辛禮輝，田云霄，吳士茜，孫 穎，王 靜，鄭神英

(邯鄲市中心醫(yī)院病理科，河北 邯鄲 056000)

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率逐年升高且呈年輕化趨勢(shì)[1]。大部分子宮內(nèi)膜癌臨床癥狀典型，表現(xiàn)為陰道不規(guī)則出血、陰道排液等，早期易發(fā)現(xiàn)，但對(duì)于復(fù)發(fā)、晚期或特殊病理類型的子宮內(nèi)膜癌，目前尚缺乏有效的治療手段。近年來，靶向藥物在各類腫瘤的治療中均有較好的效果，但其在婦科腫瘤中的研究相對(duì)滯后[2]。具有DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)缺陷的腫瘤可以采用多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)抑制劑替代治療[3]。研究表明，DNA損傷檢查點(diǎn)蛋白調(diào)節(jié)子1(mediator of DNA damage checkpoint protein 1，MDC1)在早期DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用[4]。DNA錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)途徑可以識(shí)別和糾正DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的非沃森—克里克堿基對(duì)和插入/缺失環(huán)[5]。MMR去除在重組過程以及DNA的化學(xué)修飾過程中出現(xiàn)的堿基對(duì)錯(cuò)配和分支DNA中起到重要作用[6]。因此，本研究通過檢測(cè)MDC1和MMR蛋白表達(dá)，分析其與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理特征的關(guān)系，以期為該病的臨床治療提供一定依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選取2012年至2016年我院病理科收治的126例子宮內(nèi)膜癌患者的手術(shù)或刮宮標(biāo)本，收集患者的臨床及病理資料，包括年齡、組織學(xué)類型、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、肌層浸潤深度等?；颊吣挲g30～76歲，中位年齡58歲；術(shù)后隨訪5～67個(gè)月，中位時(shí)間58個(gè)月。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前均未接受新輔助化療，術(shù)后證實(shí)為子宮內(nèi)膜癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤。

1.2 試劑

MDC1抗體購自abcam公司(1∶300稀釋)；MMR蛋白相關(guān)抗體，包括減數(shù)分裂后分離蛋白2(postmeiotic segregation increased 2，PMS2)、鼠抗人MutL同源蛋白1(MutL homolog 1，MLH1)、MutS同源蛋白2(MutS homolog 2，MSH2)、MutS同源蛋白6(MutS homolog 6，MSH6)，辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠兔專用抗體，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)，DAB顯色液，蘇木精等均購自福州邁新生物科技公司;石蠟組織標(biāo)本均由我院病理科提供。

1.3 免疫組化染色和HE染色

選取組織蠟塊作厚度4 μm連續(xù)切片，分別行免疫組化染色和HE染色，免疫組化染色嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照試劑，淋巴細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞作為內(nèi)對(duì)照。HE染色采用萊卡全自動(dòng)染色機(jī)嚴(yán)格按流程操作。以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)明確棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算MDC1、MMR(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)蛋白陽性細(xì)胞率。細(xì)胞核中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2陽性表達(dá)均出現(xiàn)棕黃色著色(且陽性率≥5%)，即判斷為MMR表達(dá)完整(MMR-proficient，MMR-p)；若有1種或幾種抗體出現(xiàn)陰性表達(dá)(陽性率<5%)，則判定為MMR表達(dá)缺失(MMR-deficient，MMR-d)。細(xì)胞核中MDC1陽性表達(dá)出現(xiàn)棕黃色顆粒(且陽性率≥5%)，即判為陽性，否則為陰性。由我院病理科3名醫(yī)師閱片判讀結(jié)果，如有爭議則于多頭顯微鏡下共同討論。分析MDC1、MMR蛋白表達(dá)及結(jié)合兩種蛋白不同表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖分析MDC1和MMR蛋白聯(lián)合檢測(cè)與總生存率的關(guān)系，并分析MDC1與MMR蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 IBM軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)；定性資料采用χ2或Fisher精確檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法，行Log-Rank檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)性分析。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDC1、MMR蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

126例患者中，MDC1陰性表達(dá)12例，MDC1陽性表達(dá)114例。與MDC1陽性表達(dá)患者相比，MDC1陰性表達(dá)患者年齡較小，主要為低級(jí)別(1～2級(jí))子宮內(nèi)膜樣腺癌(P<0.05)；MDC1陰性表達(dá)患者與MDC1陽性表達(dá)患者臨床分期、肌層浸潤深度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與MMR-p患者相比，MMR-d患者年齡較小，主要為低級(jí)別(1～2級(jí))子宮內(nèi)膜樣腺癌(P<0.05)；MMR-p患者與MMR-d患者臨床分期、肌層浸潤深度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 MDC1、MMR蛋白表達(dá)與臨床特征表達(dá)的關(guān)系

