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        濟(jì)陰顆粒對雌性冠心病大鼠脂代謝的影響

        2022-01-21 02:02:48王若冰
        西部中醫(yī)藥 2021年8期
        關(guān)鍵詞:脂質(zhì)主動脈批號

        黃 赫,齊 越,王若冰,張 瑜,趙 磊△

        1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,遼寧 沈陽 110034;2 江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校

        冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心?。┦亲畛R姷男难芗膊。?],是婦女死亡的主要原因之一[1-2]。相關(guān)研究[3-6]表明,絕經(jīng)前女性冠心病的發(fā)病率較低,癥狀不典型,因此,探討冠心病的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制,尤其是女性冠心病的發(fā)病機(jī)制已迫在眉睫,而在分子水平上對冠心病進(jìn)行研究是一種其有前沿性的研究方法[7]。

        脂代謝紊亂常伴有血脂生化指標(biāo)包括血清總膽 固 醇(total cholesterol,TC)、甘 油 三 酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C)和/或高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)異常升高[8-9]。脂代謝異常是肝臟、糖尿病、冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化、高血壓和各種心血管疾病的主要危險因素之一[10]。絕經(jīng)期女性脂質(zhì)代謝紊亂經(jīng)常被忽視,與更年期綜合征混淆,其具體機(jī)制還不明朗。中藥復(fù)方濟(jì)陰顆粒由生地黃、淫羊藿、香附、丹參、黃柏組成,主要用于治療絕經(jīng)綜合征肝腎陰虛證。本研究采用去卵巢雌性冠心病大鼠模型模擬絕經(jīng)期冠心病大鼠,在分子水平上探究濟(jì)陰顆粒對絕經(jīng)期冠心病大鼠脂質(zhì)代謝的影響,為絕經(jīng)期冠心病女性脂質(zhì)代謝紊亂的防治、中藥新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試藥健康雌性SD 大鼠75 只,體質(zhì)量(200±20)g,購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,實驗動物合格證號:SCXK(遼)2015-0001。

        1.2 試藥與儀器RNA 提取試劑RE-03012(FOREGENE 公司,批號:R190701);反轉(zhuǎn)錄試劑盒RR047A[寶生物工程(大連)有限公司,批號:095634];ABclonal 2×快速熒光定量qRCR 反應(yīng)預(yù)混液(低Rox)RK21202(ABclonal 公司,批號:190601);大鼠TC ELISA 試劑(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號:201912);Multiskan FC 酶標(biāo)儀,ABI7500實時定量PCR儀(德國Thermo公司)。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 模型制備75只健康SD雌性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 天后,隨機(jī)分為空白組、模型組、西藥對照組、中藥對照組、濟(jì)陰顆粒組5 組,每組15 只。除空白組外,其余各組大鼠制備絕經(jīng)期冠心病模型:去除雙側(cè)卵巢,術(shù)后腹腔注射青霉素(華北制藥股份有限公司,批號:F8008502)3 天以防感染,陰道分泌物涂片確定未出現(xiàn)感染后進(jìn)行冠心病造模:除空白組外所有大鼠每天給予高脂飼料[11][3% 膽固醇( 成都華夏化學(xué)試劑有限公司,批號:P354464),0.5% 膽酸鈉(成都華夏化學(xué)試劑有限公司,批號:P436521),0.2% 丙基硫氧嘧啶(成都華夏化學(xué)試劑有限公司,批號:P243652),5% 白糖,10% 豬油]連續(xù)8 周,造模第7、14 天分別給予維生素D3注射液(江蘇吳中醫(yī)藥集團(tuán)有限公司蘇州制藥廠,批號:14122501,規(guī)格:30 萬IU/支,50萬IU/支)50 萬IU/kg、30 萬IU/kg 注射液灌胃,第7 周給予異丙腎上腺素注射劑(上海禾豐制藥有限公司,批號:41160302,規(guī)格:1 mg/支)(ISO)5 mg/kg多點(diǎn)皮下注射,連續(xù)1周[12]。

        1.3.2 給藥及標(biāo)本采集西藥對照組每日灌服1 次阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司,批號:X67405,規(guī)格:10 mg/片)2 mg/kg;中藥對照組每日灌服1次珍珠靈芝片(湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字1903107,規(guī)格:0.32 g/片)0.17 g/kg;濟(jì)陰顆粒組每日灌服1次濟(jì)陰顆粒[生地黃、淫羊藿、丹參、香附、黃柏免煎顆粒劑(江陰天江藥業(yè)有限公司,批號:18334517、18112331、19032831、19051161、19032251),規(guī)格:10 g/包]7.8 g/kg;空白組、模型組每日1 次灌服同等容積蒸餾水。各組于給藥8 周后取材,分離主動脈,液氮速凍后保存在-80℃冰箱。

