)中起作用的高產(chǎn)糖化酶菌株，具有重要意義[9,10]。

本研究從中高溫大曲中分離出2株高產(chǎn)糖化酶菌株，并用于強化麩曲，以糖化酶活力作為考察指標，從制曲原料、培養(yǎng)時間、加水量、干燥溫度四個因素考察其對制曲生產(chǎn)性能的影響，并通過固態(tài)發(fā)酵測試成品麩曲的釀造性能，以期形成一套開發(fā)利用大曲微生物的方法體系，為實際生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中高溫大曲，取自川南某濃香型酒廠；麩皮、高粱、麩曲、活性干酵母、小曲，市售；NaOH、H2SO4、HCl（分析純），成都市科龍化工試劑廠；蛋白酶K，德國Merck公司；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒，北京智杰方遠科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

CP214電子天平，奧豪斯儀器有限公司；GI54DS立式自動壓力蒸汽壓滅菌器，致微儀器有限公司；LS-I201微生物培養(yǎng)箱，上海博訊生物儀器有限公司；DM3000顯微照相機，德國Leica公司；5430R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；C1000Touch PCR儀，美國Bio-Rad公司；Super alcomat全自動酒精度測試儀，德國Julabo公司。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH。

1.4 方法

1.4.1 霉菌的分離純化

稱取10 g大曲溶于加有玻璃珠的90 mL無菌水中，充分振蕩20 min，計為10-1，逐級稀釋至10-6，使用 PDA培養(yǎng)基進行平板涂布培養(yǎng)，適宜梯度下挑取不同形態(tài)菌落進行劃線分離純化，重復操作3次，將純化的菌株轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，低溫保存[11]。

1.4.2 霉菌的形態(tài)學鑒定

將純化菌株點植入PDA培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h～72 h，觀察菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)，挑取菌絲，染色后于顯微鏡下觀察菌株形態(tài)特征，對菌株進行鑒定[12]。

1.4.3 霉菌的分子生物學鑒定

將恒溫 28 ℃，培養(yǎng) 48 h的馬鈴薯液體培養(yǎng)基5000 r/min離心10 min集菌，提取真菌基因組DNA，以 ITS1：5’-TCCGTAG-GTGAACCTGCGG-3’為正向引物，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3’為反向引物擴增菌株rDNA-ITS序列。

PCR反應體系：引物ITS1和ITS4均1 μL；模板（基因組）2 μL；Taq PCR Master Mix 25 μL；超純水21 μL。

PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；循環(huán)30 次；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物送上海生物工程公司測序。測序結(jié)果在 Gen Bank數(shù)據(jù)庫對序列比較分析，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建發(fā)育樹。

1.4.4 測定方法

霉菌麩曲糖化酶活力的測定參照QB/T 4257-2011《釀酒大曲通用分析方法》中的方法，使用全自動酒精度測試儀測定酒精度[13]。

糖化酶活定義：在35 ℃、pH 4.6條件下，1 g大曲1 h轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生產(chǎn)葡萄糖的毫克數(shù)定義為一個酶活力單位（U），以U/g表示[14]。

1.5 純種霉菌麩曲生產(chǎn)性能測試

1.5.1 制曲性能測試

以JQ-1、JQ-2為出發(fā)菌株，以糖化酶活力為考察指標，通過前期預實驗，固定培養(yǎng)溫度為 35 ℃，分別考察在不同的制曲原料（麩皮:高粱=4:1、麩皮:米粉=4:1、麩皮:全麥粉=4:1、全麩皮）、培養(yǎng)時間（0、24、36、48、60、72、96、120、144 h)、加水量（40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%）和干燥溫度（35、40、45、50、55 ℃）等條件下對麩曲糖化酶活力的影響。

制曲工藝流程[15-16]：

原料→加水→拌曲→蒸麩→裝瓶→滅菌→接種→恒溫培養(yǎng)→干燥儲藏→淺盤麩曲

加水、拌曲、蒸麩：稱取原料于三角瓶，加去離子水混勻，使麩皮充分吸水，調(diào)節(jié)水分含量，于121 ℃高壓蒸汽滅菌處理30 min，保證其無菌狀態(tài)[17]。

