張廷輝，湯承浩，王曉銘，胡秀虹▲，鐘艷子，張海蘭

(1黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556011；2凱里學院大健康學院，貴州 凱里 556011)

韭菜根是百合科蔥屬多年生宿根性植物——寬葉韭(AlliumhookeriThwaites)的肉質根，主要產于云貴川和西藏[1-2]。腌韭菜根是貴州黔東南的一款本土特色食品，因其豐富的營養(yǎng)成分、獨特的風味及保健功效，深受當地少數人們的喜愛。不過，韭菜根原料水分含量高又營養(yǎng)豐富，極易造成袋裝產品在貯存過程中的腐敗。研究表明，腌制蔬菜的變質在一定程度上與其腐敗微生物的數量密切相關[3]。課題組研究發(fā)現致使腌韭菜根腐敗變質的主要微生物是細菌[4-5]。

目前，測定細菌菌液濃度的方法主要有比濁法[6-7]、平板計數法[8]和顯微鏡計數法等。顯微鏡計數法雖然快速，但不能做出宏觀、全面的反應；平板計數法重復性、平行性好但速度慢、工作量大；比濁法測定的一般為細菌總數(活菌數+死菌數)，具有簡單、快速等優(yōu)點，對無色素產生、菌液顏色較淺的細菌而言，是一個不錯的選擇[9]。嚴佩峰、曹國珍等[10-11]研究發(fā)現，在細菌培養(yǎng)至對數期的某一菌液濃度范圍內，細菌菌液的吸光度與菌液濃度呈正相關性。近年來，也有研究進一步證實，可采用比濁法結合平板計數法得到菌液活菌數與OD600值的線性關系，進而通過吸光度測定能夠快速獲得菌液活菌數[12-14]。本文以腌韭菜根中分離獲得的五種腐敗菌為研究對象，采用比濁法與平板計數法探究菌液活菌數與OD值之間的相關性，以期在腐敗菌的后期腐敗特性、生長特性及防控等研究中為菌液活菌數的測定提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑

試驗用的細菌菌種見表1。常用試劑見表2。

表1 供試菌種Tab.1 Test strains

表2 試驗用試劑Tab.2 Reagents for the test

1.1.2 儀器與設備

FA2004型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺，上海蘇凈實業(yè)有限公司；ZWY-CZ11D型恒溫搖床培養(yǎng)振蕩器，上海智誠分析儀器有限公司；BGZ-246型電熱鼓風干燥箱、SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；LDZX-50kbs型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；BIO-BRI型酶標儀，成都百樂科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液的制備

在無菌操作下，將4 ℃保藏的菌種，取2環(huán)接種到100 mL肉湯培養(yǎng)基中180 r/min、30 ℃恒溫培養(yǎng)15～18 h。用移液管依次取菌液5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL分別置于編號為A、B、C、D、E的五個試管中，并用生理鹽水稀釋至10 mL，得到同株菌五個不同濃度梯度的菌懸液。

1.2.2 菌液活菌計數

參照GB 4789.2—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》標準中的菌落計數方法，測定腌韭菜根中各腐敗細菌菌液的活菌數[15]，以cfu/g表示。具體操作如下：將五個編號的離心管分別進行1∶10倍梯度稀釋，分別吸取10-5、10-6、10-7稀釋度菌液1 mL涂布于無菌平皿內，待干燥后倒置于(36±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進行菌落總數測定。以滅菌生理鹽水作空白對照，平行實驗三次。

1.2.3 菌液OD值測定

使用移液槍移取編號 A、B、C、D、E五個離心管中的各菌懸液200 μL置于專用96孔板中，用酶標儀在600 nm波長下測定其吸光度值。因菌懸液存在一定的濁度，使得它對光有一定的吸收，故可在特定波長下測量菌懸液的吸光度來體現細菌菌液的濃度[16]。

1.2.4 標準曲線的繪制

以菌液活菌數(cfu/mL)作為縱坐標，菌液的OD600值作為橫坐標，繪制各腐敗細菌的菌液活菌數與吸光度的標準曲線。

1.2.5 數據處理

試驗數據利用Excel 2010進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 B2菌液OD值與活菌數的相關性

B2不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數及菌落總數(活菌數)結果如表3所示。由表3可知，B2各稀釋菌液的OD600均值在0.1003～0.3936，活菌數為6.1×107～13.8×107cfu/mL。

表3 B2各稀釋菌液的OD600值與活菌數Tab.3 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B2 bacterial solution

以B2菌懸液的OD600值為橫坐標，活菌數為縱坐標，繪制OD600值與活菌數的線性關系圖，如圖1。由圖1可知，B2菌懸液的OD600值與其活菌數呈現良好的線性關系，其線性方程為y=25.81x+3.25，R2=0.9842。

