翁晨祎,孟 林,葉來生,翁華宏

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康臨床醫(yī)學(xué)院,廣西 南寧 530011；2.廣西骨傷醫(yī)院關(guān)節(jié)科,廣西 南寧 530012)

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、活動(dòng)受限、畸形為主要特征的關(guān)節(jié)退行性疾病,其病因尚未完全明確,多與年齡、肥胖、炎癥、創(chuàng)傷及遺傳易感性等有關(guān)。流行病學(xué)調(diào)查顯示,骨關(guān)節(jié)炎好發(fā)于中老年人群,在65歲以上的人群中超過50%為骨關(guān)節(jié)炎患者[1]。目前骨關(guān)節(jié)炎的治療主要通過應(yīng)用非甾體抗炎藥和鎮(zhèn)痛藥、局部使用皮質(zhì)類固醇和黏性補(bǔ)充劑,控制疼痛和改善關(guān)節(jié)功能,但存在引發(fā)上消化道、腦、腎、心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。相比于上述治療方法,中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎具有簡(jiǎn)便易行、價(jià)格低廉、副作用小的優(yōu)勢(shì)[2]。蠲痹湯出自《醫(yī)學(xué)心悟》,由當(dāng)歸、獨(dú)活、肉桂、秦艽、海風(fēng)藤、羌活、川芎、桑枝、乳香、甘草、木香組成,主治風(fēng)寒濕三氣合而成之痹者,對(duì)治療骨關(guān)節(jié)炎具有較大的優(yōu)勢(shì)及潛力[3]。但蠲痹湯為中藥復(fù)方,成分、靶點(diǎn)較為復(fù)雜,其治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制尚未闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從藥物、靶點(diǎn)和疾病之間的相互關(guān)系出發(fā),進(jìn)行體外虛擬篩選潛在的藥物活性成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路,構(gòu)建“藥物—靶點(diǎn)—疾病”的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系,初步預(yù)測(cè)藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的學(xué)科[4]。分子對(duì)接是一項(xiàng)通過計(jì)算機(jī)程序輔助來預(yù)測(cè)大分子受體和小分子配體之間的結(jié)合模式及親和力的技術(shù)[5]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù),借助網(wǎng)絡(luò)生物、藥物數(shù)據(jù)庫(kù),預(yù)測(cè)蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵成分、核心靶點(diǎn)和主要通路,構(gòu)建“活性成分—治療靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,分析蠲痹湯潛在的作用機(jī)制,以期為未來實(shí)驗(yàn)研究及與其他臨床治療手段聯(lián)合使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 蠲痹湯活性成分與作用靶點(diǎn)的篩選

以口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18作為藥物活性成分的篩選指標(biāo),在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索篩選出當(dāng)歸、獨(dú)活、肉桂、秦艽、海風(fēng)藤、羌活、川芎、桑枝、乳香、甘草、木香這11味中藥復(fù)方的活性成分,并通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索篩選出中藥復(fù)方活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。將上述得到的靶點(diǎn)名稱通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)和Perl語言軟件(版本5.30.0.1)進(jìn)行處理轉(zhuǎn)化為靶基因名稱。

1.2 骨關(guān)節(jié)炎治療靶點(diǎn)的篩選

通過OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)和TTD數(shù)據(jù)庫(kù),以“osteoarthritis”為檢索關(guān)鍵詞,檢索骨關(guān)節(jié)炎的治療靶點(diǎn)。匯總4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)數(shù),應(yīng)用R語言軟件(版本4.0.2)合并去重得到骨關(guān)節(jié)炎的治療靶點(diǎn)。

1.3 蠲痹湯交集治療靶點(diǎn)的篩選

利用R語言軟件繪制藥物藥效靶點(diǎn)與疾病治療靶點(diǎn)的交集映射,得到“蠲痹湯—骨關(guān)節(jié)炎”交集靶點(diǎn)以及venn圖。

1.4 蠲痹湯“活性成分—治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖繪制

利用Cytoscape軟件(版本3.8.0)構(gòu)建“活性成分—治療靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)圖,中藥成分以節(jié)點(diǎn)1表示,治療靶點(diǎn)以節(jié)點(diǎn)2表示,連線表示相互作用的關(guān)系。將連線交集數(shù)量前5的活性成分作為本研究的關(guān)鍵活性成分。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

