黃惠威，劉鳳銀，曾思敏，曾羲，錢振杰，施迪燊，聶玉丹，江海超，袁學(xué)文，穆洪濤*

（1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州 510303）（2.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 511400）

氟樂靈屬于二硝基苯胺類藥物[1]，廣泛應(yīng)用于防除單子葉雜草[2]，也可以抗有絲分裂阻止染色體加倍獲得單倍體植株[3,4]，具有價(jià)格低廉、藥效明顯等特點(diǎn)[5,6]。然而氟樂靈會(huì)殘留在食品或環(huán)境中，對(duì)水生生物和環(huán)境造成危害，也會(huì)極大影響人體健康[7-9]，例如胎兒發(fā)育不正常、內(nèi)分泌功能失調(diào)和致癌等[10,11]。

氟樂靈的廣泛應(yīng)用造成大量氟樂靈農(nóng)藥殘留量超標(biāo)現(xiàn)象[12,13]，因此許多國家和組織對(duì)氟樂靈農(nóng)藥制定了嚴(yán)格的殘留限量[14-16]。例如，歐盟規(guī)定玉米、棉籽和花生仁中氟樂靈農(nóng)藥殘留限量為10 μg/kg[6]，日本規(guī)定油為15 μg/kg，澳大利亞規(guī)定油料為50 μg/kg[7]，中國規(guī)定大豆、花生、豆油、花生油、玉米、棉籽、花生仁為 50 μg/kg[7,16]。氟樂靈農(nóng)藥在土壤中留存持久，半衰期約為 3～12個(gè)月[17]，氟樂靈的廣泛應(yīng)用和長期存在，對(duì)水生生物具有高毒[18]，也會(huì)影響農(nóng)作物的出苗率和生長[19]。2010年日本屢次檢出中國出口的水產(chǎn)品梭子蟹和鰻魚中的氟樂靈超標(biāo)[20]，因此日本要求加強(qiáng)對(duì)中國梭子蟹和鰻魚中的氟樂靈農(nóng)藥的監(jiān)控檢查，造成中國水產(chǎn)品梭子蟹和鰻魚的出口難度加大。2019年《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763-2019）規(guī)定食用油中氟樂靈為必檢農(nóng)藥殘留項(xiàng)目，規(guī)定最大殘留限量為50 μg/kg[21]，因此建立農(nóng)（水）產(chǎn)品中高通量快速檢測(cè)氟樂靈殘留的方法很有必要。

目前，對(duì)于大豆、花生、豆油、花生油中的氟樂靈殘留量的檢測(cè)，我國規(guī)定氣相色譜法作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[16]。近幾年國內(nèi)外主要采用色譜法[22,23]、電化學(xué)方法[24-26]、熒光法[27,28]檢測(cè)氟樂靈殘留，雖然這些方法可靠準(zhǔn)確，但耗時(shí)較長且專業(yè)人員要求較高，檢測(cè)成本較高，不適用高通量現(xiàn)場(chǎng)快速篩查，而酶聯(lián)免疫分析方法具有高通量、靈敏度較高、特異性較好、耗時(shí)較短、成本較低、操作簡單且適合基層廣泛推廣應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前快速檢測(cè)的主要方法[29-31]，但現(xiàn)階段國內(nèi)缺乏快速檢測(cè)氟樂靈農(nóng)藥的酶聯(lián)免疫分析方法。2000年Heged?s等[32]制備了氟樂靈多克隆抗體，采用酶聯(lián)免疫分析方法對(duì)地表水樣和蔬菜汁進(jìn)行氟樂靈殘留檢測(cè)；2008年Kr?mer等[33]采用酶聯(lián)免疫分析方法對(duì)水和土壤中的氟樂靈殘留進(jìn)行了檢測(cè)。以上研究主要針對(duì)水樣、土壤、蔬菜汁等進(jìn)行氟樂靈殘留檢測(cè)，而本研究開發(fā)了針對(duì)大豆、大豆油、對(duì)蝦等農(nóng)（水）產(chǎn)品中的氟樂靈殘留快速檢測(cè)方法，為滿足現(xiàn)階段國內(nèi)對(duì)氟樂靈檢測(cè)的需求和提高食品安全水平具有重要意義。