接種、恒溫培養(yǎng)、干燥儲藏：將活化后的菌種在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至孢子數(shù)為 106CFU/mL的菌懸液接種于無菌麩皮中，控制接種量為5%，恒溫培養(yǎng)，待菌種培育完成后控溫烘干，儲藏[18]。

1.5.2 固態(tài)發(fā)酵釀造性能測試

固態(tài)發(fā)酵相較于液態(tài)發(fā)酵具有更好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，為探究麩曲的生產(chǎn)性能，進行固態(tài)釀造試驗。以高粱為原料，麩曲和活性干酵母為糖化發(fā)酵劑進行固態(tài)發(fā)酵試驗，檢測麩曲白酒固態(tài)發(fā)酵條件下的出酒率和酒精度變化，初探其運用生產(chǎn)的釀造性能[19]。

釀酒工藝流程：

高粱→泡糧→蒸糧→打量水→下曲→拌曲→堆積→發(fā)酵→蒸酒→儲存

泡糧、打量水、蒸糧：稱取高粱，加入沸水浸泡高粱過夜，將浸泡后的高粱蒸熟，打量水，使糧食最終含水量為高粱干重的47%。

下曲、拌曲：試驗組曲采用的是純種霉菌麩曲，起糖化作用，缺乏酵母將生成的糖分轉(zhuǎn)化為酒精，結(jié)合前期酵母和麩曲配比的預實驗結(jié)果，確定以接種量為0.4%的純種霉菌麩曲和0.6%的活性干酵母為試驗組，以接種量為0.4%的2種純種市售麩曲和0.6%的活性干酵母為對照2和對照3。接入曲后，待糧食冷卻，將曲拌入糧糟混勻。

堆積、發(fā)酵、蒸酒、儲存：堆積24 h，充分糖化以及保證酵母充分繁殖。入缸泥封發(fā)酵15 d后蒸酒。測定餾出酒的酒度，餾取酒精度高于10% vol的酒于適宜環(huán)境條件密封儲存。

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學鑒定

菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)48 h后，對菌落形態(tài)進行觀察，以菌落的直徑與透明圈直徑的比值作為是否高產(chǎn)糖化酶的初步評判依據(jù)[20]，初步分離出兩株形態(tài)特征不同的可能高產(chǎn)糖化酶的菌株，編號為JQ-1、JQ-2。菌株JQ-1為黑褐色，呈根狀分枝，有孢子，孢子為球形黑色，菌絲無隔，分枝狀；菌株JQ-2為灰白色，呈根狀分枝；有球形孢子囊，無橫托，菌絲無隔，分枝狀。菌株菌落形態(tài)特征觀察結(jié)果見表1。

表1 菌株JQ-1與菌株JQ-2的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of strain JQ-1 and strain JQ-2

2.2 系統(tǒng)發(fā)育學分析

測序結(jié)果表明，菌株JQ-1和JQ-2的rDNA-ITS序列基因片段全長分別約1050 bp和1010 bp（圖1），用BLAST軟件在Gen Bank數(shù)據(jù)庫中對比分析，發(fā)現(xiàn)菌株JQ-1與根霉屬（Rhizopus）的菌株高度相關(guān)，JQ-2與毛霉屬（Mucor）的菌株高度相關(guān)。用 MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖2、圖3）。由系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果看出，菌株JQ-1與米根霉菌株（Rhizopusoryzae）（序列號MT259131.1）為同一支，同源性為100%，菌株JQ-2與卷枝毛霉菌株（Mucorcircinelloides）（序列號HQ845293.1）為同一支，同源性100%。

綜合形態(tài)學鑒定和rDNA-ITS序列分析結(jié)果，將JQ-1菌株鑒定為接合菌綱（Zygomycetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoraceae）、根霉屬（Rhizopus）、米根霉菌（Rhizopusoryzae）；將菌株 JQ-2鑒定為藻狀菌綱（Phycomycetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoraceae）、毛霉屬（Mucorracemosus）、卷枝毛霉菌（Mucorcircinelloides）。