2.2 MDC1與MMR蛋白不同表達(dá)結(jié)合與臨床特征的關(guān)系

MDC1與MMR蛋白表達(dá)配對(duì)分組：MDC1(+)/MMR-p有102例，MDC1(-)/MMR-p有2例，MDC1(+)/MMR-d有12例，MDC1(-)/MMR-d有10例。各組患者年齡、組織學(xué)類型、組織學(xué)分級(jí)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而臨床分期、肌層浸潤深度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 MDC1與MMR蛋白不同表達(dá)結(jié)合與臨床特征的關(guān)系

2.3 MDC1、MMR蛋白聯(lián)合檢測(cè)的生存分析

126例患者中，45例復(fù)發(fā)或死亡，其中MDC1(+)/MMR-p有36例，MDC1(-)/MMR-p有1例，MDC1(-)/MMR-d有2例，MDC1(+)/MMR-d有6例。總體生存曲線顯示，MDC1、MMR蛋白聯(lián)合檢測(cè)與總生存率無關(guān)(Log-Rank=0.976，P=0.807)，見圖1。

圖1 患者總體生存曲線

2.4 MDC1與MMR蛋白表達(dá)及其相關(guān)性分析

126例患者中，MDC1陰性表達(dá)12例；MDC1陽性表達(dá)114例，其中強(qiáng)陽性表達(dá)82例，占子宮內(nèi)膜樣腺癌的60%(53/89)，占非子宮內(nèi)膜樣腺癌的78%(29/37)，弱陽性表達(dá)32例，占子宮內(nèi)膜樣腺癌的27%(24/89)，占非子宮內(nèi)膜樣腺癌的22%(8/37)，見圖2。MMR蛋白陰性表達(dá)22例，其中PMS2陰性表達(dá)6例，PMS2、MLH1陰性表達(dá)10例，PMS2、MSH2陰性表達(dá)1例，MSH6陰性表達(dá)3例；MSH2、MSH6陰性表達(dá)2例；MMR蛋白陽性表達(dá)104例。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MDC1陰性表達(dá)與MMR-d呈正相關(guān)(r=0.563，P<0.001)。

a：MDC1陰性表達(dá)；b：MDC1弱陽性表達(dá)；c：MDC1強(qiáng)陽性表達(dá)

3 討論

Bokhman[7]于1983年首次提出“二元論”假說，并將子宮內(nèi)膜癌分為雌激素依賴型(Ⅰ型)和非雌激素依賴型(Ⅱ型)。Ⅰ型包括大部分的子宮內(nèi)膜樣腺癌，Ⅱ型包括3級(jí)子宮內(nèi)膜樣腺癌、漿液性腺癌與透明細(xì)胞癌等非子宮內(nèi)膜樣腺癌。隨著對(duì)腫瘤分子機(jī)制的深入研究，許多學(xué)者開始對(duì)子宮內(nèi)膜癌不同組織學(xué)類型的分子改變進(jìn)行研究。癌癥基因組圖譜根據(jù)拷貝數(shù)和基因組圖譜將373例子宮內(nèi)膜癌分為DNA聚合酶ε(polymerase epsilon，POLE)超突變型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定高突變型、高拷貝數(shù)型和低拷貝數(shù)型[8]。大部分子宮內(nèi)膜樣腺癌為微衛(wèi)星不穩(wěn)定高突變型，其存在其他基因突變(高突變基因組)，DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制基因就是其中之一[9]。MDC1通過非同源末端連接反應(yīng)和同源重組途徑在DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制中發(fā)揮重要作用[10]。MMR機(jī)制、PI3K-PTEN-AKT途徑以及P53途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷對(duì)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展有重要影響[11]。因此，本研究探討MDC1和MMR蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況及其與相關(guān)臨床特征的關(guān)系。

MDC1作為DNA損傷早期效應(yīng)物，是DNA雙鏈斷裂同源重組修復(fù)的重要物質(zhì)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，MDC1突變的小鼠會(huì)出現(xiàn)對(duì)輻射敏感、染色體不穩(wěn)定、免疫缺陷等各種失調(diào)[12]。Bartkova等[13]發(fā)現(xiàn)，在正常乳腺組織和肺組織中MDC1普遍表達(dá)，但在乳腺癌細(xì)胞中30%的MDC1失表達(dá)，肺癌細(xì)胞中26%的MDC1失表達(dá)，并且與其下游效應(yīng)分子53BP1表達(dá)一致。但Yuan等[14]的研究顯示，60%宮頸癌患者的MDC1表達(dá)上調(diào)。同樣，MDC1在喉癌腫瘤組織中的陽性表達(dá)率為56%，但其在正常組織中的陽性表達(dá)率僅為27%[15]。有研究表明，乳腺癌組織中MDC1的表達(dá)缺失與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，9.5%(12/126)的子宮內(nèi)膜癌患者M(jìn)DC1表達(dá)為陰性，均為子宮內(nèi)膜樣腺癌，該類患者平均年齡較MDC1陽性表達(dá)患者小，且MDC1陽性表達(dá)患者出現(xiàn)強(qiáng)弱不等，強(qiáng)陽性表達(dá)患者占非子宮內(nèi)膜樣腺癌的78%(29/37)，而占子宮內(nèi)膜樣腺癌的60%(53/89)；弱陽性表達(dá)患者占非子宮內(nèi)膜樣腺癌的22%(8/37)，占子宮內(nèi)膜樣腺癌的27%(24/89)。陰性表達(dá)患者全部為子宮內(nèi)膜樣腺癌，提示MDC1失表達(dá)可能與組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，并且與子宮內(nèi)膜樣腺癌密切相關(guān)；但MDC1不同表達(dá)在臨床分期和肌層浸潤深度中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MDC1失表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌的浸潤和轉(zhuǎn)移無關(guān)。

