胡 鵬 周煌輝 陳光靜 李安平

(1. 湖南中醫(yī)藥高等專科學校，湖南 株洲 412012；2. 貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州 貴陽 550005；3. 中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙 410004)

生物胺是一類含氮有機化合物的總稱，是合成蛋白質、核苷酸、生物堿、荷爾蒙和芳香類化合物等的前體物質，在食品中廣泛存在[1-3]。攝入少量的生物胺能提高免疫力、增強代謝活力、促進生長和清除自由基等，但是攝入含有高濃度生物胺的食物會對消費者的健康造成一定的風險，如引起頭痛、心悸、嘔吐、腹瀉和高血壓等[4-5]。組胺和酪胺是毒性最大的兩種生物胺，分別可以導致“鯖魚中毒”和“奶酪反應”的癥狀?！磅涺~中毒”通常是因為食用金槍魚、沙丁魚、鳳尾魚、鯖魚等魚類導致的，表現(xiàn)為面部、頸部和上臂發(fā)紅，口腔麻木、灼燒或者頭痛、心悸、哮喘發(fā)作、蕁麻疹、胃腸道癥狀以及吞咽困難。酪胺中毒稱為“奶酪反應”，表現(xiàn)為偏頭痛、心率加快、惡心、嘔吐、呼吸紊亂和血糖升高[6-8]。其余生物胺，2-苯乙胺、腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺攝入濃度過高時不僅會引起人體中毒，還可以抑制組胺和酪胺的代謝酶，從而增強組胺和酪胺的毒性[9]。盡管食用含有高濃度生物胺的食物會引起中毒，但目前對食物中生物胺的存在卻沒有統(tǒng)一的限量標準[10]。歐盟食品安全局對本地區(qū)發(fā)酵食品中生物胺進行了定量風險評估，規(guī)定水產品中組胺含量不得超過100 mg/kg，規(guī)定食品中酪胺含量不得超過100 mg/kg，美國FDA規(guī)定食品中組胺含量不得超過50 mg/kg[11]。生物胺根據化學結構，可以分為芳香族(酪胺和2-苯乙胺)、脂肪族(腐胺、尸胺、精胺和亞精胺)和雜環(huán)族(組胺和色胺)。

臘肉是腌臘制品中的典型代表和重要組成部分，是具有中國特色的一種傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品[12]。按照臘肉的生產地分類，可分為廣東臘肉、四川臘肉、湖南臘肉等[13-14]。湖南臘肉是一種發(fā)酵肉制品，而發(fā)酵肉制品中的生物胺一直受到食用安全性的質疑，但是目前未見湖南臘肉制品中生物胺測定的研究報道[15-16]。研究擬采集湖南臘肉制品，采用高效液相色譜法測定湖南臘肉制品中的8種生物胺含量，并檢測分析湖南臘肉制品中的水分含量、過氧化值和亞硝酸鹽含量等理化指標，為評估湖南臘肉制品中生物胺安全風險及品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臘肉制品：市售；

尸胺、色胺、腐胺、組胺、苯乙胺、精胺、亞精胺、酪胺、丹磺酰氯：純度>98%，美國Sigma公司；

碳酸氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、亞鐵氰化鉀、碘化鉀、三氯甲烷、冰乙酸、正己烷、氨水、石油醚、鹽酸萘乙二胺、乙醇、乙醚、氫氧化鉀：分析純，上海麥克林有限公司；

對氨基苯磺酸、硼酸鈉、硫酸銅：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色儀：LC-20A型，日本島津公司；

超聲波清洗器：KQ5200B型，昆山市超聲儀器有限公司；

電子分析天平：CPA225D型，德國賽多利斯科學儀器公司；

臺式高速離心機：H1850型，湖南湘儀離心機儀器有限公司；

六孔水浴鍋：HH-M6型，江蘇新春蘭儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制與柱前衍生 按孫霞等[17]的方法略做修改：準確稱取色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺和亞精胺各50 mg，用0.1 mol/L鹽酸定容到50 mL，并分別稀釋制成終質量濃度分別為0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，50.0 mg/L的混合標準溶液。取1 mL標準品混合溶液，加入200 μL NaOH(2 mol/L)，300 μL 飽和NaHCO3溶液，2 mL丹磺酰氯溶液(10 mg/mL 溶于丙酮)，混合均勻后在40 ℃黑暗中反應45 min，立即加入100 μL 25%氨水以終止反應，靜置30 min 后用乙腈定容至5 mL，最后用0.45 μm的有機濾膜過濾，用于分析檢測。