本研究設(shè)計(jì)并合成了一種新型的氟樂靈完全抗原，通過免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體，并對(duì)包被原和抗體的稀釋倍數(shù)、包被溫度、抗體和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液等條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，進(jìn)而建立一種檢測(cè)農(nóng)（水）產(chǎn)品中氟樂靈農(nóng)藥殘留的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA），該方法具有靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)，為進(jìn)一步開發(fā)氟樂靈殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒或試紙條提供理論依據(jù)，也為農(nóng)（水）產(chǎn)品安全提供更有效的保障，從而保障人類的身體健康。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新西蘭大白兔廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；氟樂靈、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、二環(huán)己基碳化二亞胺（DCC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FICA）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）廣州齊云生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG沈陽萬類生物科技有限公司；聚苯乙烯酶標(biāo)板廈門怡佳美實(shí)驗(yàn)器材有限公司；氟樂靈20種結(jié)構(gòu)類似物荷蘭specs生物特殊化合物服務(wù)有限公司；包被液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）、Tris-HCl緩沖液（Tris-HCl）實(shí)驗(yàn)室配制；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。洗滌液：Na2HPO4·12H2O 16 g，NaCl 40 g，吐溫-20 3 mL，用蒸餾水定容到500 mL；封閉液：硼酸3.22 g，四硼酸鈉3.26 g，蔗糖30 g，酪蛋白2 g，魚皮明膠4 g，氨基比林1 g，Proclin 300 0.5 mL；終止液：10%硫酸溶液；TMB顯色液：過氧化脲0.03 g，α液45 mL，TMB 0.03 g，DMSO 1.8 mL，β液36 mL，甘油4 mL。

DK-8AD電熱恒溫水熱槽，，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；XP.5002電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；MX-F震蕩儀、PHSI-5實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；RT-3100全自動(dòng)洗板機(jī)，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；SP-Max2300光吸收型全波長酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司；Agilent 7890B氣相色譜（配 ECD）、色譜柱（DB-1701，30 m×0.25 mm×0.25 μm），美國安捷倫科技有限公司；料理機(jī)（L22-Y86），九陽股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 氟樂靈半抗原的合成與鑒定

氟樂靈半抗原2C合成路線如圖1所示。將2-吡咯烷酮（1000 mg，11 mmol）溶于10 mL DMF，加入13.2 mmol氫化鈉（60%）和正溴丙烷（1758.9 mg，14.3 mmol），在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70 ℃油浴攪拌過夜。反應(yīng)液中加入70 mL乙酸乙酯和50 mL飽和氯化銨溶液，進(jìn)行萃取后合并有機(jī)相，用10 g無水硫酸鈉干燥20 min。40 ℃旋干（0.09 MPa），獲得含酯基的仲胺中間體。將其加入13 mL 4 mol/L NaOH溶液于100 ℃油浴攪拌過夜進(jìn)行水解得到水解產(chǎn)物后，將 3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯溶解于6 mL四氫呋喃，加入到水解產(chǎn)物中，室溫?cái)嚢? h。然后用30 mL水進(jìn)行稀釋，加1 mol/L鹽酸調(diào)pH至2～3，沉淀物出現(xiàn)。再用乙酸乙酯萃取兩次，沉淀溶解。之后用10 mL飽和食鹽水對(duì)有機(jī)相分別進(jìn)行洗滌，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，40 ℃旋干，用層析液于硅膠板進(jìn)行分離，獲得產(chǎn)物半抗原2C。半抗原2C分離純化后，經(jīng)薄層層析初步鑒定，再通過高分辨質(zhì)譜（MS）和核磁共振氫譜（NMR）等手段進(jìn)行精細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.2 人工完全抗原的制備和鑒定

