項 夫,楊曉雯,王家偉,吳清民

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193 ； 2.北京寵愛國際動物醫(yī)院,北京 朝陽 100124 ； 3.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所,北京 昌平 102206)

犬胰腺炎是指胰腺分泌的胰蛋白水解酶在病理條件下被激活，對自身的組織器官造成損傷，進而導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)的一種疾病[1]。該病常見于犬和貓，病死率高。臨床上呈現(xiàn)出從急性到慢性、從輕度到嚴(yán)重程度不等的一系列病癥。轉(zhuǎn)為慢性型則可能引起頑固性疼痛、進行性胰腺外分泌和內(nèi)分泌功能障礙[2]。犬胰腺炎發(fā)病機制尚不明確，通常與環(huán)境變化、應(yīng)激和飼料結(jié)構(gòu)不合理或高脂肪物質(zhì)飼喂過量等有關(guān)[3]。犬腸道菌群能為機體提供營養(yǎng)和能量，調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，拮抗病原微生物，甚至影響宿主的行為[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌16S rRNA基因具有保守區(qū)和可變區(qū)交替排列的特征，其保守區(qū)能反映物種的親緣關(guān)系，可變區(qū)序列具有種屬特異性。因此，近年來細(xì)菌16S rRNA基因測序分析在腸道復(fù)雜菌群分類與鑒定中得到廣泛應(yīng)用[6]。本試驗基于16S rRNA擴增子測序技術(shù)，分別對健康犬和胰腺炎患犬的糞便樣品進行檢測分析，探索其腸道菌群組成及多樣性變化和腸道菌群功能變化，旨在為胰腺炎患犬腸道菌群組成提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時為胰腺炎患犬的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 本試驗從2016年1月—2018年12月共收集整理了北京觀賞動物醫(yī)院就診的胰腺炎患犬8例(標(biāo)記為PA)，北京3個犬場收集的同齡健康犬糞樣8份(標(biāo)記為HE)，共計16份。對患犬和健康犬的病史資料、性別及飼養(yǎng)情況、發(fā)病時間、臨床癥狀和實驗室檢測結(jié)果等進行了詳細(xì)問診和記錄。

1.2 16S rRNA擴增子測序 無菌采集糞便樣品200 mg，加入樣品保存液，按糞便DNA快速提取試劑盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit)操作說明書提取糞便內(nèi)微生物總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確定DNA樣品完整性后，用Nanodrop檢測調(diào)整DNA濃度。以細(xì)菌16S rRNA 基因V3～V4區(qū)域為目的片段，以341F～806R引物[7]進行PCR擴增，樣品送交奧美德諾(北京)基因科技有限公司經(jīng)Miseq2500 PE250平臺測序，獲得原始數(shù)據(jù)(Raw tags)。

1.3 測序結(jié)果過濾 原始數(shù)據(jù)以Trimmomatic軟件[8]進行低質(zhì)量序列掃描，當(dāng)質(zhì)量低于 20 時只保留前面高質(zhì)量部分，去掉3′端或5′端一些模糊堿基或低質(zhì)量堿基(可提高拼接率)；然后去除單堿基重復(fù)6個以上的序列，并去除長度小于50 bp的序列；以 FlASH軟件[9]將上一步合格的雙端數(shù)據(jù)拼接，序列拼接時最大重疊(Overlap)為200 bp，得到完整組裝序列；用QIIME程序[10]中的Split_libraries軟件去除序列中含有N堿基的序列，去除單堿基重復(fù)大于6 的序列，去除長度小于200 bp的序列，得到過濾后序列(Clean tags)；再用UCHIME軟件[11]去除其中的嵌合體，最終得到用于后面操作分類單元(Operational taxonomic units，OUT)劃分的可用序列(Valid tags)。

1.4 菌群結(jié)構(gòu)及多樣性分析 用QIIME程序?qū)|(zhì)控過濾后得到的有效序列(Valid tags)以97%相似度進行單元OTU(OTUs是按照一致性和相似性聚類的Tags集合體)分類，選取每個 OTU中豐度最大的序列作為該OTU的代表序列，以RDP Classifier Naive Bayesian分類算法對代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫[12]進行比對，注釋得到每個OTU的物種信息。根據(jù)每個OTU在各個樣本中包含的序列數(shù)，構(gòu)建OTU在各個樣本中豐度矩陣文件；根據(jù)序列比對結(jié)果，用 PyNAST軟件[13]對 OTU 代表序列進行系統(tǒng)進化關(guān)系的構(gòu)建，獲得系統(tǒng)發(fā)育樹文件；并按照最小深度法對所有樣本隨機抽取，建立OTU表格。將OUT矩陣文件均一化后，用QIIME軟件中的alpha_diversity.py輸出可觀察種類(Observed_species)、香農(nóng)(Shannon)、辛普森(Simpson)指數(shù)等多樣性指數(shù)數(shù)值，獲得測序樣品的豐富度和多樣性，使用R軟件繪制稀釋曲線(Rarefaction curve)，判斷測序數(shù)據(jù)的合理程度，同時使用R軟件繪制關(guān)系圖。