將蠲痹湯—骨關(guān)節(jié)炎的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù),以置信度得分>0.9分為條件篩選,并刪除圖中游離的蛋白節(jié)點(diǎn),繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。運(yùn)用Cytoscape軟件中CytoNCA插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,根據(jù)連接中心度、間距中心度、靠近中心度、特征向量中心度、網(wǎng)絡(luò)核心地位性和局部邊距連接度等指標(biāo)進(jìn)行篩選,首先篩選出在每個(gè)指標(biāo)中大于中位值的靶點(diǎn),得到次級(jí)核心靶點(diǎn)。將上述靶點(diǎn)再次進(jìn)行篩選,得到蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎的核心靶點(diǎn)。

1.6 基因本體(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析

利用R語言軟件將交集靶點(diǎn)基因轉(zhuǎn)換為entrezID后,按照P<0.05對(duì)其進(jìn)行過濾和富集分析,得到GO富集分析和KEGG富集分析的具體數(shù)據(jù),并分別繪制barplot柱狀圖。

1.7 分子對(duì)接

將“活性成分—治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中連線交集數(shù)量前5的活性成分與其對(duì)應(yīng)的12個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接(活性成分對(duì)應(yīng)的治療靶點(diǎn)中若不包含篩選出的核心靶點(diǎn)則不與其進(jìn)行分子對(duì)接),取最低連結(jié)自由能作為分子對(duì)接的結(jié)果,藥物小分子配體和靶點(diǎn)蛋白受體結(jié)合能越低,則配體和受體的結(jié)合力越強(qiáng)[5]。首先,通過PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取活性成分的小分子配體2D結(jié)構(gòu),利用ChemBioOffice Ultra軟件(2014版)將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)；然后,通過RCSB PDB平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得靶點(diǎn)的蛋白受體結(jié)構(gòu),利用PyMOL軟件(版本2.4.0)優(yōu)化去除水分子和小分子配體,利用AutoDockTools軟件(版本1.5.6)、AutoDockVina軟件(版本1.1.2)將配體、受體格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式,并確定活性口袋進(jìn)行分子對(duì)接；最后，利用PyMOL軟件(版本2.4.0)輸出圖像文件。

2 結(jié)果

2.1 蠲痹湯活性成分及靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共得到蠲痹湯活性成分165個(gè)；中藥復(fù)方的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)共9 635個(gè),見表1。利用Perl語言軟件篩選出中藥復(fù)方中活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)共2 529個(gè)。

表1 蠲痹湯“中藥—活性成分—靶點(diǎn)基因”(個(gè))

2.2 蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎的治療靶點(diǎn)

本研究共得到疾病治療靶點(diǎn)1 844個(gè),同時(shí)將藥物藥效靶點(diǎn)和疾病治療靶點(diǎn)取交集得到115個(gè)交集靶點(diǎn),利用R語言軟件輸出venn圖(圖1)。

圖1 蠲痹湯與骨關(guān)節(jié)炎的疾病靶基因交集

2.3 蠲痹湯“活性成分—治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將得到的115個(gè)交集靶點(diǎn)與165個(gè)活性成分輸入Cytoscape軟件,構(gòu)建“活性成分—治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),見圖2。根據(jù)連線交集數(shù)量分級(jí)排序,排序前5的活性成分為槲皮素(連線交集數(shù)量83)、山柰酚(連線交集數(shù)量32)、柚皮素(連線交集數(shù)量21)、甘草酮A(連線交集數(shù)量18)、刺芒柄花素(連線交集數(shù)量15)。提示這5個(gè)活性成分可能為蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵活性成分。

注：外圈圓形代表靶點(diǎn),內(nèi)部圓形代表活性成分,矩形代表藥物

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和核心靶點(diǎn)的篩選

本研究共得到PPI的節(jié)點(diǎn)105個(gè),邊476條(邊表示靶點(diǎn)蛋白的互作關(guān)系),見圖3a。將繪制的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件,利用CytoNCA插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行篩選,經(jīng)過兩次篩選得到核心靶點(diǎn)12個(gè),見圖3b。

a：蠲痹湯PPI網(wǎng)絡(luò)圖；b：PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)篩選

2.5 GO富集分析

GO富集分析共得到2 519個(gè)條目(P<0.05),其中生物過程2 306個(gè),分子功能144個(gè),細(xì)胞組成69個(gè)。在GO富集分析中,蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎的生物過程主要體現(xiàn)為脂多糖反應(yīng)、細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、活性氧類反應(yīng)等；分子功能主要體現(xiàn)為細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性等；細(xì)胞組成主要體現(xiàn)為薄膜筏、胞質(zhì)囊腔、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物等,取生物過程、分子功能、細(xì)胞組成中基因富集程度排名前10的條目制成柱狀圖,見圖4。