本研究采用碳二亞胺法偶聯(lián)合成人工完全抗原，在偶聯(lián)過程中碳二亞胺能使半抗原的羧基與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生縮合，生成酰胺和酯。免疫原采用了BSA為載體蛋白，包被原則采用了 OVA作為載體蛋白，抗原經(jīng)過透析純化后采用紫外吸收光譜進(jìn)行鑒定。

1.2.2.1 活化半抗原2C

稱取22 mg半抗原2C置于10 mL棕色玻璃瓶內(nèi)，加入1 mL無水DMF和磁子，置于磁力攪拌器上攪拌5 min，溶解完全為α液；稱取24.05 mg DCC于1 mL離心管內(nèi)，加入96 μL無水DMF，振動(dòng)使其完全溶解為β液；稱取13 mg NHS于1 mL離心管內(nèi)，加入25 μL無水DMF，振動(dòng)使其完全溶解為γ液。取α液加入β、γ液置于4 ℃下磁力攪拌過夜，后將其轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，19000 r/min離心10 min，取上清液于新離心管中，為δ液。

1.2.2.2 2C-BSA/OVA的偶聯(lián)

稱取20 mg BSA/OVA置于10 mL棕色玻璃瓶中，加入4 mL PBS緩沖液和磁子于磁力攪拌器上持續(xù)攪拌后，向BSA/OVA溶解液中緩慢滴入582.4 μL/512.2 μL的δ液，4 ℃磁力攪拌12 h，8000 r/min離心20 min，取上清液。將上清液透析3 d，每日透析3次，透析結(jié)束后保留最后一次透析液進(jìn)行濃度調(diào)整；波長設(shè)置為200～800 nm，對(duì)2C、2C-BSA、2C-OVA、BSA、OVA進(jìn)行紫外吸收光譜鑒定；鑒定完成后分裝標(biāo)記好后存于-20 ℃，以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 動(dòng)物免疫與多克隆抗體的制備

將2C-BSA與等量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑等量乳化，初次免疫使用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫則使用弗氏不完全佐劑，采用乳化器進(jìn)行乳化直至溶液變成白色乳濁液且滴到水面上30 s內(nèi)不擴(kuò)散后進(jìn)行免疫。選取兩只潔凈、體重為1.5～2.0 kg新西蘭大白兔進(jìn)行背部皮下4～5點(diǎn)注射，每兩周加強(qiáng)注射一次。首次免疫劑量為2 mL/只，后面每次免疫1 mL/只，每次免疫間隔時(shí)間為2周。共進(jìn)行5次加強(qiáng)免疫，最后一次加強(qiáng)免疫后第 7 d從兔子心臟取全血，孵育 30 min，10000 r/min離心10 min，收集上清液并分裝儲(chǔ)存于-20 ℃。

1.2.4 ic-ELISA基本步驟

包被：用PBS稀釋液液稀釋包被抗原，37 ℃包被13 h；封閉：洗滌液洗板2次，加入120 μL封閉液，37 ℃封閉3 h；烘干：甩干孔中液體，37 ℃烘干1 h；加樣：加入氟樂靈標(biāo)準(zhǔn)品和兔抗溶液50 μL/孔，37 ℃孵育一段時(shí)間；加酶標(biāo)二抗溶液：洗板5次，加入稀釋到最佳倍數(shù)的酶標(biāo)二抗溶液100 μL/孔，孵育一定時(shí)間；顯色：洗板5次，加入TMB顯色液100 μL/孔，37 ℃水浴鍋反應(yīng)10 min；終止反應(yīng)：加入終止液50 μL/孔，用酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)定OD值。