MMR蛋白表達(dá)缺失可導(dǎo)致DNA堿基配對(duì)無法校正，引起具有微衛(wèi)星短串聯(lián)重復(fù)序列長度改變，導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)，MMR蛋白免疫組化結(jié)果與微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測(cè)結(jié)果高度一致[17]。且免疫組化檢測(cè)操作簡單，可在病理科進(jìn)行。有研究表明，MMR-d型子宮內(nèi)膜癌常為高級(jí)別子宮內(nèi)膜樣腺癌，突變率高，患者預(yù)后不良[18-19]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，MMR-d型子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后較好[20]。本研究結(jié)果顯示，MMR-d型子宮內(nèi)膜癌占所有子宮內(nèi)膜癌患者的17.4%，而其中90.9%為子宮內(nèi)膜樣腺癌，組織學(xué)分級(jí)低，可能是由入組的子宮內(nèi)膜樣腺癌患者的比例偏大造成；其中PMS2陰性表達(dá)6例，PMS2、MLH1陰性表達(dá)10例，PMS2、MSH2陰性表達(dá)1例，MSH6陰性表達(dá)3例，MSH2、MSH6陰性表達(dá)2例，與國外Cohn等[21]的研究結(jié)果不一致，該研究中MSH2表達(dá)缺失率最高；但與國內(nèi)晉薇等[22]研究結(jié)果一致，該研究結(jié)果顯示，PMS2表達(dá)缺失率最高，其次為MLH1。造成這種差異的原因可能與種族、選取入組的子宮內(nèi)膜癌類型的比例、患者入院時(shí)的臨床分期等有關(guān)。有研究表明，MMR-d型子宮內(nèi)膜癌具有不同的治療方式和預(yù)后，對(duì)鉑類藥物抵抗[23]。因此，本研究采用免疫組化法篩選出具有MMR-d表型的子宮內(nèi)膜癌，研究MMR-d型子宮內(nèi)膜癌與MDC1表達(dá)的關(guān)系，以期為MMR-d型子宮內(nèi)膜癌患者的治療提供新的理論依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，MMR-d與患者的肌層浸潤深度和臨床分期無關(guān)，提示MMR蛋白在子宮內(nèi)膜癌預(yù)后評(píng)估中可能需要結(jié)合其他指標(biāo)共同判斷，與何亞等[24]的報(bào)道一致。

MDC1表達(dá)下調(diào)可影響DNA損傷修復(fù)，從而影響同源重組[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，存在同源重組DNA修復(fù)機(jī)制缺陷的腫瘤對(duì)PARP抑制劑敏感[26]。而子宮內(nèi)膜癌是攜帶高同源重組突變基因的一類腫瘤[2]。磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)參與機(jī)體的同源重組修復(fù)，其在子宮內(nèi)膜樣腺癌中常失表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞對(duì)PARP治療更加敏感。在體外實(shí)驗(yàn)和臨床上，具有生殖細(xì)胞BRCA1/2基因功能缺陷的實(shí)體腫瘤采用PARP抑制劑治療可使患者獲益[27]。研究表明，MDC1低表達(dá)的鼻咽癌聯(lián)合PARP抑制劑治療，可提高對(duì)奧拉帕尼的敏感性[25]。本研究中MDC1在部分患者中失表達(dá)或弱表達(dá)，提示子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中可能存在同源重組DNA修復(fù)機(jī)制缺陷，而存在同源重組DNA修復(fù)機(jī)制缺陷的腫瘤對(duì)PARP抑制劑敏感[26]，因此MDC1的檢測(cè)可能對(duì)臨床晚期、復(fù)發(fā)或特殊病理類型的子宮內(nèi)膜癌的治療選擇有益，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果顯示，MDC1、MMR蛋白聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果與患者總生存率無關(guān)，可能是納入的樣本量小所致，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證；但在聯(lián)合檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)，MDC1陰性表達(dá)和MMR-d呈正相關(guān)，提示MDC1和MMR蛋白在DNA損傷修復(fù)中可能起到相互協(xié)助的作用，同時(shí)MDC1的表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性有關(guān)。

綜上所述，MDC1和MMR蛋白多在年輕患者及低級(jí)別子宮內(nèi)膜樣腺癌中失表達(dá)，但與臨床分期及肌層浸潤深度無明顯相關(guān)性；MDC1陰性表達(dá)和MMR-d呈正相關(guān)，提示MDC1的失表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性密切相關(guān)。