蔡風(fēng)林，王梅芳，程雪琴，袁樂永，何金娟，胡雯雯，3，唐以軍

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，十堰 442000；3.錦州醫(yī)科大學(xué)十堰市太和醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，十堰 442000)

肺纖維化是一種由多種病因引起的以肺泡上皮細胞持續(xù)性損傷，成纖維及肌成纖維細胞過度增殖，細胞外基質(zhì)異常沉積和肺組織結(jié)構(gòu)病理性重構(gòu)為特征的慢性進行性間質(zhì)性肺部疾病[1-4]，其發(fā)病機制十分復(fù)雜，至今尚未完全闡明。大量研究表明肺泡上皮細胞發(fā)生的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肺纖維的重要發(fā)病機制之一[1-2，4]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)是重要的促纖維化因子[1-3]，能夠誘導(dǎo)肺泡上皮細胞、腎小管以及肝細胞等多種上皮細胞發(fā)生EMT[5]。由TGF-β1介導(dǎo)肺泡上皮細胞發(fā)生的EMT是肺纖維化時肺內(nèi)成纖維或肌成纖維細胞的重要來源，在此過程中TGF-β1促使肺泡上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致成纖維或肌成纖維細胞增多，細胞外基質(zhì)過度生成，從而促進肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[1-5]。異甘草素(isoliquiritigenin，ISL)是從中草藥甘草和青蔥的根中提取的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多方面的作用[3，6-10]，對多種疾病具有潛在的治療價值。此外，研究表明ISL可通過調(diào)控炎癥[6-9]、氧化應(yīng)激[8]、免疫反應(yīng)[10]、自噬[3]及成纖維細胞活化[3，6]等多種途徑抑制眼結(jié)膜、胰腺、心肌、腎、脂肪和肺等多臟器纖維化。但ISL能否通過調(diào)控肺泡上皮細胞EMT發(fā)揮抗肺纖維化作用的研究，筆者未見相關(guān)報道。因此，筆者在本研究以A549細胞作為研究對象，通過TGF-β1誘導(dǎo)其發(fā)生EMT構(gòu)建體外肺纖維化模型[2]，探討ISL對肺纖維化的作用及可能機制，以期為肺纖維化的臨床防治提供理論依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1主要藥物與試劑 ISL(Solarbio公司，批號：SI8220)；TGF-β1(Novoprotein公司，批號：CA59)；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)高糖培養(yǎng)基(Gibco公司，批號：8120324)；胎牛血清(FBS，Gibco公司，批號：2045521CP)；100X青霉素-鏈霉素溶液(Gibco公司，批號：2240831)；噻唑藍(MTT)粉末(Beyotime，批號：ST316)；Trizol(TaKaRa公司，批號：9109)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，批號：RR036A)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(TaKaRa公司，批號：RR820A)；全蛋白提取試劑盒(Solarbio公司，批號：BC3710)；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(Solarbio公司，批號：PC0020)；兔GAPDH單克隆抗體(CST，批號：5174)；兔Erk1/2單克隆抗體(CST，批號：4695)；兔p-Erk1/2單克隆抗體(CST，批號：9101)；兔上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)單克隆抗體(Abcam，批號：ab40772)；兔神經(jīng)型鈣粘蛋白(N-cadherin)單克隆抗體(Abcam，批號：ab76011)；兔波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(Abcam，批號：ab92547)；兔α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體(Abcam，批號：ab5694)；鼠纖維連接蛋白(FN)單克隆抗體(Santa Cruz，批號：SC-8422)；山羊抗兔IgG/辣根酶標記二抗(華安生物，批號：HA1001)；山羊抗小鼠IgG/辣根酶標記二抗(華安生物，批號：HA1006)。

1.2A549細胞培養(yǎng) 人肺泡Ⅱ型上皮A549細胞購于中國科學(xué)院上海細胞庫。將A549細胞置于37 ℃，5%二氧化碳(CO2)的恒溫細胞培養(yǎng)箱中，用含100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素及10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每2～3 d更換DMEM完全培養(yǎng)基1次，待細胞生長至90%～100%基本匯合狀態(tài)時按1：2或1：3進行消化傳代。

1.3體外肺纖維化模型的構(gòu)建 根據(jù)文獻[11-14]，選取10 ng·mL-1TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生EMT，構(gòu)建體外肺纖維化模型。將培養(yǎng)至對數(shù)期的A549細胞接種于6孔板中，待其生長至約50%，用無血清DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理24 h后，分為對照組(含DMEM完全培養(yǎng)液)及TGF-β1組(含10 ng·mL-1TGF-β1的DMEM完全培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)和Western blotting實驗檢測EMT相關(guān)蛋白表達情況，確定體外肺纖維化細胞模型是否構(gòu)建成功。