圖4 交集靶點(diǎn)GO富集分析柱狀圖

2.6 KEGG富集分析

KEGG富集分析共得到162條信號(hào)通路(P<0.05),列舉排名靠前的30條通路(圖5)以及富集程度排名前5的關(guān)鍵通路所涉及的基因,主要為AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路(表2)。IL-17信號(hào)通路是在蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎過程中聯(lián)系最為廣泛的通路,以此為例在該通路中標(biāo)記蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎發(fā)揮調(diào)控作用的靶點(diǎn)(圖6)。

圖5 交集靶點(diǎn)KEGG富集分析柱狀圖

注：紅色為上調(diào),綠色為下調(diào)

表2 蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎前5條關(guān)鍵通路涉及的基因分布

2.7 分子對(duì)接

5個(gè)關(guān)鍵活性成分和與之有映射的12個(gè)核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均<-6 kcal·mol-1(表3),表明蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵活性成分能與其對(duì)應(yīng)的核心靶點(diǎn)穩(wěn)定結(jié)合。將結(jié)果輸入PyMOL軟件,優(yōu)化圖形并輸出分子對(duì)接3D圖形,白色為小分子配體,其余為蛋白受體,選擇結(jié)合能最高的甘草酮A和STAT3進(jìn)行分子對(duì)接作為示例,見圖7。

表3 活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能(kcal·mol-1)

圖7 甘草酮A和STAT3的分子對(duì)接圖

3 討論

3.1 骨關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)治療

中醫(yī)認(rèn)為“骨痹”有兩個(gè)重要成因：一為風(fēng)邪、寒邪、濕邪外邪作祟,外邪致氣血瘀塞不通,故而導(dǎo)致痹癥；二為七情內(nèi)傷內(nèi)因所困,其內(nèi)情志不舒則氣血運(yùn)行不暢而致痹癥。蠲痹湯具有祛風(fēng)除濕、蠲痹止痛的功效[6]。在近年的臨床研究中,蠲痹湯對(duì)治療“骨痹”有著較好的療效,并且應(yīng)用也逐漸廣泛[3],但其潛在的藥理學(xué)機(jī)制尚未明確,因此,本研究通過運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)來探討蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在藥理學(xué)機(jī)制。

3.2 蠲痹湯通過抗炎、抗凋亡、調(diào)控軟骨細(xì)胞代謝和促進(jìn)軟骨下骨重建等治療骨關(guān)節(jié)炎

本研究通過構(gòu)建“活性成分—治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,篩選出槲皮素、山柰酚、柚皮素、甘草酮A、刺芒柄花素可能為蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵活性成分，通過PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選,得到STAT3、TNF、MAPK14等12個(gè)有潛力治療骨關(guān)節(jié)炎的核心靶點(diǎn)。