1.2.5 ic-ELISA方法的優(yōu)化

采用棋盤滴定法確定包被抗原及抗體的最適工作濃度，用包被原稀釋液將 1 μg/mL包被原分別按1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:12000、1:14000、1:16000稀釋，用PBST溶液將2.26 μg/mL抗體按 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000稀釋，按照ic-ELISA基本步驟操作，確定最佳包被稀釋倍數(shù)及抗體稀釋倍數(shù)。

將包被原和抗體稀釋至最佳工作濃度后，選取37 ℃和4 ℃兩種溫度包被13 h，按照1.2.4ic-ELISA基本步驟操作，選擇Amax在0.8～1.5之間，Amax/IC50（IC50為半數(shù)抑制濃度）最大，IC50最小時(shí)的條件為ic-ELISA的最佳工作條件；最適包被溫度確定后，選擇Tris-HCl、PBS和PBST稀釋液稀釋抗體和標(biāo)準(zhǔn)品，按照ic-ELISA基本步驟操作，得到抗體稀釋液與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液不同組合條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，綜合考慮Amax值、IC50值和Amax/IC50值，確定最佳抗體稀釋液與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的組合；確定好以上最佳工作條件后，設(shè)置20、30、40、50和60 min五個(gè)競爭反應(yīng)時(shí)間梯度，按照ic-ELISA基本步驟操作，選擇Amax在0.8～1.5之間，靈敏度高的反應(yīng)時(shí)間作為最佳條件；基于以上優(yōu)化好的工作條件，最后對(duì)酶標(biāo)二抗稀釋液進(jìn)行優(yōu)化，選擇選擇Tris-HCl、PBS和PBST三種稀釋液稀釋酶標(biāo)二抗，按照ic-ELISA基本步驟操作，綜合考慮Amax值、IC50值和Amax/IC50值，確定最優(yōu)的酶標(biāo)二抗稀釋液。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在上述優(yōu)化條件下，梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（0.000256、0.00128、0.0064、0.032、0.16、0.8、4.0 μg/mL）進(jìn)行ic-ELISA方法測(cè)定，得到不同濃度氟樂靈標(biāo)準(zhǔn)品所對(duì)應(yīng)的OD值。以氟樂靈標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定其靈敏度（IC50）和線性范圍（IC20～I(xiàn)C80），從而評(píng)價(jià)所建立方法的靈敏度和線性范圍。

1.2.7 交叉反應(yīng)測(cè)定

在最優(yōu)的工作條件下，本研究選取與氟樂靈結(jié)構(gòu)或功能類似的20種藥物FCRL、G-031和IPPL等進(jìn)行抗特異性測(cè)定，通過各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其IC50值。交叉反應(yīng)率越高，特異性越差，交叉反應(yīng)率（CR）計(jì)算公式如下：

式中：IC50（氟樂靈）為引起 50%抑制的金剛烷胺濃度（ng/mL），IC50（結(jié)構(gòu)類似物）為引起50%抑制的結(jié)構(gòu)類似物濃度（ng/mL）。

1.2.8 樣品前處理方法、添加回收實(shí)驗(yàn)與儀器確證

1.2.8.1 樣品前處理

取鰻魚、對(duì)蝦、大豆油、大豆作為檢測(cè)樣品。樣品去皮去殼并攪碎，取2.5 g加入10 mL乙腈，震蕩15 min，6000 r/min離心3 min。取5 mL上清液到凈化管中，渦旋1 min后振搖15 min，6000 r/min離心3 min，取2 mL上清液于15 mL離心管中，45 ℃下水浴氮吹近干，加入1 mL正己烷定容，渦旋過膜裝瓶上機(jī)。將凈化后的溶液用氮吹儀氮吹完全，然后根據(jù)所需濃度加入一定量的甲醇和 PBS緩沖溶液超聲提取這些溶液30 min。

1.2.8.2 添加回收實(shí)驗(yàn)