1.4MTT實驗檢測細胞增殖情況 將A549細胞制成單細胞懸液，按每孔100 μL(含細胞5×103個)接種于96孔板中，四周邊緣孔用磷酸鹽緩沖溶液填充。培養(yǎng)24 h待細胞完全貼壁，用無血清DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓處理24 h后，將A549細胞分為空白對照組 (無細胞及藥液 )、陰性對照組(含細胞，但無藥液 )、實驗組 (含10，20，40，60，80，100，200 μmol·L-1的ISL)。將含或不含10 ng·mL-1TGF-β1的各濃度ISL與A549細胞分別孵育24，48，72 h后，棄去培養(yǎng)液，向每孔中加入含有10%MTT(5 mg·mL-1)的無血清DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，向每孔中加入二甲亞砜100 μL，置搖床上低速晃動10 min后，使用酶標儀測量各孔在492 nm波長處吸光度(A值)。細胞抑制率(%)=(陰性對照組A值-實驗組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100%。根據(jù)計算得出的抑制率，選取作用于A549細胞的適宜ISL濃度。

1.5細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將A549細胞按每孔3.5×105種植于6孔板中，培養(yǎng)24 h，待細胞生長至100%基本融合時，用200 μL槍頭在6孔板細胞表面做“十”字垂直劃痕，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次后，將其分為對照組、TGF-β1組、TGF-β1+ISL組及ISL組。對照組加入含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基，其余組按分組要求加入用該培養(yǎng)基稀釋的藥物，0，24，48 h時采用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞遷移情況，并在倒置相差顯微鏡40倍條件下對其進行攝像，使用ImageJ軟件對所獲取的圖像進行分析。

1.6倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 將A549細胞以每孔1.5×105接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h，待A549細胞生長至約50%，用無血清DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓處理24 h后，分為對照組(含DMEM完全培養(yǎng)基) 、TGF-β1組(含10 ng·mL-1TGF-β1的DMEM完全培養(yǎng)基)、TGF-β1+ISL組(含10 ng·mL-1TGF-β1及60 μmol·L-1ISL的DMEM完全培養(yǎng)基)、ISL組(含60 μmol·L-1ISL的DMEM完全培養(yǎng)基)。在ISL及TGF-β1作用0，24，48，72 h時于倒置相差顯微鏡100倍條件下觀察各組細胞形態(tài)變化并拍照記錄。

1.7RT-PCR檢測EMT及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達 將A549細胞接種于6孔板中，按上述實驗分組干預(yù)48 h。根據(jù)Trizol說明書上步驟，提取各組細胞的RNA，收集于1.5 mL EP管中，在DNA/RNA濃度測定儀上測定RNA純度及濃度，再按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書上的步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成CDNA，最后按照熒光定量檢測試劑盒說明書操作步驟用RT-PCR法檢測EMT及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達情況，GAPDH作為內(nèi)參。RT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s 1個循環(huán)；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s 1個循環(huán)。各個基因的相對表達水平以 2( Ct內(nèi)參基因-Ct目的基因 )進行統(tǒng)計分析。RT-PCR檢測所用引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

1.8Western blotting檢測EMT相關(guān)蛋白及通路相關(guān)蛋白的表達 在ISL及TGF-β1干預(yù)A549細胞48 h后，提取細胞總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度后，取制備好蛋白樣品，按30 μg等量上樣，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳(80 V，40 min后轉(zhuǎn)為120 V，70 min)、半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜(恒壓20 V，40～60 min)、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h、一抗4 ℃孵育過夜、 TBST洗膜(5次，每次5 min)、二抗室溫孵育2 h、TBST洗膜(5次，每次5 min)，最后在蛋白印記檢測系統(tǒng)進行電致化學(xué)發(fā)光(electrochemilumin-escence，ECL)顯影。使用Image J軟件計算目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值，得到目的蛋白的相對灰度值進行分析。

2 結(jié)果

2.1TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞構(gòu)建體外肺纖維化模型 結(jié)果見圖1。與對照組比較，10 ng·mL-1TGF-β1刺激24，48，72 h后，A549細胞形態(tài)由鵝卵石樣多邊形上皮細胞向紡錘體樣長梭形間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變，細胞間隙變大，細胞與細胞間連接變得松散，呈現(xiàn)出成纖維細胞表型樣改變，在24，48 h時該現(xiàn)象較明顯。與對照組比較，A549細胞在10 ng·mL-1TGF-β1作用24，48，72 h后，上皮細胞標志物E-cadherin表達下調(diào)；間質(zhì)細胞標志物N-cadherin、FN、Vimentin、α-SMA表達上調(diào)，并且在TGF-β1刺激A549細胞48，72 h時該趨勢較明顯。