在骨關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程中,始終圍繞著幾個(gè)密不可分的因素：炎癥反應(yīng)、軟骨的破壞、軟骨下骨重建以及軟骨細(xì)胞的代謝與凋亡[7],而本研究篩選出的5個(gè)關(guān)鍵活性成分在這一病理進(jìn)程中分別能起到不同的作用。首先,軟骨細(xì)胞的凋亡是骨關(guān)節(jié)炎的主要誘因之一,而氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則會(huì)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。一項(xiàng)骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型研究表明,槲皮素抗凋亡效應(yīng)中的一個(gè)潛在機(jī)制是能通過調(diào)節(jié)SIRT1-AMPK信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),從而在一定程度上減緩軟骨細(xì)胞凋亡[8]。炎癥反應(yīng)除了會(huì)促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡,也會(huì)促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。在多種促炎因子的影響下,骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞和軟骨微環(huán)境會(huì)發(fā)生改變,從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞功能障礙[9]。山柰酚除了具有抗細(xì)胞凋亡的作用外[10],還可預(yù)防脂多糖引起的炎癥反應(yīng),其作用機(jī)制可能與山柰酚下調(diào)miR-146a保護(hù)軟骨ATDC5細(xì)胞免受脂多糖介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),以及抑制核心蛋白聚糖的表達(dá)有關(guān)[11]。而在抗炎作用方面,有研究表明甘草酮A可以通過激活Nrf2信號(hào)通路介導(dǎo)抑制IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[12]。另有研究表明,刺芒柄花素能有效拮抗IL-1β誘導(dǎo)的分解代謝,通過抑制軟骨降解酶、炎癥介質(zhì)、促炎細(xì)胞因子來延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的進(jìn)展,從而發(fā)揮治療骨關(guān)節(jié)炎的作用[13]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究構(gòu)建的小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中,柚皮素被證明可通過調(diào)節(jié)NF-κB通路來抑制MMPs介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨退變,從而減輕骨關(guān)節(jié)炎的癥狀[14]。本研究PPI網(wǎng)絡(luò)表明，TNF、STAT3可能是蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎的核心靶點(diǎn)。TNF作為骨關(guān)節(jié)炎的主要致炎細(xì)胞因子,與推動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)[7,15]。在STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分解代謝過程中,STAT3為IL-6下游的主要信號(hào)因子,可促進(jìn)MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4以及ADAMTS-5的表達(dá),從而加速軟骨退化[15]。IL-6是人軟骨細(xì)胞中NF-κB通路的直接靶基因,而柚皮素可以通過此通路發(fā)揮治療骨關(guān)節(jié)炎的作用[14]。因此,蠲痹湯可能通過柚皮素作用于NF-κB通路并下調(diào)IL-6來抑制STAT3信號(hào)因子,進(jìn)而延緩軟骨退化進(jìn)程,達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎的目的。基于以上結(jié)果可推測(cè),蠲痹湯主要通過槲皮素、山柰酚、甘草酮A、刺芒柄花素和柚皮素發(fā)揮抗凋亡、抗炎、調(diào)控軟骨細(xì)胞代謝等作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療。同時(shí),結(jié)合本研究“活性成分—治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)可以發(fā)現(xiàn),不同活性成分有共同的治療靶點(diǎn),且不同靶點(diǎn)之間存在復(fù)雜的關(guān)聯(lián)。蠲痹湯治療骨關(guān)節(jié)炎并不是通過單一靶點(diǎn)或單一活性成分發(fā)揮調(diào)控作用,而是在“多成分—多靶點(diǎn)”共同調(diào)控下治療骨關(guān)節(jié)炎。本研究中蠲痹湯的5個(gè)關(guān)鍵活性成分和與之有映射的12個(gè)核心靶點(diǎn)對(duì)接的結(jié)合能均<-6 kcal·mol-1,說明該中藥復(fù)方的關(guān)鍵成分與其核心靶點(diǎn)有較好的結(jié)合能力,可穩(wěn)定地協(xié)同發(fā)揮治療作用。

本研究KEGG富集分析結(jié)果顯示,蠲痹湯和多條信號(hào)通路有關(guān),其中與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的主要有TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路。TNF信號(hào)通路可通過調(diào)控NF-κB和MAPK兩條關(guān)鍵信號(hào)通路減少炎癥因子的分泌,從而延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[16]。IL-17信號(hào)通路則可通過調(diào)控IL-17來減緩MMPs的合成以及IL-6的產(chǎn)生,從而在一定程度上阻止軟骨被破壞[17-19]。而p38-MAPK則被認(rèn)為可能是IL-17和TNF-α之間協(xié)同信號(hào)的靶點(diǎn)[20],除了影響轉(zhuǎn)錄和RNA的穩(wěn)定性,還可能會(huì)影響染色質(zhì)重塑、細(xì)胞因子分泌和其他基因或蛋白水平的調(diào)節(jié),對(duì)軟骨下骨重建起著關(guān)鍵作用[21]。因此,通過調(diào)控IL-17信號(hào)通路可減少炎癥因子和蛋白水解酶的合成,并促進(jìn)軟骨下骨重建,對(duì)于延緩和治療骨關(guān)節(jié)炎具有重要作用。PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在延緩炎癥、調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡等方面起著關(guān)鍵作用[22]。PI3K激活可導(dǎo)致下游AKT磷酸化,進(jìn)而調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2和caspase-3等凋亡相關(guān)因子的表達(dá)[23]。mTOR是AKT的下游靶點(diǎn)和自噬的負(fù)調(diào)節(jié)因子[24],且mTOR通路的失活會(huì)誘導(dǎo)自噬,這對(duì)細(xì)胞的新陳代謝和穩(wěn)定性至關(guān)重要[25-26]。因此,通過調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路可以下調(diào)該通路相關(guān)凋亡因子并誘導(dǎo)自噬，清除軟骨細(xì)胞受損的細(xì)胞器和長(zhǎng)效大分子,維持軟骨細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),增加基質(zhì)合成,從而減緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。在HIF-1信號(hào)通路中,有研究認(rèn)為HIF-1α誘導(dǎo)自噬的機(jī)制可能與調(diào)控Beclin-1/Bcl2復(fù)合體以及AMPK酶的激活有關(guān),從而抑制mTOR[27-28]。自噬除了上述提到的作用,也可能通過作用于線粒體代謝從而減少相關(guān)氧化應(yīng)激反應(yīng)，因此恢復(fù)自噬也可以被認(rèn)為是一定程度上延緩了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[26，29]。有研究發(fā)現(xiàn),肥胖能夠引起炎癥反應(yīng),并且增加2型糖尿病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),AGE-RAGE信號(hào)通路中的關(guān)鍵成分AGEs及RAGE則被認(rèn)為是引起糖尿病以及促進(jìn)炎癥發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[30-32]。糖尿病會(huì)損害骨細(xì)胞的新陳代謝和功能[33],但是肥胖與骨關(guān)節(jié)炎之間的具體機(jī)制尚不完全清楚。有研究表明,機(jī)械因素和代謝因素是骨關(guān)節(jié)炎的主要誘因,肥胖患者的骨關(guān)節(jié)長(zhǎng)時(shí)間暴露于沉重的機(jī)械壓力下,負(fù)荷增加會(huì)抑制軟骨基質(zhì)的合成,并誘導(dǎo)促炎因子和Ca2+-ERK-NF-κB信號(hào)通路,加快骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[34]。因此,蠲痹湯通過調(diào)控AGE-RAGE信號(hào)通路來治療肥胖患者代謝性骨關(guān)節(jié)炎值得進(jìn)一步研究。以上結(jié)果顯示,蠲痹湯可通過調(diào)控TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路參與抗凋亡、抗炎、調(diào)控軟骨細(xì)胞的代謝和促進(jìn)軟骨下骨重建,從而發(fā)揮對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。同時(shí),結(jié)合本研究排名前5的關(guān)鍵通路所涉及的基因和IL-17信號(hào)通路圖可以發(fā)現(xiàn)，治療骨關(guān)節(jié)炎的同一靶點(diǎn)在不同通路中都起著調(diào)控作用,由此可以推測(cè),蠲痹湯可能通過多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同發(fā)揮治療作用。