按照方法1.2.7.1處理樣品，在超聲提取的溶液中添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使之含量分別為0.08 μg/g、0.5 μg/g、0.1 μg/g 的加標(biāo)樣品。用建立的ic-ELISA 方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次并計(jì)算出回收率和變異系數(shù)（變異系數(shù)（CV）=標(biāo)準(zhǔn)差/平均數(shù)）。

1.2.8.3 儀器方法確證

采用氣相色譜法（GC-ECD）（NY/T 761-2008）進(jìn)行儀器確證。GC-ECD分析條件：DB-1701色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量 1 μL，載氣為氮?dú)猓?9.999%），恒定流量1.0 mL/min，程序升溫：初溫為60 ℃，保持0.5 min后，以10 ℃/min升至200 ℃，然后以30 ℃/min升至270 ℃，保持5 min。在鰻魚、對(duì)蝦、大豆、大豆油的空白樣品中添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使之含量分別為0.08、0.5、0.1 μg/g的加標(biāo)樣品，按照方法1.2.7.1處理樣品，采用氣相色譜法測(cè)定樣品的抗體濃度，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，計(jì)算回收率和精密度。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel、origin 8.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的合成鑒定

半抗原的合成采用2-吡咯烷酮與正溴丙烷70 ℃下油浴攪拌過夜后獲得黃色油狀物，堿性水解過夜，加入3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯，反應(yīng)1 h，獲得半抗原2C（結(jié)構(gòu)見圖1）。將制備的半抗原2C分離純化，采用薄層分析法進(jìn)行初步鑒定（Rf=0.8）之后，通過高分辨質(zhì)譜（MS）和核磁共振氫譜（NMR）進(jìn)行精細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定。1H-NMR 圖譜中（圖 2（a）），δ為 8.00×10-6的s峰是苯環(huán)上的兩個(gè)氫；δ為3.07×10-6～2.98×10-6的m峰歸屬于與氮相連的亞甲基上的氫；δ為2.94×10-6～2.86×10-6的 m 峰歸屬于二級(jí)碳上的氫；δ為 2.34×10-6的 t峰歸屬于與羥基鄰位的亞甲基上的氫，耦合常數(shù)為7.2 Hz；δ為1.89×10-6～1.79×10-6的m峰歸屬于與羥基間位的亞甲基上的氫；δ為1.55×10-6的dd峰歸屬于與甲基鄰位的亞甲基上的氫，耦合常數(shù)為7.5 Hz；δ為0.81×10-6的t峰歸屬于甲基上的氫，耦合常數(shù)為7.4 Hz。電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）圖譜中（圖 2（b））出現(xiàn)了一組預(yù)期的同位素分子離子峰，其高度是 380.1（m/z，M+）。根據(jù)其核磁共振氫譜與質(zhì)譜數(shù)據(jù)，證明半抗原2C制備成功。

2.2 完全抗原的合成鑒定

完全抗原的合成采用碳二亞胺法，通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)通過Origin 8.5作圖，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，2C、BSA、OVA在419 nm、280 nm、279 nm處具有特征吸收峰，2C-BSA和2C-OVA分別在279 nm和276 nm處有特征吸收峰，2C-BSA和2C-OVA相對(duì)BSA和OVA的最大吸收峰位置均向左發(fā)生偏移，因此初步判定完全抗原偶聯(lián)成功，后期產(chǎn)生的抗體和建立的檢測(cè)方法也充分證明完全抗原偶聯(lián)成功。