圖1 B2菌液活菌數與OD600相關性標準曲線圖Fig.1 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B2 bacterial solution

2.2 B5菌液吸光度與活菌數的相關性

B5不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數及菌落總數(活菌數)結果如表4所示：B5各稀釋菌液的OD600均值在0.0734～0.3551，活菌數為3.4×107～8.5×107cfu/mL。

表4 B5各稀釋菌液的OD600值與活菌數Tab.4 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B5 bacterial solution

B5菌液OD600值與活菌數的相關性標準曲線如圖2所示。由圖2可知，線性方程為y=16.63x+2.64，R2=0.9357，表明B5菌懸液的OD600值與其活菌數線性關系良好。

圖2 B5菌液活菌數與吸光度相關性標準曲線圖Fig.2 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B5 bacterial solution

2.3 B7菌液吸光度與活菌數的相關性

B7不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數及菌落總數(活菌數)結果如表5所示：B7各稀釋菌液的OD600均值在0.0886～0.3911，活菌數為0.8×108～5.9×108cfu/mL。

表5 B7各稀釋菌液的OD600值與活菌數Tab.5 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B7 bacterial solution

B7菌液OD600值與活菌數的相關性標準曲線如圖3。由圖3可知，線性方程為y=16.16x-0.0035，R2=0.9268，表明B7菌懸液的OD600值與其活菌數線性關系良好。

圖3 B7菌活菌數與吸光度相關性標準曲線圖Fig.3 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B7 bacterial solution

2.4 B8菌液吸光度與活菌數的相關性

B8不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數及菌落總數(活菌數)結果如表6所示： B8各稀釋菌液的OD600均值在0.1067～0.6489，活菌數為1.1×106～4.9×106cfu/mL。

表6 B8各稀釋菌液的OD600值與活菌數Tab.6 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B8 bacterial solution

以菌懸液的OD600值為X軸，活菌數為Y軸，繪制B8菌液OD600值與活菌數的相關性標準曲線，見圖4。從圖4不難發(fā)現，標準曲線回歸方程為y=7.25x+0.30，R2=0.9926，表明B8菌液OD600值與活菌數的線性關系良好。

圖4 B8菌液活菌數與吸光度相關性標準曲線圖Fig.4 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B8 bacterial solution

2.5 B11菌液吸光度與活菌數的相關性

B11不同稀釋菌液的OD600值、平板菌落數及菌落總數(活菌數)結果如表7所示： B11各稀釋菌液的OD600均值在0.0673～0.3551，活菌數為3.1×107～15.1×107cfu/mL。

表7 B11各稀釋菌液的OD600值與活菌數Tab.6 OD600 value and number of live bacteria of eachdiluted B11 bacterial solution

B11菌液OD600值與活菌數的相關性標準曲線如圖5。由圖5可知，線性方程為：y=40.31x+0.83，R2=0.9890，表明B11菌懸液的OD600值與其活菌數線性關系良好。

圖5 B11菌液活菌數與吸光度相關性標準曲線圖Fig.5 Standard curve of correlation between number of livebacteria and OD600 value of B11 bacterial solution

3 結論與討論

相同條件下培養(yǎng)供試菌(土揚芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、萵苣不動桿菌、解淀粉芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌)特定時間，并依次按0.5、0.4、0.3、0.2、0.1的梯度對各供試菌菌懸液進行稀釋，得到其OD600值的范圍分別為：0.1003～0.3936、0.0734～0.3551、0.0886～0.3911、0.1067～0.6489和0.0673～0.3551；活菌總數范圍為：6.1×107～13.8×107cfu/mL、3.4×107～8.5×107cfu/mL、0.8×108～5.9×108cfu/mL、1.1×106～4.9×106cfu/mL和3.1×107～15.1×107cfu/mL。對比不難發(fā)現，不同的菌種由于生長速度不同，其菌液濃度(吸光度及活菌總數)有很大的區(qū)別。

林靜等[11]研究發(fā)現，在一定濃度范圍內，菌液的吸光度與其活菌數成良好的線性關系，根據其線性方程測得吸光度就可得出相應菌液的活菌數，且計算所獲得的活菌數的準確度越高，線性方程相關性系數(R2)需越接近1。本文進一步研究腌韭菜根中的5種供試菌菌液的OD600值與活菌數的相關性，得到其線性方程及相關性系數為：土揚芽孢桿菌：y=25.81x+3.25，R2=0.9842；巨大芽孢桿菌y=16.63x+2.64，R2=0.9357；萵苣不動桿菌y=16.16x-0.0035，R2=0.9268；解淀粉芽孢桿菌：y=7.25x+0.30，R2=0.9926；蠟樣芽孢桿菌y=40.31x+0.83，R2=0.9890。該研究對腌韭菜根中的腐敗菌的深入研究以及菌液濃度的快速測定具有十分重要的意義。