①與對照組比較，t=6.20～31.76，P<0.01；②與對照組比較，t=4.45，P<0.05。圖1 TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞構(gòu)建體外肺纖維化細胞模型①compared with control group，t=6.20-31.76，P<0.01；②compared with control group，t=4.45，P<0.05.Fig.1 TGF-β1 induces A549 cells to construct a lung fibrotic cell model in

2.2ISL抑制A549細胞增殖 結(jié)果見圖2。不同濃度ISL對A549細胞增殖活性產(chǎn)生明顯影響，隨著ISL給藥劑量的增加和作用時間的延長，ISL對A549細胞的增殖抑制率呈顯著上升趨勢。

圖2 ISL對A549細胞增殖活性的影響Fig.2 Effect of ISL on A549 cell proliferation

2.3ISL抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞增殖和遷移 與對照組比較，隨著作用時間的延長，TGF-β1組細胞存活率逐漸升高；與TGF-β1組比較，TGF-β1+ISL (0～200 μmol·L-1)組細胞隨ISL濃度增加及給藥時間的延長細胞活性逐漸降低，結(jié)果見圖3A。在10 ng·mL-1TGF-β1及60 μmol·L-1ISL作用A549細胞24，48 h后，與對照組比較，TGF-β1組細胞劃痕距離隨著作用時間的延長逐漸縮窄，ISL組細胞劃痕距離增寬；并且TGF-β1+ISL組與TGF-β1組比較，細胞劃痕距離也明顯增寬，見圖3B及3C。

①與對照組比較，t=5.59～26.19，P<0.01；②與對照組比較，t=3.85，P<0.05；③與TGF-β1組比較，t=13.6，17.7，P<0.01。圖3 ISL對TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞增殖及遷移的影響①compared with control group，t=5.59-26.19，P<0.01；②compared with control group，t=3.85，P<0.05；③compared with TGF-β1 group，t=13.6，17.7，P<0.01.Fig.3 Effect of ISL on the proliferation and migration of A549 cells induced by

2.4ISL抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞形態(tài)變化 與對照組比較，經(jīng)TGF-β1刺激的A549細胞形態(tài)變得細長，由原來緊密相連的鵝卵石狀上皮細胞逐漸轉(zhuǎn)變成連接松散的紡錘體樣長梭形細胞，細胞間隙變大且細胞間連接變得松散，呈現(xiàn)出間質(zhì)細胞樣表型特征，而ISL組細胞形態(tài)未見明顯改變；與TGF-β1組比較，TGF-β+ISL組細胞形態(tài)變得稍飽滿，更傾向于對照組鵝卵石狀上皮細胞形態(tài)，見圖4。

圖4 ISL對TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞形態(tài)的影響Fig.4 Effect of ISL on the morphology of A549 cells induced by TGF-β1

2.5ISL抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞EMT及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因mRNA的表達 與對照組比較，TGF-β1組上皮細胞標志物E-cadherin表達下調(diào)，間質(zhì)細胞標志物Vimentin、α-SMA、FN及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1、ZEB2表達上調(diào)，而ISL組E-cadherin表達上調(diào)，Vimentin、α-SMA、FN及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1、ZEB2表達下調(diào)；與TGF-β1組相比，TGF-β1+ISL組也是E-cadherin表達上調(diào)，Vimentin、α-SMA、FN及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1、ZEB2表達下調(diào)，見圖5。

A.對照組；B.TGF-β1組；C.TGF-β1+ISL組；D.ISL組；①與對照組比較，t=4.89～24.70，P<0.01；②與TGF-β1組比較，t=4.13～5.93，P<0.01；③與TGF-β1組比較，t=2.81～3.54，P<0.05。圖5 ISL對TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞中EMT及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達的影響A.control group；B.TGF-β1 group；C.TGF-β1+ISL group；D.ISL group；①compared with control group，t=4.89-24.70，P<0.01；②compared with TGF-β1 group，t=4.13-5.93，P<0.01；③compared with TGF-β1 group，t=2.81-3.54，P<0.05.Fig.5 Effect of ISL on the expression of EMT and EMT-related transcription factors in A549 cells induced by TGF-β1

2.6ISL抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞EMT相關(guān)蛋白及MAPK/Erk信號通路相關(guān)蛋白的表達 與對照組比較，TGF-β1組上皮細胞標志物E-cadherin表達下調(diào)，間質(zhì)細胞標志物N-cadherin、Vimentin、α-SMA、FN表達上調(diào)，而ISL組E-cadherin表達上調(diào)，N-cadherin、Vimentin、α-SMA、FN表達下調(diào)；與TGF-β1組比較，TGF-β1+ISL組也是E-cadherin表達上調(diào)，N-cadherin、Vimentin、α-SMA、FN表達下調(diào)。與對照組比較，TGF-β1組p-Erk/ErK水平顯著增加，ISL組P-Erk/Erk水平顯著下降；與TGF-β1組比較，TGF-β1+ISL組p-Erk/Erk水平也明顯減少，見圖6。