1.3.2 生物胺的提取 準確稱取絞碎后的湖南臘肉5.0 g 于50 mL離心管中，加入0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)20 mL，勻漿機上徹底勻漿，超聲提取30 min，8 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至50 mL容量瓶中，沉淀部分再提取一次，將兩次提取的上清液合并，再用0.4 mol/L的高氯酸(HClO4)定容至50 mL。移取上述樣品提取液10 mL于50 mL具塞離心管中，加入10 mL正己烷，渦旋振蕩3 min，靜置分層后棄去上層有機相，再重復脫脂一次即可獲得樣品生物胺提取液。取1 mL樣品提取液按標準溶液進行柱前衍生。

1.3.3 高效液相色譜分析條件 色譜柱使用Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，紫外檢測波長254 nm，高效液相色譜進樣體積為20 μL，流速1.0 mL/min，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.4 理化指標測定方法

(1) 水分：按GB 5009.3—2016執(zhí)行。

(2) 過氧化值：按GB 5009.227—2016執(zhí)行。

(3) 亞硝酸鹽：按GB 5009.33—2016執(zhí)行。

1.4 數據分析

所有試驗均重復3次，數據表示為平均值±標準差。使用SPSS Statistics 23軟件進行數據的線性回歸分析和相關性分析，結果采用Excel軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 生物胺標準品圖譜和標準曲線

由圖1可知，8種生物胺衍生物在25 min內全部出峰，分離效果好。其中，色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺的保留時間分別為9.607，11.734，12.492，13.516，14.192，18.369，19.311，23.356 min。

1. 色胺 2. 苯乙胺 3. 腐胺 4. 尸胺 5. 組胺 6. 酪胺 7. 亞精胺 8. 精胺

由表2可知，在0.1～50 μg/mL范圍內8種生物胺的質量濃度與峰面積的線性關系良好，其R2均在0.999 1以上。重復測定8次生物胺標準品，8種生物胺RSD均低于4.0%，表明具有良好的重復性。

表2 標準曲線的回歸方程、R2及精密度

2.2 市售湖南臘肉樣品中生物胺的種類和含量

由表3可知，8種生物胺中，僅色胺、尸胺2種生物胺在湖南臘肉部分樣品中未檢出。色胺含量的變化范圍為ND～8.46 mg/kg，苯乙胺含量的變化范圍為10.71～17.21 mg/kg，腐胺含量的變化范圍為15.37～40.59 mg/kg，尸胺含量的變化范圍為ND～80.36 mg/kg，組胺含量的變化范圍為0.43～10.24 mg/kg，酪胺含量的變化范圍為2.11～57.60 mg/kg，亞精胺含量的變化范圍為1.53～6.79 mg/kg，精胺含量的變化范圍為11.17～39.47 mg/kg，生物胺總量在臘肉中的含量范圍為127.22～166.24 mg/kg。

表3 湖南臘肉樣品中的生物胺含量?

由圖2可見，6種湖南臘肉樣品中尸胺的平均含量高于其他生物胺的，而色胺的最低。尸胺、腐胺、精胺、酪胺是湖南臘肉中的主要生物胺。組胺是8種生物胺中毒性最強的。歐盟規(guī)定除魚類外其他食品中組胺含量不得超過100 mg/kg[18]；美國食品和藥品監(jiān)督局確定食品中組胺含量應低于50 mg/kg[19]。湖南臘肉中組胺平均含量為4.84 mg/kg，在樣品中組胺范圍為0.43～10.214 mg/kg，其含量遠低于歐盟和美國食品和藥品監(jiān)督局的規(guī)定。酪胺是目前認為毒性僅次于組胺的生物胺。歐盟規(guī)定酪胺在食品中的限量為100 mg/kg[18]，在所檢樣品中酪胺均低于100 mg/kg。苯乙胺目前還沒有相應的限量標準，但有研究[20]表明苯乙胺超過30 mg會引起偏頭痛的反應。試驗采集的樣品中苯乙胺含量均低于30 mg/kg。Lu等[21]對中國的傳統(tǒng)中式香腸中生物胺進行了調查，發(fā)現(xiàn)酪胺、腐胺和尸胺是主要的生物胺，在香腸中14.28%的樣品生物胺總量超過美國食品和藥品監(jiān)督局規(guī)定的限量標準(1 000 mg/kg)，57.14%的樣品中酪胺的含量超過美國食品和藥品監(jiān)督局規(guī)定的限值(100 mg/kg)，11.9%的樣品中組胺含量超過美國食品和藥品監(jiān)督局規(guī)定的限值(50 mg/kg)，28.5%的樣品中苯乙胺含量超過30 mg/kg。孫霞等[17]研究了四川30種市售四川發(fā)酵香腸，發(fā)現(xiàn)尸胺、組胺、酪胺、腐胺是主要的生物胺，80%的樣品中組胺超過100 mg/kg，73%的樣品中酪胺的含量超過100 mg/kg，10%的樣品中生物胺總量超過1 000 mg/kg，76%的樣品中苯乙胺含量超過30 mg/kg。試驗結果與上述研究結果不同的原因可能與生產原料、發(fā)酵方法、加工條件以及生產工藝等有關。