        1.3.3 試劑盒提取大鼠主動脈血管RNA取新鮮組織每10~20 mg 加入500 μL Buffer RL1,玻璃勻漿器或電動勻漿器將組織研磨均勻;將研磨均勻的勻漿液轉(zhuǎn)移至DNA 清洗柱(DNA-cleaning column)中,12 000 r/min(13 400×g)離心2 min。移除DNA-Cleaning Column,保留收集管內(nèi)上清液;向上述上清液(體積應(yīng)約為500 μL)中加入1.6 倍體積Buffer RL2(使用前請確認(rèn)已按照說明加入無水乙醇),輕柔混勻;將700 μL 混合液轉(zhuǎn)移至RNA-only Column 中(純化柱放入收集管中),12 000 r/min(13 400×g)離心1 min,棄掉收集管中的廢液;將純化柱放回收集管中,將剩余混合液全部加入純化柱中,12 000r/min(13 400×g),離心1 min,棄掉收集管中的廢液;向純化柱中加入500 μL Buffer RW1,12 000r/min(13 400×g)離心1 min,棄掉收集管中的廢液;向純化柱中加入700 μL Buffer RW2(使用前請確認(rèn)已按照說明加入無水乙醇),12 000r/min(13 400×g)離心1 min,棄掉收集管中的廢液,重復(fù)1 次;將純化柱放回收集管中,12 000 r/min(13 400×g)空管離心2 min,去掉離心柱中殘余的Buffer RW2;將純化柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中,向純化柱的膜中央滴加50~200 μL 已于65℃預(yù)熱的RNase-Free ddH2O(切勿將洗脫液添加到壓圈上,否則會損失較大體積的洗脫液),室溫放置2 min。12000r/min(13 400×g)離心1 min 收集RNA 溶液。為提高RNA 產(chǎn)量,可將離心得到的RNA 溶液重新加至純化柱中,重復(fù)步驟1次。

        1.3.4 mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA反應(yīng)反應(yīng)1:5×gDNase Mix 2.0 μL,Template(RNA)5 μL,RNase-Free ddH2O 3 μL,42℃2 min,4℃+∞;反應(yīng)2:反應(yīng)液110 μL,5×ROEasy Mix 4 μL,RNaseFree ddH2O 6 μL,37℃15 min,85℃5 s,4℃+∞。

        1.3.5 實時定量PCR反應(yīng)cDNA 0.4 μL,上游引物(10 μM)0.4 μL,下游引物(10 μM)0.4 μL,2×SYBR Green Fast qPCR Mix with Low Rox 10 μL,ddH2O 8.8 μL,95℃2 min;95℃15 s,60℃1 min,72℃1min,40cycles;95℃15s,60℃1min,95℃15 s,60℃15 s。引物序列見表1。

        表1 引物序列

        1.3.6 ELISA 測定大鼠血清總膽固醇含量標(biāo)準(zhǔn)品的加樣:設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL;加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步驟相同);待測樣品孔;在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋劑40 μL,然后再加待測樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5 倍);加樣將樣品加于酶標(biāo)孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻;加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL,空白孔除外;溫育:用封板膜封板后置37℃溫育60 min;配液:將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用;洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,沒空加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干;顯色:每孔加入顯色劑A50 μL,再加入顯色劑B50 μL,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15 分鐘;終止:每孔加入終止液50 μL,終止反應(yīng);測定:以空白孔調(diào)零,450 nm波長依序測量各孔的吸光度。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,計量資料以±s 表示,P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 大鼠主動脈ABCA1 mRNA 水平與空白組相比,模型組ABCA1 mRNA表達(dá)明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);同模型組比較,西藥對照組、中藥對照組、濟(jì)陰顆粒組ABCA1 mRNA 表達(dá)顯著增加(P<0.01)。見圖1。

        圖1 大鼠主動脈ABCA1 mRNA表達(dá)水平

        2.2 大鼠主動脈ApoA1 mRNA 水平與空白組相比,模型組ApoA1 mRNA表達(dá)明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);同模型組比較,西藥對照組、中藥對照組、濟(jì)陰顆粒組ApoA1 mRNA 表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

        圖2 大鼠主動脈ApoA1 mRNA表達(dá)水平

        2.3 大鼠主動脈CAV1 mRNA 水平與空白組相比,模型組CAV1 mRNA 表達(dá)明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。同模型組比較,西藥對照組、中藥對照組CAV1 mRNA表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),濟(jì)陰顆粒組CAV1 mRNA 表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

        圖3 大鼠主動脈C AV 1 m R N A 表達(dá)水平

        2.4 大鼠主動脈LDLR mRNA 水平與空白組相比,模型組LDLR mRNA 表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同模型組比較,西藥對照組、中藥對照組、濟(jì)陰顆粒組LDLR mRNA 表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

        圖4 大鼠主動脈LD LR m R N A 表達(dá)水平

        2.5 大鼠主動脈SRB1 mRNA 水平與空白組相比,模型組SRB1 mRNA 表達(dá)明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。同模型組比較,西藥對照組、中藥對照組、濟(jì)陰顆粒組SRB1 mRNA 表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

        圖5 大鼠主動脈S R B 1 m R N A 表達(dá)水平

        2.6 大鼠主動脈VLDLR mRNA 水平與空白組相比,模型組VLDLR mRNA表達(dá)明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。2)同模型組比較,西藥對照組、中藥對照組VLDLR mRNA表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),濟(jì)陰顆粒組VLDLR mRNA表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