2.3 純種霉菌麩曲生產(chǎn)性能測試

2.3.1 制曲條件優(yōu)化

2.3.1.1 不同原料對麩曲酶活力的影響

糖化酶又為葡糖糖淀粉酶，葡糖糖淀粉酶是通過將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖體現(xiàn)其酶活性的，淀粉利用率高，則糖化酶活性高。在原料中添加高淀粉含量的輔料如高粱、米粉、麥粉等可以保證糖化反應的充分進行，但輔料的蓬松度一般較麩皮略低，過量的加入會影響麩曲的疏松度，從而影響微生物代謝作用[21]。為此，固定培養(yǎng)溫度為35 ℃，培養(yǎng)時間為48 h，加水量為45%，干燥溫度為40 ℃，分別以麩皮和高粱、麩皮和米粉、麩皮和全麥粉按4:1比例與全麩皮為原料對照進行試驗。由圖4可知，JQ-1接種制作的麩曲糖化酶活力 D＞C＞B＞A，JQ-2接種麩曲糖化酶活力D＞C＞A＞B，JQ-1表現(xiàn)出更好的糖化性能，JQ-1和JQ-2均以全麩皮為原料制作的麩曲糖化酶活力最佳?？赡苁谴藯l件下麩曲所含有的淀粉量充分，不需要通過添加輔料的方式來滿足JQ-1和JQ-2的代謝產(chǎn)酶需求，且全麩皮原料結(jié)構(gòu)疏松透氣、吸水性強，更符合霉菌的生存環(huán)境要求。故最終確定JQ-1麩曲和JQ-2麩曲的原料為全麩皮。

2.3.1.2 培養(yǎng)時間對麩曲糖化酶活力的影響

由圖5可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，JQ-1和JQ-2菌株接種麩曲的糖化酶活力呈現(xiàn)先增后降趨勢。在培養(yǎng)時間在72 h～120 h時，曲內(nèi)微生物的代謝活動更為活躍，維持著較高的糖化酶活力，顯著高于其他培養(yǎng)時間段（p＜0.05），其中，JQ-1麩曲在培養(yǎng)時間為96 h時達到峰值，達1620.00 U/g，JQ-2麩曲酶活在培養(yǎng)72 h時達到峰值，為1382.00 U/g，隨著培養(yǎng)時間的延長，JQ-1和JQ-2菌株表現(xiàn)為糖化酶活力有所下降，在培養(yǎng)時間達到144 h時，JQ-1麩曲和JQ-2麩曲的糖化酶活力呈顯著降低趨勢（p＜0.05）。由此可見，霉菌麩曲培養(yǎng)時間對菌株的酶活性的保持有較大影響，JQ-1和JQ-2麩曲的最佳培育時間有所差異，說明不同的菌種有著不同的培養(yǎng)時間要求，可能與菌種自身生理活動特征有關(guān)，綜上所述，確定JQ-1麩曲培養(yǎng)時間為96 h，JQ-2麩曲培養(yǎng)時間為72 h更有利于麩曲糖化酶活的保持。

2.3.1.3 加水量對麩曲糖化酶活力的影響

水分是微生物生長繁殖的基本營養(yǎng)物之一，麩曲加水量的高低直接影響霉菌的代謝[22]，有必要在制曲工藝上對加水量進行考察。圖6可知，JQ-1麩曲和JQ-2麩曲的糖化酶活力隨加水量增加呈先上升后下降至穩(wěn)定趨勢。其中，JQ-1在加水量為55%時品質(zhì)最好，糖化酶活力達到1621.00 U/g，且呈顯著性差異（p＜0.05），JQ-2在55%～60%加水量下，酶活較高，糖化酶活力為1440.00 U/g。加水量35%～45%時，霉菌麩曲表面可見明顯的一層孢子，菌絲較少，在加水量高于50%時，菌絲茂盛，孢子較少。加水量過高時，不利于霉菌向麩皮內(nèi)部生長，糖化酶活力較低；加水量過低時，麩皮較為干癟，此時的環(huán)境因子抑制了菌株正常的生理活動。故控制麩曲加水量為55%為宜。