3.3 中藥與組織工程研究

近年來中藥(包含蠲痹湯在內(nèi)的眾多復(fù)方)聯(lián)合應(yīng)用組織工程技術(shù)能很好地解決單獨(dú)應(yīng)用組織工程技術(shù)時(shí)出現(xiàn)的部分問題[35]。而基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)的探究則可以為找到合適的中藥復(fù)方提供指導(dǎo)。

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多能基質(zhì)細(xì)胞,能夠自我更新并分化為間充質(zhì)組織譜系,包括骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉和骨髓基質(zhì),是組織工程中理想的軟骨修復(fù)種子細(xì)胞[36-37]。目前,間充質(zhì)干細(xì)胞已被證明對(duì)骨關(guān)節(jié)炎有較好的臨床療效[38],但也存在軟骨修復(fù)率低、軟骨細(xì)胞表型不穩(wěn)定、異體移植排斥等問題[37]。IL-35是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子,其可通過增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能,抑制輔助性T細(xì)胞1和輔助性T細(xì)胞17的增殖能力,發(fā)揮免疫抑制作用,有IL-35表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞有望成為治療同種異體移植排斥反應(yīng)的新途徑[39]。有研究表明,蠲痹湯在治療局部炎癥的同時(shí)還能夠提高IL-35的水平[40]。在下一步的臨床試驗(yàn)中,蠲痹湯聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞異體移植修復(fù)骨關(guān)節(jié)軟骨損傷將會(huì)是一個(gè)新的可行的研究思路。

3.4 小結(jié)

綜上所述,蠲痹湯可能通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的相互作用發(fā)揮對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。這為蠲痹湯下一步的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供了新的研究思路。本研究也存在以下不足：由于中醫(yī)辯證論治的特點(diǎn),蠲痹湯治療不同證型骨關(guān)節(jié)炎的具體劑量比例會(huì)有變化,進(jìn)而在一定程度上會(huì)導(dǎo)致功效不同；未收集到足夠臨床數(shù)據(jù)將骨關(guān)節(jié)炎模型進(jìn)一步細(xì)化,將不同證型與不同方藥劑量進(jìn)行對(duì)應(yīng)加權(quán)處理。中藥復(fù)方并不是簡(jiǎn)單的單個(gè)活性成分的疊加,而是多成分—多靶點(diǎn)的協(xié)同作用,多個(gè)活性成分之間的協(xié)同作用以及活性成分對(duì)靶點(diǎn)的激活或抑制都需要發(fā)展相對(duì)應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)算法來進(jìn)行量化標(biāo)準(zhǔn)[41],這將是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)未來需完善的方向。相信隨著人工智能、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)的日趨進(jìn)步,中藥及其復(fù)方能更好地與組織工程相結(jié)合運(yùn)用于臨床。