孫晨明,潘超男,葛 臣,葉麗青,許燕茹,蘇治國

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇 泰州 225300)

替米考星(Tilmicosin) 是一種畜禽專用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1]，由順式和反式兩種異構(gòu)體以85∶15 的比例混合而成[2]，多用于由放線桿菌或巴氏桿菌引起的肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病[3]。替米考星在我國亦已獲準(zhǔn)用于治療豬和牛的巴氏桿菌病和雞的支原體感染。以往替米考星批準(zhǔn)用于豬的劑型只有預(yù)混劑，替米考星腸溶顆粒是采用先進(jìn)的包衣技術(shù)，頂級的流化床設(shè)備研發(fā)的替米考星新型制劑，能有效避免高溫對替米考星的破壞，提高藥物的穩(wěn)定性，同時解決傳統(tǒng)替米考星預(yù)混劑在拌料給藥時因苦味造成豬采食量降低、藥物攝入量不足，影響動物生長性能及藥物治療效果等問題。

目前，國內(nèi)外只有對替米考星預(yù)混劑在不同動物組織中的殘留消除研究報(bào)道，殘留檢測的主要方法是高效液相色譜(HPLC)法，本試驗(yàn)對瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司開發(fā)的替米考星腸溶顆粒新制劑開展替米考星在豬主要可食性組織中的殘留檢測，采用乙腈提取，C18固相萃取柱凈化，HPLC紫外檢測器測定豬肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中的替米考星殘留，研究其在豬體內(nèi)殘留消除規(guī)律，為替米考星腸溶顆粒在豬休藥期的制定提供依據(jù)，以指導(dǎo)臨床合理用藥，保證消費(fèi)者使用安全。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 替米考星腸溶顆粒：規(guī)格：20%(以替米考星計(jì))，批號：121001，生產(chǎn)企業(yè)：瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司。推薦用法與劑量是混飼：每1 000 kg飼料，豬400 g(相當(dāng)于加本品2 000 g，即每1 kg飼料加本品2 g)，連用15 d。

1.2 儀器和設(shè)備 高效液相色譜儀，Waters 2695；檢測器，Waters 2489；色譜柱，Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm)，美國Agilent Technologies公司；組織勻漿機(jī)B-400,瑞士Buchi公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)；氮吹儀，Organomation Associates公司；感量0.000 01 g的Mettler AE240型分析天平,梅特勒-托利多公司；VTX-3000L型高速渦旋儀,Harmony公司；超純水設(shè)備，美國Millipore公司；1～10 μL、20～200 μL和100～1 000 μL 可調(diào)微量移液槍,Eppendorf公司；C18 SPE柱，Bond Elut，6cc/500 mg，美國Agilent Technologies公司。

1.3 主要試液

1.3.1 配制二丁胺緩沖液(DBAP) 將85%磷酸100 mL緩慢加至900 mL純水中配成10%磷酸溶液。將10%磷酸溶液700 mL加到168 mL 二丁胺中，充分混勻冷卻后，用85%磷酸調(diào)pH至2.5，再加132 mL純水定容[4-6]。

1.3.2 流動相 在1 000 mL的容量瓶中分別加入純水700 mL、乙腈溶液105 mL、四氫呋喃50 mL、1 mol/mL 二丁胺磷酸緩沖液50 mL，最后用純水定容至1 000 mL，0.22 μm 濾膜過濾備用。為有效防止有機(jī)溶劑揮發(fā)，各組分使用時密封并進(jìn)行超聲脫氣15 min處理。

1.3.3 洗脫液 0.1 mol/L乙酸胺甲醇-乙腈溶液(2∶8)是由7.71 g乙酸胺先用200 mL甲醇溶解，再用790 mL乙腈混勻，待溶液冷卻至室溫后，用乙腈定容至1 000 mL配置而成。

1.4 方法

1.4.1 試驗(yàn)動物 選用28頭健康的三元豬,公母各半,80～90 kg，隨機(jī)分成6個組進(jìn)行試驗(yàn)，購自江蘇大豐中北畜牧場。采用耳標(biāo)標(biāo)記識別。用于試驗(yàn)的豬在試驗(yàn)前1個月以內(nèi)未用相關(guān)抗菌藥物。

1.4.2 給藥 25頭健康三元豬飼喂含有替米考星腸溶顆粒的飼料，試驗(yàn)期間自由采食，連用15 d，之后改用不添加任何藥物的全價飼料繼續(xù)飼養(yǎng)。另外3頭三元豬做空白對照，試驗(yàn)期間每天清理豬糞，豬舍采用自然通風(fēng)。