2.3 ic-ELISA方法的優(yōu)化

本研究對(duì)包被原和抗體稀釋倍數(shù)、包被溫度、抗體和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、競爭時(shí)間、酶標(biāo)二抗稀釋液這些工作條件進(jìn)行優(yōu)化，IC50值越低，靈敏度越高，綜合考慮Amax、IC50和Amax/IC50和曲線擬合度，從而得出最優(yōu)的條件參數(shù)。包被原和抗體稀釋倍數(shù)對(duì)ic-ELISA影響明顯，濃度的過高或過低都會(huì)影響抗原抗體的結(jié)合，從而降低方法靈敏度，影響 Amax和曲線穩(wěn)定性。包被原和抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化結(jié)果如圖4a所示，選擇OD值為1.0～1.5的4對(duì)稀釋倍數(shù)組合（包被原稀釋倍數(shù)/抗體稀釋倍數(shù)：24000/1000、10000/3000、9000/9000、6000/12000）進(jìn)行分析比較，包被原及抗體稀釋倍數(shù)均為9000倍的Amax值最大、IC50值較小和 Amax/IC50值最大，綜合考慮選擇（9000，9000）這個(gè)組合作為包被原和抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

ic-ELISA是一種基于抗原與抗體的生物化學(xué)反應(yīng)，故在合適的溫度下，可提高抗原與抗體的結(jié)合反應(yīng)率。本研究比較了 37 ℃和 4 ℃兩種包被條件的Amax、Amax/IC50和 IC50，由圖 4b可知，Amax和Amax/IC50均相差不大，但37 ℃的IC50要比4 ℃的小，因此選其作為最佳包被溫度。

對(duì)抗體和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液進(jìn)行優(yōu)化可以降低空白值，提高方法準(zhǔn)確性。本研究將PBST、PBS、Tris-HCl三種稀釋液兩兩組合為9種搭配，如圖4（c1-c3）所示，抗體/標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液是 Tris-HCl/PBS溶液的組合IC50較低，Amax、Amax/IC50較高，因此選其作為抗體和藥物的最優(yōu)稀釋液組合。

對(duì)抗原抗體反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，可以提高方法的靈敏度及重復(fù)性，是實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究選取20、30、40、50和60 min五種競爭反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4d所示。由圖可知，在40 min時(shí)的IC50較小，Amax、Amax/IC50較大，因此選擇40 min作為抗原抗體的競爭時(shí)間。

在上述優(yōu)化的條件下，本研究對(duì)酶標(biāo)二抗稀釋液進(jìn)行優(yōu)化，可提高方法的穩(wěn)定性和靈敏度。本實(shí)驗(yàn)分析了三種不同稀釋液（PBS，PBST和Tris-HCl）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，由圖4e可得，酶標(biāo)二抗稀釋液為PBST溶液時(shí)的IC50值最低，Amax較高，Amax/IC50最高，因此選其作為最佳的酶標(biāo)二抗稀釋液。

2.4 ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)上述ic-ELISA條件優(yōu)化結(jié)果，得到PcAb-2C的包被原與抗體最佳稀釋倍數(shù)均為9000倍，包被溫度為37 ℃，最佳競爭反應(yīng)時(shí)間為40 min，抗體稀釋液為Tris-HCl，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為PBS，酶標(biāo)二抗稀釋液為 PBST。在此最佳反應(yīng)條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5所示，得到PcAb-2C的靈敏度良好（IC50為54.07 ng/mL，最低檢測(cè)限為7.22 ng/mL），相關(guān)系數(shù)為0.99，曲線擬合度好，線性范圍為12.56～282.62 ng/mL，線性范圍廣。與 Heged?s等[32]測(cè)得的靈敏度相比略低（IC50為1.89～15.04 ng/mL），但也處于良好范圍內(nèi)。

2.5 特異性鑒定

表1 氟樂靈與20種結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)Table 1 Cross-reaction data of trifluralin with 20 structural analogues

續(xù)表1

表2 ic-ELISA和GC-ECD測(cè)定的回收率和變異系數(shù)Table 2 Recovery rate and coefficient of variation determined by ic-ELISA and GC-ECD