3 討論

研究表明，血小板衍生生長因子、TGF-β1、結(jié)締組織生長因子和腫瘤壞死因子等眾多細胞因子參與EMT過程，其中TGF-β1被認為是最重要的促纖維化細胞因子[15-16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠誘導(dǎo)A549細胞從緊密連接的鵝卵石樣上皮細胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檫B接疏松的紡錘體樣成纖維細胞，但TGF-β1作用A549細胞72 h細胞形態(tài)變化不如TGF-β1作用A549細胞24及48 h明顯，這可能是由于細胞培養(yǎng)較長時間后數(shù)量增多，但細胞生長空間有限，彼此間相互擠壓導(dǎo)致；經(jīng)Western blotting檢測，發(fā)現(xiàn)TGF-β1能減少上皮細胞標志物E-cadherin的表達，增加間質(zhì)細胞標志物FN、N-cadherin、Vimentin、a-SMA的表達，且48，72 h時該趨勢更明顯，表明TGF-β1能誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生EMT，成功構(gòu)建體外肺纖維化細胞模型。

TGF-β1誘導(dǎo)肺泡上皮細胞發(fā)生的EMT是肺纖維化重要的發(fā)病機制[17-18]。在該過程中具有極性和細胞間連接結(jié)構(gòu)的上皮樣表型細胞進行細胞骨架重組，細胞極性、細胞間緊密連接及黏附連接逐漸喪失，細胞遷移及侵襲能力增強，E-cadherin、細胞角蛋白19(CK-19)、胞質(zhì)緊密黏連蛋白-1(ZO-1)和α-連環(huán)蛋白 (α-Catenin)等上皮細胞標志物表達降低，N-cadherin、FN、Vimentin、α-SMA等間質(zhì)細胞標志物表達升高[18-21]，上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞，致使成纖維細胞增多，細胞外基質(zhì)過度生成，從而促進肺纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，ISL能阻止TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞形態(tài)由上皮細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)變，維護A549細胞上皮樣表型；ISL能提高TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞上皮標志物E-cadherin，降低間質(zhì)細胞標志物N-cadherin、Vi-mentin、α-SMA、FN的表達水平。這些結(jié)果表明ISL能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞的增殖、遷移及EMT進程，阻止A549細胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，減少肺成纖維細胞的生成，可能具有一定的抗肺纖維作用。

E-cadherin是分布于上皮細胞膜表面的典型上皮細胞標記物，它的表達隨著EMT的發(fā)展逐漸減少，是EMT過程中的關(guān)鍵事件[22]。據(jù)報道Snail、Slug、Twist、ZEB1和ZEB2是調(diào)控EMT過程的重要轉(zhuǎn)錄因子，它們不僅能與E-cadherin基因啟動子近端的E-box序列相互結(jié)合，直接或間接抑制E-cadherin的表達，而且還能通過其他途徑提高N-cadherin、Vimentin、FN等間質(zhì)細胞標志物的表達，促進EMT的發(fā)生[16，18，20，22-23]。研究證實抑制ZEB1的表達可干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞的EMT進程[18]，從而減輕肺纖維化。本研究結(jié)果顯示，ISL顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1及ZEB2 mRNA的表達，因此推測ISL可能通過下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達來抑制EMT進程，從而緩解肺纖維化。

細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，Erk)屬于MAPK家族重要一員，可參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等多種重要的細胞生理病理過程。MAPK/Erk信號通路在肺纖維化疾病中發(fā)揮著重要的作用，阻斷MAPK/Erk信號通路可抑制肺纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展[23-26]。有研究表明阻斷MAPK/Erk信號通路可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT及肺成纖維細胞的增殖、分化及ECM沉積[1，23]，從而緩解肺纖維化。本研究結(jié)果顯示TGF-β1促進p-Erk1/2的表達，而ISL抑制p-Erk1/2的表達，這表明TGF-β1激活了MAPK/Erk信號通路，ISL抑制了MAPK/Erk信號通路。ISL有可能通過抑制TGF-β1激活的MAPK/Erk信號通路抑制EMT，從而具有抗肺纖維化的潛在作用。

綜上所述， ISL能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞的EMT進程，維護A549細胞上皮樣形態(tài)，減少肺成纖維細胞的產(chǎn)生。由于本研究未進一步使用抑制劑阻斷MAPK/ErK信號通路，因此只能推測ISL可能通過調(diào)節(jié)MAPK/Erk信號通路抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞的EMT，進而緩解肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，其具體的作用機制還有待進一步研究。