2.3.1.4 干燥溫度對麩曲糖化酶活力的影響

麩曲培育完成后，需要干燥，以方便麩曲的保藏，過高或過低的溫度會對糖化酶活力的保持造成影響。由圖7可知，在35 ℃～45 ℃溫度區(qū)間范圍內(nèi)，干燥溫度變化對JQ-1、JQ-2霉菌麩曲影響較小，不同溫度下差異不顯著（p＞0.05），麩曲培養(yǎng)溫度在50 ℃～60 ℃時仍有較高的糖化酶活力，JQ-1和JQ-2菌株來自中高溫大曲，具有一定的熱耐受性，故在較高干燥溫度下，麩曲依舊有良好的糖化酶活力，從節(jié)約能源的角度考慮，確定干燥溫度為40 ℃。

2.3.1.5 麩曲酶活檢測

通過對霉菌麩曲的生產(chǎn)性能測試，確定了以全麩皮為原料，（培養(yǎng)時間JQ-1麩曲為96 h，JQ-2麩曲為72 h），加水量為55%，干燥溫度為40 ℃，此條件制作霉菌麩曲更有利于菌株糖化酶活的保持，所得淺盤麩曲JQ-1和麩曲JQ-2的糖化酶活力檢測結(jié)果見表2。由表2知，麩曲JQ-1糖化酶活力在最佳工藝條件下為1510.33 U/g，麩曲JQ-2為1388.26 U/g，麩曲JQ-1與麩曲JQ-2皆有較好的糖化能力，麩曲JQ-1與麩曲JQ-2糖化酶活力具有顯著性差異（p＜0.05），其中麩曲JQ-1糖化能力更占優(yōu)勢。

表2 成品曲糖化酶活力檢測Table 2 Detection of saccharifying enzyme activity of finished Fuqu

表3 麩曲JQ-1和麩曲JQ-2產(chǎn)酒性能測試Table 3 Liquor production performance test of Fuqu JQ-1 and Fuqu JQ-2

2.3.2 固態(tài)發(fā)酵釀造性能測試結(jié)果

麩曲白酒是以純種培養(yǎng)的麩曲及酒母為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌而成的蒸餾酒[23]。本研究采用固態(tài)發(fā)酵法，探究麩曲JQ-1和麩曲JQ-2的釀造性能，由表3可知，試驗組較對照組具有明顯的優(yōu)勢，出酒率和酒度與常規(guī)市售麩曲相比，釀造性能突出，顯著提高了酒度和出酒率，麩曲 JQ-1較麩曲JQ-2釀造能力更為優(yōu)越，出酒率達 44.42%，酒精度為41.22%vol，麩曲JQ-2的出酒率為35.84%，酒精度為37.32%vol，顯著高于市售麩曲（p＜0.05），說明此兩株產(chǎn)糖化酶的菌株在固態(tài)發(fā)酵環(huán)境中保持了較高的酶活力，淀粉轉(zhuǎn)化率高，隨著麩曲JQ-1和麩曲JQ-2的添加，糖化、產(chǎn)酒過程均表現(xiàn)為促進作用。試驗組出酒率和酒度較對照組皆有較大提升，呈顯著差異（p＜0.05），菌種本身來自于釀酒曲，進行固態(tài)發(fā)酵過程，環(huán)境差異較小，這可能是其能發(fā)揮較好的釀造性能的原因之一，麩曲JQ-1白酒與麩曲JQ-2差異顯著（p＜0.05），與成品曲糖化酶活力測定結(jié)果呈正相關(guān)。綜合上述結(jié)果，麩曲JQ-1和麩曲JQ-2能較好的在釀造生產(chǎn)中發(fā)揮其糖化作用，其釀造性能JQ-1＞JQ-2。