1.4.3 樣品采集和保存 分別在停藥后的第12小時、第3、6、9天和第14天時各隨機(jī)選取5頭豬宰殺并采集其可食性組織。豬經(jīng)頸靜脈放血處死后，每只豬取肌肉500 g左右(背最長肌)，肝臟500 g左右(取整葉)，雙腎各取1/2(縱切)，脂肪200 g。所取樣品做好標(biāo)記、包裝保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.4.4 測定替米考星殘留量

1.4.4.1 前處理階段 (1)提取:分別稱取采集的肝臟、脂肪、腎臟和肌肉組織各2.0 g放于聚丙烯離心管中，先加入5 mL乙腈，先后振蕩、超聲3 min，然后在轉(zhuǎn)速5 000 r/min下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另1個50 mL聚丙烯離心管中。剩余殘?jiān)檬孪扰浜玫? mL 0.1 mol/L的磷酸二氫鉀緩沖液(pH 2.5)和5 mL乙腈溶液重復(fù)提取1次。于聚丙烯離心管中合并2次上清液，最后用30 mL超純水混勻。(2)凈化:分別用10 mL甲醇和10 mL超純水平衡SPE柱，控制流速約為每秒1滴，洗滌液分別用10 mL 超純水和10 mL乙腈，干燥3 min后用3 mL 0. 1 mol/L乙酸胺甲醇-乙腈溶液(2∶8)進(jìn)行洗脫，用5 mL 刻度試管收集洗脫液，氮?dú)獯蹈商幚怼? mL 流動相復(fù)溶殘?jiān)玫降膹?fù)溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用進(jìn)樣針吸取100 μL濾液進(jìn)行高效液相色譜分析[4-7]。

1.4.4.2 色譜條件 色譜柱選用Agilent Technologies公司生產(chǎn)的Eclipse XDB -C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相是由體積比為10.5∶5∶5∶79.5的乙腈-四氫呋喃-二丁胺鹽緩沖液-水混合液；檢測波長：290 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：100 μL； 柱溫：35 ℃。

1.4.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取空白脂肪和肌肉組織樣品，添加系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別制備0.1、0.2、0.4、0.5、1、2 μg/g和4 μg/g空白添加濃度，將一定濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到空白肝臟和腎臟中，空白添加濃度為0.1、0.2、0.4、1、2、4 μg/g和10 μg/g。7個濃度分設(shè)5個平行，按1.4.4.1方法進(jìn)行處理。在1.4.4.2條件下，從低到高濃度進(jìn)樣測定分析。以檢測的峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)志物檢測濃度為橫坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.4.4.4 檢測限(LOD)與定量限(LOQ) 將適量標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到空白組織中制成以下4個空白添加濃度：0.01、0.025、0.05 μg/g和0.1 μg/g。4個濃度分設(shè)5個平行，分別按1.4.4.1方法進(jìn)行處理。檢測限(LOD)以信噪比(S/N)=3確定，定量限(LOQ)由S/N=10確定。

1.4.4.5 添加回收率與精密度的測定 將適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別加入到空白脂肪和肌肉組織樣品，制備成0.05、0.1 μg/g和1 μg/g的空白組織添加樣品，分別準(zhǔn)確稱取空白肝臟和腎臟組織樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別制備0.05、0.5 μg/g和5 μg/g的空白組織添加樣品。按1.4.4.1方法進(jìn)行處理后，添加濃度與對應(yīng)濃度的替米考星標(biāo)準(zhǔn)液均做HPLC檢測。每批3個濃度分設(shè)5個重復(fù)樣品，共3個批次。依此計(jì)算標(biāo)志物替米考星的回收率、批內(nèi)與批間變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 色譜行為 替米考星和其他雜質(zhì)在本試驗(yàn)確立的色譜條件分離較好，色譜峰形對稱，基線平穩(wěn)，替米考星反式異構(gòu)體出峰時間在10.3 min左右，順式異構(gòu)體出峰時間在12.4 min左右，如圖1所示。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在建立的色譜條件下，肝臟、脂肪、肌肉和腎臟組織空白添加平均濃度與其平均峰面積的回歸方程為：y=144 624x-1 366.3(R2=0.999 9)；y=150 000x-168.55(R2=0.999 9)；y=135 206x-1 243.5(R2=0.999 9)和y=153 842x-10 684(R2=0.999 9)，均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 LOD與LOQ 按照1.4.4.4方法求得豬各組織中替米考星的LOD和LOQ分別為0.025 μg/g和0.050 μg/g。

