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        響應(yīng)面法優(yōu)化四妙勇安湯菌質(zhì)固態(tài)發(fā)酵工藝?

        2022-01-21 02:04:26馬新?lián)Q李季文畢映燕王雪梅
        西部中醫(yī)藥 2021年8期
        關(guān)鍵詞:生長(zhǎng)

        馬新?lián)Q,李季文,畢映燕,王雪梅

        甘肅省中醫(yī)院,甘肅 蘭州 730050

        四妙勇安湯的處方最先記錄于華佗的《神醫(yī)秘傳》,曰“此疾發(fā)于手指或足恥之端,先疹然后痛,甲現(xiàn)玄色,久則潰敗,節(jié)節(jié)脫落……內(nèi)服藥用玄參三兩,金銀花三兩,當(dāng)歸二兩,甘草一兩,水煎服?!鼻宄t(yī)家鮑相敖將此方命名為“四妙勇安湯”,收載于《驗(yàn)方新編》中,并稱其醫(yī)治脫疽“連續(xù)十劑,永無(wú)后患”[1]。目前臨床上不僅僅用四妙勇安治外科脫疽,其在周圍血管病科、骨科、眼科也廣泛應(yīng)用[2-9]。真菌發(fā)酵可以富集中藥成分,不僅可減少藥材用量,還可提高療效[10]。筆者通過(guò)查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn),利用藥用真菌進(jìn)行中藥發(fā)酵亦可組成中藥復(fù)方,通過(guò)其分解轉(zhuǎn)化能力,提高中藥中活性成分的單位濃度,且可產(chǎn)生新的活性物質(zhì),獲取更多的有效成分,共同作用于機(jī)體,發(fā)揮整體效應(yīng)[11-13]。本文通過(guò)真菌發(fā)酵技術(shù),對(duì)四妙勇安湯方進(jìn)行發(fā)酵研究,以期實(shí)現(xiàn)減少服用量,提高臨床療效的目的。通過(guò)本研究初步建立四妙勇安湯方菌質(zhì)真菌發(fā)酵工藝條件,旨在為四妙勇安湯的開發(fā)研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器儀器YX280A 型手提式不銹鋼蒸汽消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司);SB-5200DTS雙頻超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);HH-S4 型恒溫水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);MJX-160 型培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠);HXGZ-000800 電熱恒溫干燥箱(連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠);BS110 電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)。

        1.2 材料真菌菌種由甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心研發(fā)部自制。金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb. 的干燥花蕾或帶初開的花;玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根;當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根;甘草為豆科植物脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat. 的干燥根和根莖;均由甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心提供,由甘肅省中醫(yī)院主任中藥師李喜香鑒定。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 發(fā)酵方法

        2.1.1 菌種培養(yǎng)將真菌菌種接入121℃、滅菌30 min 的四妙勇安湯方藥材培養(yǎng)基中,于25℃下恒溫培養(yǎng)15天待菌絲體達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn),即得。

        2.1.2 菌質(zhì)的制備取金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草飲片,破碎,加入適量的蒸餾水,混合均勻,置于100 mL 試管內(nèi),蓋上棉塞,用包裝紙包好,121℃,滅菌30 min。在無(wú)菌室內(nèi),取制備好的固體種子適量平鋪接種到固體培養(yǎng)基中,在適宜的溫度、濕度下,培養(yǎng),至發(fā)酵瓶底布滿菌絲,即得。

        2.1.3 菌絲體生長(zhǎng)速度以S 代表每天菌絲生長(zhǎng)速度(mm),以菌絲體布滿菌質(zhì)表面開始計(jì)算,平行3 份(A1、A2、A3),將發(fā)酵瓶圓形面平均分成4 份,分別測(cè)定菌絲體生長(zhǎng)速度(S1、S2、S3、S4)。計(jì)算公式為:

        2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

        2.2.1 藥材粒徑對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響按處方比例分別稱飲片適量,按照飲片、10目、24目、50目、60 目的要求混合,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備菌質(zhì),菌質(zhì)裝至同一高度,菌質(zhì)條件為含水量為120%,接種量為10%,在27℃,發(fā)酵15天??疾觳煌綄?duì)菌絲體生長(zhǎng)速度的影響。隨著目數(shù)的增加菌絲體生長(zhǎng)速度減慢,結(jié)果顯示10 目培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)速度快。因此,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中藥材粒徑選為10目。

        2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響按處方比例分別稱飲片適量,按照5、10、15、20、30 天的要求培養(yǎng),按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備菌質(zhì),菌質(zhì)條件為菌質(zhì)粒徑為10 目,含水量為120%,接種量為10%,在27℃,發(fā)酵不同天數(shù)??疾彀l(fā)酵時(shí)間,結(jié)果顯示15天為最佳發(fā)酵時(shí)間。

        2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響按處方比例分別稱飲片適量,按照20、22、24、26、8℃的要求進(jìn)行培養(yǎng),按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備菌質(zhì),菌質(zhì)條件為菌質(zhì)粒徑為10 目,含水量為120%,接種量為10%,在按照不同溫度,發(fā)酵15天??疾彀l(fā)酵溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響,結(jié)果顯示24℃為最佳發(fā)酵溫度。