1.5 菌群功能預(yù)測 與Greengenes數(shù)據(jù)庫比對，獲得的OUT豐度矩陣文件標(biāo)準(zhǔn)化后，用PICRUSt軟件[14]先根據(jù)已測微生物基因組的16S rRNA基因全長序列，推斷其共同祖先的基因功能譜；對Greengenes數(shù)據(jù)庫中其他未測物種的基因功能譜進行推斷，構(gòu)建細(xì)菌域全譜系的基因功能預(yù)測譜；最后，將測序得到的菌群組成“映射”到KEGG數(shù)據(jù)庫中，對菌群代謝功能進行預(yù)測。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016初步處理后，采用SPSS中ANOVA對分析結(jié)果進行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異顯著，R軟件用于繪制韋恩圖、熱圖等。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)分析 通過Illumina Miseq測序后健康犬(HE)和胰腺炎患犬(PA)樣品測序值在87 131～24 850，所有樣品的有效數(shù)據(jù)(Effective tags)長度均在38～505。在97%相似水平下聚類成OTU并進行物種注釋分析，結(jié)果表明，健康犬樣品OTU總體為56 227，患犬樣品OTU總體為41 293。利用R軟件繪制Shannon指數(shù)稀釋曲線(圖1)，結(jié)果表明，當(dāng)測序深度達2 000 時，Shannon曲線已經(jīng)達到飽和狀態(tài)，表明當(dāng)前的測序量足夠進行菌群多樣性分析。

圖1 測序樣品與稀釋曲線Fig.1 Sequencing sample and dilution curve不同顏色為不同測序樣品的稀釋曲線Different color was the dilution curve of different sequencing samples

2.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性分析 測序樣品注釋隨注釋等級的減小而遞減，大部分序列能注釋到屬水平，但能注釋到種水平的序列遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于屬水平。根據(jù)OTU聚類和注釋分析結(jié)果(圖2A)，分析不同測序樣品的信息，結(jié)果表明測序樣品共有142物種(圖2B)，主要集中于厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門等，特別是乳桿菌科(Lactobacillaceae)、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)等；針對特異性物種，健康犬樣品43個，胰腺炎患犬樣品107個；健康犬樣品特異性物種主要為伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、脫鐵桿菌科(Deferribacteraceae)和琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)等；胰腺炎患犬樣品特異性物種主要為紅蝽桿菌科(Coriobacteriaceae)、Ruminococcaceae和Leptotrichiaceae等。

圖2 健康犬與胰腺炎患犬腸道菌群組成Fig.2 Composition of intestinal flora in healthy dogs and pancreatitis dogsA:健康犬腸道菌群組成； B:健康犬與胰腺炎患犬腸道菌群種類及分布A:Composition of intestinal flora in healthy dogs； B:Species and distribution of intestinal flora in healthy dogs and pancreatitis dogs

對測序樣品的α-多樣性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多樣性指數(shù)Chao1、Observed species、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)(Mean±SD)健康犬分別為93.85±58.77、27.75±6.50、3.73±0.40和0.86±0.04,胰腺炎患犬樣品分別為83.83±52.93、29.13±9.73、3.77±1.15和0.82±0.20。以上結(jié)果表明，胰腺炎患犬腸道菌群的組成及多樣性與健康犬仍然差異較大(P=0.000 3)。

健康犬與胰腺炎患犬腸道菌群豐度比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬和鏈球菌屬等有益菌群豐度，健康犬分別為0.007 3、0.001和0.006，而胰腺炎患犬分別為0.002 7、0.002和0.002。健康犬雙歧桿菌屬和鏈球菌屬菌群豐度略高于胰腺炎患犬，表明胰腺炎患犬有益菌群豐度低。