2.4 測得的回收率和精密度 肝臟和腎臟在0.05、0.5 μg/g和5 μg/g三個添加濃度水平，肌肉和脂肪在0.05、0.1 μg/g和1 μg/g三個添加濃度水平測得的回收率和精密度測定結(jié)果見表1。本方法的平均添加回收率在81.92%～86.53%，批內(nèi)與批間變異系數(shù)均小于5%。

2.5 豬各組織中替米考星平均殘留量及替米考星的消除 給藥后測得豬組織中替米考星殘留結(jié)果見表2。替米考星殘留消除曲線如圖2所示。表2是替米考星腸溶顆粒按推薦方案混飼給藥連用15 d的殘留檢測數(shù)據(jù)，停藥12 h后的結(jié)果顯示，5頭豬腎臟中替米考星的平均殘留量為(1.771±0.675) mg/kg，全部超過我國規(guī)定的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(1.0 mg/kg)；肝臟是殘留第2高的組織，但停藥12 h后5頭豬中僅有2頭豬肝臟中替米考星的殘留量超過限量標(biāo)準(zhǔn)(1.5 mg/kg)，平均殘留量為(1.454±0.888) mg/kg；停藥12 h后5頭豬中有4頭豬的肌肉組織替米考星殘留量超過限量標(biāo)準(zhǔn)(0.1 mg/kg)；脂肪組織中殘留量最低，停藥12 h后5頭豬中有3頭豬的脂肪組織中替米考星殘留量超過限量標(biāo)準(zhǔn)(0.1 mg/kg)，2頭豬脂肪組織中的殘留量低于殘留量限量標(biāo)準(zhǔn)。

停藥3 d后在5頭豬肝臟和腎臟組織中測得替米考星平均殘留量分別為(0.568±0.238) mg/kg和(0.607±0.174) mg/kg，都低于我國規(guī)定的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)；來自3頭豬的肌肉組織中替米考星殘留量低于方法的檢測限，2頭豬的肌肉組織中替米考星殘留量低于定量限；來自5頭豬的脂肪組織替米考星殘留量均低于儀器檢測限。至停藥第6天，來自5頭豬的肝臟和腎臟組織中替米考星殘留量仍高于定量限，脂肪和肌肉組織的替米考星殘留量均低于檢測限；至停藥第14天時，僅有腎臟組中替米考星殘留量仍能檢出。

2.6 豬各可食性組織中替米考星休藥期的計(jì)算 替米考星在豬各可食性組織中最高殘留限量(MRL)是肝臟為1.5 mg/kg、腎臟為1 mg/kg、肌肉和脂肪均為0.1 mg/kg。將本試驗(yàn)實(shí)測的肝臟和腎臟替米考星殘留量數(shù)據(jù)依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)采用WT1.4休藥期軟件擬合，得出替米考星在豬肝臟休藥期為6.17 d(圖3)，豬腎臟休藥期為4.96 d(圖4)；至停藥第3天后測得5頭豬脂肪和肌肉組織中替米考星殘留量均低于定量限，替米考星在豬脂肪和肌肉的休藥期可依據(jù)實(shí)測殘留量暫定為3 d。

3 討論

動物性食品中替米考星殘留檢測研究較多，本試驗(yàn)參考農(nóng)業(yè)部1025號公告-10-2008《動物性食品中替米考星殘留檢測——高效液相色譜法》[8]和劉德金等[9]建立的色譜條件基礎(chǔ)上，將流動相比例從乙腈-四氫呋喃-二丁胺磷酸鹽緩沖液-水(體積比100∶50∶50∶800)[10]調(diào)整為乙腈-四氫呋喃-二丁胺磷酸鹽緩沖液-水(體積比105∶50∶50∶795)，在保證峰形良好的前提下出峰時間有所縮短，這是由于在反相色譜中增加了乙腈這種有機(jī)溶劑的比例，使替米考星這種極性物質(zhì)保留時間縮短，出峰時間前移。