        圖6 大鼠主動脈V LD LR m R N A 表達(dá)水平

        2.7 大鼠血清總膽固醇含量測定與空白組相比,模型組總膽固醇含量明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);同模型組比較,西藥對照組、中藥對照組總膽固醇含量顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),濟(jì)陰顆粒組總膽固醇含量減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

        圖7 大鼠血清總膽固醇含量

        3 討論

        近年來,女性冠心病患者的比例持續(xù)增長,并且主要為老年婦女[13-14],女性患冠心病的時間大約比男性晚10 年,潛在的原因可能是絕經(jīng)前雌激素的保護(hù)作用[13,15-16],65 歲以上的女性患冠心病的風(fēng)險是65歲以下的女性的3倍[13,17-18]。

        小窩蛋白1(caveolin-1,Cav-1)已被報道與脂質(zhì)代謝有較好相關(guān)性[19]。小窩介導(dǎo)脂質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和脂蛋白分子的內(nèi)吞和外吞[20-21]。除了囊泡介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)外,小窩中的各種受體,如LDLR、SR-B1 和ABCA1,介導(dǎo)脂質(zhì)流出[22]。Cav-1 富含囊泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,通過囊泡的細(xì)胞內(nèi)沉降在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜之間穿梭[23-24]。脂蛋白受體,如極低密度脂蛋白受體(very low density lipoprotein receptor,VLDLR)和低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR),以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,如ABCA1和SRB1,構(gòu)成跨膜脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[25-28]。脂蛋白,包括極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)和蛋白質(zhì)膽固醇輸送蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP)構(gòu)成一個細(xì)胞外脂質(zhì)沉積系統(tǒng)。調(diào)節(jié)血清脂蛋白受體水平是降低血清膽固醇和甘油三酯的作用機(jī)制之一。 載脂蛋白A1(apolipoprotein-A1,ApoA1)是高密度脂蛋白的主要結(jié)構(gòu)蛋白。現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明,ApoA1和ABCA1之間的功能性相互作用對ApoA1 的初始脂肪化是必要的[29]。通過一系列的中間步驟脂肪化的ApoA1形成盤狀的HDL 顆粒,可在卵磷脂膽固醇?;D(zhuǎn)移酶(lecithin cholesterol acyl transferase,LCAT)的作用下轉(zhuǎn)化為球形顆粒。

        脂質(zhì)代謝在冠心病中起著重要作用[30]。HDL是冠心病的保護(hù)因素[31],LDL 是冠狀動脈疾病的危險因素[32]。TC 和TG 水平也與冠心病相關(guān)[33-34]。血脂異常是脂質(zhì)異常轉(zhuǎn)運(yùn)的直接結(jié)果,通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其受體在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。實時定量PCR結(jié)果顯示,模型組大鼠ABCA1、ApoA1、CAV1、LDLR、SRB1、VLDLR mRNA 水平顯著低于空白組、西藥對照組、中藥對照組,可能是雌性大鼠患冠心病后脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)減少,因此轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)受體mRNA 相對表達(dá)量減少。 濟(jì)陰顆粒組大鼠ABCA1、ApoA1、CAV1、LDLR、SRB1、VLDLR mRNA 水平高于模型組,可能是給予濟(jì)陰顆粒后,CAV-1、各種受體如LDLR、VLDLR、SR-B1和ABCA1 mRNA相對表達(dá)量增加以介導(dǎo)脂質(zhì)流出,同時高密度脂蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白ApoA1 mRNA 相對表達(dá)量增加。ELISA 結(jié)果顯示,空白組、西藥對照組、中藥對照組、濟(jì)陰顆粒組總膽固醇含量低于模型組,因此推測濟(jì)陰顆??赡芡ㄟ^降低總膽固醇水平以治療去卵巢雌性大鼠冠心病脂質(zhì)代謝紊亂。

        中醫(yī)認(rèn)為,脂質(zhì)代謝病是痰濕內(nèi)阻所致,高脂飲食引起脾胃功能障礙,導(dǎo)致體內(nèi)脂肪積聚,最終導(dǎo)致痰濕內(nèi)阻[35]。本研究從脂質(zhì)代謝角度檢測濟(jì)陰顆粒對去卵巢雌性冠心病大鼠脂質(zhì)代謝紊亂的療效,表明濟(jì)陰顆粒能降低去卵巢雌性冠心病血清TC 水平。對濟(jì)陰顆粒降脂作用機(jī)制的進(jìn)一步研究表明,濟(jì)陰顆粒可上調(diào)ABCA1、ApoA1、CAV1、LDLR、SRB1、VLDLR mRNA 水平。綜上所述,濟(jì)陰顆粒是一種通過調(diào)節(jié)載脂蛋白、載脂蛋白受體、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)水平和降低總膽固醇水平而起作用的中藥小復(fù)方,推測可能對絕經(jīng)期女性脂質(zhì)代謝紊亂有一定治療效果。

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