2.3 菌群功能預(yù)測 健康犬和胰腺炎患犬樣品菌群在糖類和氨基酸等代謝功能分布的分析結(jié)果見圖4。兩組犬腸道菌群代謝相關(guān)功能的分析數(shù)據(jù)顯示，健康犬與胰腺炎患犬遺傳信息過程相關(guān)功能比值為17.5%/17.2%，其中復(fù)制和修復(fù)功能為7.7%/7.4%、翻譯功能為4.7%/4.5%；細(xì)胞過程相關(guān)功能比值為3.0%/2.5%，其中細(xì)胞運動功能為2.3%/1.8%。因此，健康犬的遺傳信息過程和細(xì)胞過程相關(guān)功能分布值比胰腺炎患犬略高。而環(huán)境信息過程相關(guān)功能比值為15.6%/16.5%，其中膜轉(zhuǎn)運功能為13.3%/14.2%，健康犬環(huán)境信息過程相關(guān)功能分布值比胰腺炎患犬略低。綜上，健康犬與胰腺炎患犬在腸道菌群代謝相關(guān)功能分布值上略有差異，但總體差異不顯著(P=0.352)。

3 討論

本試驗結(jié)果表明，犬腸道正常菌群主要以厚壁菌門和擬桿菌門為主，該結(jié)果與已報道的研究結(jié)果一致[15]。在腸道細(xì)菌的所有功能研究中，促進宿主健康和預(yù)防疾病方面的研究較多，如通過產(chǎn)生抗微生物物質(zhì)(如有機酸、細(xì)菌素)以及競爭營養(yǎng)和生存空間預(yù)防病原微生物[16]；探討發(fā)病機制以及腸道菌群如何保護宿主并設(shè)計治療方法、保護宿主[17]。目前，尚無胰腺炎患犬與腸道菌群相關(guān)性的研究。在消化系統(tǒng)疾病中，通過比較腹瀉幼犬和健康幼犬糞便樣品菌群差異發(fā)現(xiàn)，腹瀉犬樣品腸球菌和乳酸桿菌的數(shù)量降低極為顯著，雙歧異桿菌和類桿菌的數(shù)量顯著減少，而腸桿菌的數(shù)量變化不顯著[18]。本試驗對健康犬和胰腺炎患犬的腸道菌群組成及多樣性比較發(fā)現(xiàn)，兩者主要菌群結(jié)構(gòu)未變，部分菌群特異性出現(xiàn)/消失；同時發(fā)現(xiàn)胰腺炎患犬與健康犬相比，腸道菌群種類和多樣性降低，乳桿菌屬、鏈球菌屬等有益菌群豐度顯著下降。

圖3 健康犬與胰腺炎患犬的腸道菌群豐度Fig.3 Abundance of intestinal flora in healthy dogs and pancreatitis dogs

圖4 健康犬與胰腺炎患犬的腸道菌群功能分布Fig.4 Functional distribution of intestinal flora in healthy dogs and pancreatitis dogs

目前，益生菌已用于犬胃腸疾病治療。鑒于胰腺炎患犬的腸道菌群豐度相對較低、有益菌群數(shù)量減少，是否可以考慮對胰腺炎患犬進行益生菌治療呢？已經(jīng)確認(rèn)，益生菌無毒副作用、無耐藥性以及無殘留等特點，可改善腸道微生物平衡從而對宿主健康產(chǎn)生有益的影響[19]。有研究表明，益生菌對宿主健康有不同的有益作用，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎或競爭潛在病原體的營養(yǎng)素或黏附位點[20]。益生菌制劑通常含乳酸桿菌和雙歧桿菌、鏈球菌屬、芽孢桿菌屬等單一菌株或組合菌株。其中乳酸菌通過粘附定植在動物腸道內(nèi)可以減少腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)；同時還可產(chǎn)生天然抗菌物質(zhì)，刺激腸道局部免疫反應(yīng)，并抑制致病菌的生長繁殖或?qū)⑵錃?，從而達到防治疾病效果[21]。因此，建議臨床上可以嘗試應(yīng)用乳酸桿菌、鏈球菌屬等益生菌治療胰腺炎患犬。

綜上所述，本試驗基于16S rRNA 擴增子測序技術(shù)，分別對健康犬和胰腺炎患犬糞便樣品進行檢測并分析，結(jié)果表明，胰腺炎患犬腸道菌群組成及α-多樣性降低；腸道菌群功能總體上不受影響，但部分菌群功能(如遺傳信息過程等方面)會受到較大影響。本試驗為胰腺炎患犬腸道菌群組成提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時，為胰腺炎患犬的治療提供新思路。