用所建立方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定IC50值并計(jì)算交叉反應(yīng)率，考察所制備抗體對(duì)氟樂靈結(jié)構(gòu)類似藥物的識(shí)別能力，交叉反應(yīng)率越低，特異性越好。在20種與氟樂靈結(jié)構(gòu)或者功能相似的類似藥物檢測(cè)過程中（見表1），發(fā)現(xiàn)本研究所建立的檢測(cè)方法僅與FCRL和G-031有較高的交叉反應(yīng)率（15%以上），與其它18種類似物均在10%以下，甚至一半沒有產(chǎn)生交叉反應(yīng)，說明所建立方法特異性高。與Heged?s等[32]建立的酶聯(lián)免疫分析方法相比，本研究選取的結(jié)構(gòu)類似藥物范圍更廣（Heged?s等選取藥物17種），IPPL和PDTL的交叉反應(yīng)率更低，特異性更好。選取3個(gè)具有較高交叉反應(yīng)率的分子（氟樂靈、FCRL和G-031）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FCRL僅在N-丙基末端連接了-Cl（基團(tuán)體積和電負(fù)性增大）和G-031僅將三氟甲基換成-COOH（基團(tuán)體積增大但電負(fù)性降低），造成交叉反應(yīng)率降低，由此推測(cè) N-丙基和三氟甲基這兩個(gè)部位的基團(tuán)體積和電負(fù)性改變很可能會(huì)影響抗原抗體的識(shí)別。

2.6 添加回收實(shí)驗(yàn)與方法確證結(jié)果

本文以所建立的方法（ic-ELISA）為檢測(cè)手段，對(duì)鰻魚、對(duì)蝦、大豆、大豆油進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表 2所示。由表可知，ic-ELISA方法測(cè)得的PcAb-2C的平均回收率為89.8%～106.4%，GC-ECD方法測(cè)得的平均回收率為89.0%～108.2%，兩種方法的變異系數(shù)均小于10%。對(duì)ic-ELISA方法和GC-ECD方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析R2=0.99，相關(guān)性好，說明本研究建立的 ic-ELISA方法準(zhǔn)確度能達(dá)到檢測(cè)要求，適用于實(shí)際樣品中氟樂靈的高通量免疫快速檢測(cè)。Heged?s等[32]運(yùn)用所建立的酶聯(lián)免疫分析方法對(duì)胡蘿卜汁、南瓜汁和西紅柿汁進(jìn)行檢測(cè)，添加回收率約為50%～333.3%，與之相比本研究準(zhǔn)確度更高。

3 結(jié)論

本研究利用 3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯與仲胺側(cè)鏈氨基發(fā)生反應(yīng)制備氟樂靈半抗原，通過碳二亞胺法偶聯(lián)合成完全抗原并免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體PcAb-2C?；谏鲜鲅芯浚ㄟ^優(yōu)化包被原和抗體的稀釋倍數(shù)、包被溫度、抗體和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液等7個(gè)因素，建立了氟樂靈間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法。結(jié)果表明該方法的靈敏度良好（IC50為54.07 ng/mL，最低檢測(cè)限為7.22 ng/mL），曲線擬合度好（相關(guān)系數(shù)為0.99），線性范圍廣（IC20～I(xiàn)C80為 12.56～282.62 ng/mL），特異性高（20種氟樂靈結(jié)構(gòu)類似物中只有2種藥物的交叉反應(yīng)率大于 15%）。利用本研究所建立方法對(duì)大豆、大豆油、對(duì)蝦和鰻魚進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)，添加回收率為89.8%～106.4%，采用氣相色譜法（GC-ECD）進(jìn)行驗(yàn)證，添加回收率為 89%～108.2%，兩種方法的變異系數(shù)均小于 10%，兩種方法的一致性較高（R2=0.99）。以上數(shù)據(jù)表明本研究所建立方法具有靈敏度好、特異性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)要求[24]（食用油中氟樂靈最大殘留限量為 50 μg/kg），適用于農(nóng)（水）產(chǎn)品中氟樂靈農(nóng)藥殘留的高通量快速檢測(cè)，為氟樂靈試劑盒或試紙條的開發(fā)提供了理論依據(jù)。