        2.2.4 菌質(zhì)初始含水量對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響按處方比例分別稱飲片適量,按照初始含水量90%、100%、110%、120%、130% 的要求進(jìn)行培養(yǎng),按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備菌質(zhì),菌質(zhì)條件為菌質(zhì)粒徑為10 目,接種量為10%,發(fā)酵溫度為24℃,在按照不同初始含水量,發(fā)酵15 天??疾斐跏己繉?duì)菌絲生長(zhǎng)的影響,結(jié)果顯示100% 為最佳初始含水量。

        2.2.5 接種量對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響按處方比例分別稱飲片適量,按照5%、7%、9%、10%、15% 的接種量要求進(jìn)行接種培養(yǎng),按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備菌質(zhì),菌質(zhì)條件為菌質(zhì)粒徑為10 目,初始含水量為100%,發(fā)酵溫度為26℃,在按照不同接種量,發(fā)酵15 天。考察初始含水量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響,結(jié)果顯示10%為最佳接種量。

        2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法[14-21]

        2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)主要研究初始含水量(A)、發(fā)酵溫度(B)、接種量(C)3 個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值菌絲生長(zhǎng)速度(S)的影響。采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)分析方法,優(yōu)化工藝條件,并進(jìn)行預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)分析。因素水平見表1,試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

        表1 因素水平表

        2.3.2 模型建立及回歸分析采用Design Expert 8.0.6軟件,對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得回歸方程為S=11.02+0.67A+1.39B+2.27C+1.18AB+0.98AC+0.94BC-2.23A2-1.44B2-0.13C2,相關(guān)系數(shù)R2=0.8169,表明方程擬合情況良好。方差分析見表3。式中S 為菌絲體生長(zhǎng)速度(mm),A 初始含水量(%)、B發(fā)酵溫度(℃)、C接種量(g)。見表3。

        表2 菌絲生長(zhǎng)速度

        從表3 可以看出,模型的P<0.01,說(shuō)明該模型得到的回歸方程有高度顯著性差異,試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠,模型相關(guān)系數(shù)R2=0.8169,進(jìn)一步說(shuō)明模型具有較好的可信度。在所選取的各因素水平范圍內(nèi),按照對(duì)結(jié)果的影響排序,接種量>發(fā)酵溫度>初始含水量。方差分析的結(jié)果表明方程的總模型、發(fā)酵溫度(B)及接種量(C)對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響有顯著性;初始含水量(A)對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度無(wú)影響,而交互項(xiàng)AB、AC、BC 對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響不顯著。

        表3 回歸方程的方差分析表

        2.3.3 效應(yīng)面分析響應(yīng)面優(yōu)化法即是將實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到的預(yù)測(cè)模型一般是個(gè)曲面,即所獲得的預(yù)測(cè)模型是連續(xù)的。其優(yōu)勢(shì)是在實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)過(guò)程中,可以連續(xù)的對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析。

        2.4 條件優(yōu)化、預(yù)測(cè)與驗(yàn)證由圖1—3 響應(yīng)面可知該模型有穩(wěn)定點(diǎn),且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。利用Point Prediction 進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,獲得一組響應(yīng)值最大的優(yōu)化條件:初始含水量124.5%,發(fā)酵溫度為28℃,接種量為10%,在此優(yōu)化條件下,菌絲生長(zhǎng)速度S 為14.94 mm。為了方便實(shí)際加水量操作,將發(fā)酵工藝參數(shù)適當(dāng)調(diào)整為:初始含水量125%,發(fā)酵溫度為28℃,接種量為10%。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵,依法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速度,對(duì)修正結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果菌絲生長(zhǎng)速度為14.66 mm(n=3)。預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間偏差不大,說(shuō)明該工藝參數(shù)在菌芪菌質(zhì)發(fā)酵工藝中具有可靠性和重現(xiàn)性。

        圖1 初始含水量和發(fā)酵溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的等高線及響應(yīng)面圖

        圖2 初始含水量和接種量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的等高線及響應(yīng)面圖

        圖3 發(fā)酵溫度和接種量對(duì)對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的等高線及響應(yīng)面圖

        3 討論

        本試驗(yàn)在研究過(guò)程中,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),明確中藥菌質(zhì)的粒徑,并將其粒徑確定為10 目,均值太粗,達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)的時(shí)間太長(zhǎng),菌質(zhì)太細(xì)不利于后續(xù)的提取。故在確定菌質(zhì)粒徑的前提下,經(jīng)過(guò)發(fā)酵天數(shù)的觀察,明確了發(fā)酵15 天可達(dá)到發(fā)酵終。本試驗(yàn)應(yīng)用菌株具有分解纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉等成分的作用,在該試驗(yàn)研究過(guò)程中有利于富集四妙勇安湯方中的有效成分,在臨床使用中減少服用量,同時(shí)提高療效。本試驗(yàn)以四妙勇安湯方藥材為菌質(zhì)對(duì)其進(jìn)行雙向固態(tài)發(fā)酵工藝研究,星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化條件結(jié)果表明,初始含水量(A)及接種量(C)對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響有顯著性;發(fā)酵溫度(B)對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度無(wú)影響,預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間偏差不大,說(shuō)明該工藝參數(shù)在四妙勇安湯菌質(zhì)發(fā)酵工藝中具有可行性。

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