3 討論

環(huán)境中有多種霉菌參與白酒生產(chǎn)過程，包括曲霉屬、青霉屬、毛霉屬、根霉屬等，嚴啟梅等[24]從清香型白酒的酒醅中分離出1株米根霉菌株（M2），將其應用于霉菌麩曲，并優(yōu)化制曲工藝，優(yōu)化后的菌株（M2）純種麩曲糖化力達到最大值，為917 U/g；張東平[25]通過制作米根霉和酵母的混合麩曲配合大曲進行釀造試驗，提高了基酒出酒率和優(yōu)質(zhì)酒率；張翠翠等[26]將黑曲霉（186）與米根霉（774-2）進行共培養(yǎng)，相較于黑曲霉純培養(yǎng)，其蛋白酶、揮發(fā)性香氣成分和有機酸產(chǎn)量得到顯著提升；張杰等[27]基于提高霉菌麩曲糖化酶活力和產(chǎn)酒性能等目的，優(yōu)化一株高產(chǎn)糖化酶霉菌（Mxzd-001）的麩曲工藝，優(yōu)化后的霉菌麩曲糖化力達到1032 U/g，應用于釀造生產(chǎn)中，其出酒率提高了 4.9%左右；孫科等[28]以 1株卷枝毛霉（SN2017）為研究對象，通過優(yōu)化工藝提高了菌株的產(chǎn)黃酮能力；張映曈[29]通過分子生物學等手段獲得了1株卷枝毛霉菌株，并對其發(fā)酵條件進行初探進一步提高了番茄紅素產(chǎn)量；劉思佳等[30]從豆醬上獲得了產(chǎn)脂肪酶的卷枝毛霉，發(fā)現(xiàn)其具有生物催化的潛力。本課題從中高溫大曲中分離出的米根霉菌株 JQ-1和卷枝毛霉菌株 JQ-2，制得的 JQ-1麩曲糖化酶活力達1510.33 U/g，JQ-2麩曲達1388.26 U/g，相較于現(xiàn)有的研究，表現(xiàn)出較好的糖化能力和釀造能力，特別是目前卷枝毛霉菌有關(guān)其產(chǎn)糖化酶的代謝特性的報道極少，此發(fā)現(xiàn)可為全面的探究其代謝途徑及酶學性質(zhì)提供一定的參考價值。

4 結(jié)論

4.1 本試驗采用生理生化特征與分子生物學結(jié)合的辦法，從中高溫大曲中篩選出2株霉菌（JQ-1、JQ-2），提取菌株基因組后，對擴增的rDNA-ITS基因片段測序，對測序結(jié)果構(gòu)建基因序列進化樹，鑒定得出菌株JQ-1為米根霉菌（Rhizopusoryzae），JQ-2為卷枝毛霉菌（Mucorcircinelloides）。

4.2 以JQ-1和JQ-2分別制備純種霉菌麩曲，測試其生產(chǎn)性能。制曲性能測試結(jié)果表明，以全麩皮為原料，控制加水量為55%，JQ-1麩曲培養(yǎng)96 h，JQ-2麩曲培養(yǎng)72 h，干燥溫度控制在40 ℃，制得的JQ-1麩曲糖化酶活力達1510.33 U/g，JQ-2麩曲達1388.26 U/g，證明JQ-1和JQ-2具有較高的糖化酶生產(chǎn)能力；產(chǎn)酒性能測試結(jié)果表明，純種霉菌麩曲與活性干酵母作為糖化發(fā)酵劑在固態(tài)發(fā)酵中產(chǎn)酒性能麩曲 JQ-1＞麩曲JQ-2，JQ-1菌株表現(xiàn)為更好的釀造能力，出酒率達44.42%，酒度為41.22% vol，麩曲JQ-2的出酒率為35.84%，酒精度為37.32% vol，與優(yōu)化后的成品曲糖化酶活力測定結(jié)果呈正相關(guān)。綜合純種霉菌麩曲制備和產(chǎn)酒性能的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)菌株JQ-1和JQ-2能在釀造生產(chǎn)中較好的發(fā)揮其糖化作用，且制得的純種霉菌麩曲的釀造性能麩曲JQ-1＞麩曲JQ-2。

4.3 大曲微生物種類繁多，能產(chǎn)生大量的生物酶，但其各類微生物分工合作的代謝機制尚不明朗，需進一步開發(fā)，并完善大曲中微生物在釀造中相互作用的機制。本課題為大曲功能微生物的開發(fā)與生產(chǎn)應用提供了一定的理論指導。