圖2 臘肉中不同生物胺平均含量的比較

由圖3可知，不同湖南臘肉樣品中生物胺總量有差別但不大。有研究[22]表明，食品中生物胺總量大于1 000 mg/kg 會對人體造成損害。由圖3可知，所有臘肉樣品中生物胺總量均低于1 000 mg/kg。因此，食用湖南臘肉不會引起不良反應。

圖3 不同臘肉樣品中生物胺總量

2.3 理化指標

2.3.1 水分含量 由圖4可知，湖南臘肉樣品中水分含量檢出范圍為13.4%～22.4%。水分含量與微生物生長密切相關，水分含量高，微生物生長活動旺盛，在微生物作用下，游離氨基酸容易產生生物胺。所檢樣品水分含量在13%～23%，水分含量適中，對微生物生長有抑制作用，不利于生物胺的生成。

圖4 臘肉樣品中水分含量

2.3.2 過氧化值 過氧化值可衡量油脂酸敗程度，其值越高臘肉制品酸敗越嚴重。由圖5可知，湖南臘肉樣品中過氧化值范圍為0.014 2～0.035 0 g/100 g。GB 2730—2015《食品安全國家標準 腌臘肉制品》規(guī)定臘肉中過氧化值不超過0.50 g/100 g。因此，試驗樣品的過氧化值均符合國家標準。

圖5 臘肉樣品中過氧化值

2.3.3 亞硝酸鹽 由圖6可知，此次檢測的樣品中，所有被檢湖南臘肉制品均檢出了亞硝酸鹽，檢出率為100%，檢出范圍為2.15～7.50 mg/kg。GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》規(guī)定臘肉制品亞硝酸鹽殘留量不能超過30 mg/kg，所檢樣品均符合此標準要求。王新惠等[23]調查了四川腌臘肉制品中的亞硝酸鹽超標情況，發(fā)現(xiàn)15份樣品中，亞硝酸鹽殘留量遠低于30 mg/kg，合格率100%，與試驗得出的結論一致。亞硝酸鹽可以與尸胺、腐胺反應生成致癌物質亞硝胺，并能增強生物胺的毒性風險。因此必須嚴格控制亞硝酸鹽的含量，確保消費者的健康。

圖6 臘肉樣品中亞硝酸鹽含量

馬艷莉等[24]研究了白方腐乳開蓋后貯藏過程中生物胺和理化指標的變化，發(fā)現(xiàn)pH與苯乙胺呈顯著正相關，與其他生物胺之間呈弱相關，氨基態(tài)氮與苯乙胺、尸胺、組胺呈顯著正相關。吳訓忠等[25]研究了發(fā)酵辣椒中生物胺含量及其品質，表明生物胺含量與氨基酸態(tài)氮、總酸、還原糖含量之間未發(fā)現(xiàn)較強相關性。曾雪晴等[26]研究了市售郫縣豆瓣醬中生物胺與理化性質的相關性，發(fā)現(xiàn)郫縣豆瓣醬中生物胺含量與pH和總酸間沒有較強的相關性，只呈弱的相關，與鹽及氨基態(tài)氮含量間無相關性。試驗中湖南臘肉理化指標水分含量、過氧化值、亞硝酸鹽與生物胺含量之間的相關性不顯著，目前研究認為氨基酸態(tài)氮含量與生物胺含量之間可能存在一定關聯(lián)，尚需進一步研究。

3 結論

采用丹磺酰氯衍生，高效液相色譜—紫外檢測湖南臘肉制品中生物胺的含量，8種生物胺在25 min內良好分離。測定結果顯示，湖南臘肉制品中尸胺、腐胺、精胺、酪胺是主要的生物胺，生物胺總量在127.22～166.24 mg/kg。組胺含量低于50 mg/kg，酪胺含量均低于100 mg/kg。湖南臘肉生物胺含量均低于限定標準，在食用的安全水平之內。理化指標方面，樣品水分含量適中(13%～23%)，過氧化值和亞硝酸鹽均符合國家標準要求。研究中生物胺含量與水分、過氧化值、亞硝酸鹽之間未發(fā)現(xiàn)較強相關性。湖南臘肉中生物胺的形成受多種因素的影響，要確定生物胺形成的具體原因，還需要進一步研究氨基酸態(tài)氮和微生物對臘肉生物胺生成的具體影響。