替米考星為弱堿性化合物，微溶于水，與酸制成鹽后易溶于水，易溶于如正己烷、丙酮、乙腈、四氫呋喃等有機(jī)溶劑[11]，本試驗(yàn)參考劉彩等[6]的方法選擇乙腈提取組織中的替米考星，因?yàn)橐译娌粌H對替米考星有較高的溶解性，而且能有效除去提取液中的蛋白質(zhì)和脂肪，使藥物與其他干擾基質(zhì)充分分離，提高藥物的回收率。本試驗(yàn)采用固相萃取(SPE)分離技術(shù)用C18填料的萃取柱對提取液進(jìn)行凈化，與HPLC柱的固定相一樣，保留機(jī)理與HPLC一致，具備良好的保留效果[12-13]。在所建立的檢測方法下，豬可食性組織中替米考星的平均回收率均在80%以上，滿足回收率要求。

圖1 豬部分組織中替米考星檢測的色譜圖Fig.1 Chromatograms of tilmicosin in swine tissues1:替米考星反式異構(gòu)體色譜峰； 2:替米考星順式異構(gòu)體色譜峰； A:替米考星標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(0.5 μg/mL)； B:空白肌肉色譜圖； C:添加肌肉樣品色譜圖(0.5 μg/g)； D:空白肝臟色譜圖； E:添加肝臟樣品色譜圖(0.5 μg/g)1:Chromatogram of tilmicosin transisomer; 2:Chromatogram of tilmicosin cisisomer; A:Chromatograms of tilmicosin standard (0.5 μg/mL); B:Chromatograms of blank muscle; C:Chromatograms of fortified muscle (0.5 μg/g); D:Chromatograms of blank liver; E:Chromatograms of fortified liver (0.5 μg/g)

表1 豬組織中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recovery and RSD of tilmicosin in swine tissues

表2 停藥后豬各可食性組織中替米考星的殘留量Table 2 Residues of tilmicosin in edible tissues of swine after drug withdrawal (mg/kg)

殘留消除試驗(yàn)顯示，對替米考星腸溶顆粒混飼給藥停藥后在豬不同組織殘留量進(jìn)行比較，雖然同一采樣時間點(diǎn)替米考星在不同組織沒有統(tǒng)一的殘留規(guī)律，但是其在肌肉和脂肪組織殘留量較低，在肝臟和腎臟的殘留量最高，這與劉彩等[6]的研究結(jié)果一致。而且肝臟和腎臟的藥物殘留量遠(yuǎn)高于皮脂和肌肉的殘留量，消除時間分別在9 d和14 d以上，表明肝臟和腎臟為替米考星在豬體內(nèi)的殘留靶器官。食品中獸藥最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定替米考星在豬皮脂、肌肉、肝臟、腎臟中的MRL分別為0.1、0.1、1.5 μg/g和1.0 μg/g。替米考星腸溶顆?；祜曔B用15 d后，在停藥后的第3天替米考星在以上組織中的殘留量均低于國家最高殘留限量，說明替米考星腸溶顆粒在豬體內(nèi)代謝較快，且沒有組織蓄積情況。

圖2 替米考星腸溶顆?；祜暯o藥停藥后替米考星在 豬組織中的殘留消除曲線Fig.2 Residues eliminate curve of tilmicosin in swine tissues after the withdrawal of enteric-coated tilmicosin pellets

圖3 按雙單側(cè)95%置信區(qū)間擬合休藥期曲線圖(肝臟)Fig.3 Plot of withdrawal time calculation for liver at the time when the one-sided 95% upper tolerance limit was below the MRL

圖4 按雙單側(cè)95%置信區(qū)間擬合休藥期曲線圖(腎臟)Fig.4 Plot of withdrawal time calculation for kidney at the time when the one-sided 95% upper tolerance limit was below the MRL

休藥期(WDT)指食品動物從停止給藥到許可屠宰或其產(chǎn)品(蛋、奶)許可上市之間的間隔時間。休藥期的制定原則是藥物或其他外源性化學(xué)物質(zhì)必須從體內(nèi)排出，或降至人在食用其組織或產(chǎn)品后不會危害人體健康的程度。本試驗(yàn)根據(jù)休藥期計(jì)算軟件和實(shí)測藥物濃度得出皮脂、肌肉、肝臟、腎臟分別為3、3、6.17 d和4.96 d，這與國家藥典規(guī)定的替米考星休藥期14 d明顯縮短，筆者認(rèn)為這主要由替米考星腸溶顆粒劑不同生產(chǎn)工藝和試驗(yàn)動物個體差異造成。參照國家規(guī)定的替米考星最高殘留量要求，建議替米考星腸溶顆粒按推薦給藥劑量上限混飼給藥時，在豬的休藥期定為7 d。