馬艷萍，黃全云，汪昌燕，李 劍，韓青忠，闞 威★

（1.青海省動物疫病預(yù)防控制中心 810001；2.青海省祁連縣動物疫病預(yù)防控制中心 810499）

作為一種人畜共患病，犢牦牛副傷寒的致病菌為都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌，表現(xiàn)多以胃腸炎及敗血癥為主，胃腸炎以下痢為臨床代表性癥狀，故又稱為“犢牛拉稀病”[1]。犢牦牛病起初的臨床表現(xiàn)為心跳過快、體溫升高，呼吸急促，精神懶散，食欲較差，可見腹式呼吸，并且伴有腹瀉等癥狀，排出稀糞，可聞極惡臭。成年牛發(fā)病大部分都是以急性敗血癥出現(xiàn)，疾病過程又急又短，癥狀猛烈，死亡幾率很高，若是人類對病牛肉進(jìn)行食用，則會造成食物中毒[2]。本病對各年齡階段的牛均有易感性，特別是1月齡左右的犢牦?；疾〉膸茁瘦^高。該疾病的傳染源以病牛、帶菌牛為主，都柏林沙門氏菌長時間藏匿于帶菌牛的膽囊里，而且不斷地隨著糞便一起排出，但是鼠傷寒沙門氏菌或許源自于飲水、環(huán)境、其他的動物等。此疾病的傳染途徑以消化道為主。除此以外，帶菌牛在潮濕、氣候突變等不良外界條件的干擾之下，亦有出現(xiàn)內(nèi)源性傳染的可能性。犢牛沒有飲初乳或是飲初乳量過少，也會使其自身的抵抗力減弱，從而引發(fā)此疾病。本病的發(fā)生與季節(jié)之間沒有較大的關(guān)聯(lián)性，而且可以快速傳播，往往表現(xiàn)為地方性流行。成年牛放牧季節(jié)，一般多為散發(fā)性。上個世紀(jì)50年代，此疾病在我們國家牦牛產(chǎn)區(qū)開始流行，而且在70、80年代出現(xiàn)發(fā)病高峰，發(fā)病率、死亡率分別為15%～65%、30%～85%，致使養(yǎng)殖戶損失慘重[3]。

自2019年6月份起，青海省祁連縣野五個鄉(xiāng)鎮(zhèn)即牛溝鄉(xiāng)、央隆鄉(xiāng)、峨堡鎮(zhèn)、默勒鎮(zhèn)、八寶鎮(zhèn)等都出現(xiàn)了生犢牛腹瀉的情況，而且發(fā)病牛大多都在2月齡以內(nèi)，表現(xiàn)為沒有規(guī)律的散發(fā)狀態(tài)，一些患畜會拉稀，排出稀糞，而且呈黏液狀，黃綠色或者黃白色，并呈腹式呼吸，部分犢牦牛還有皮膚真菌感染。通過實地走訪調(diào)查發(fā)病情況，采集已死亡犢牦牛患病臟器1份，進(jìn)行了實驗室細(xì)菌學(xué)分離鑒定，最終確定病原為鼠傷寒沙門氏菌，同時對分離株細(xì)菌進(jìn)行了藥敏試驗，以便對犢牦牛副傷寒的臨床治療和綜合防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢材料

無菌采集死亡犢牦牛患病臟器（肝、肺）1份，作為試驗檢測病料。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備

試劑：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、HE瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵斜面、血瓊脂平板、MH瓊脂培養(yǎng)基和MH液體培養(yǎng)基；細(xì)菌微量生化鑒定管、K-B法藥敏紙片（26種），0.5麥?zhǔn)媳葷峁?，均購于杭州微生物試劑有限公司；DNA提取試劑盒、瓊脂糖、2000DNA Marker、50×TAE、PCR反應(yīng)預(yù)混酶，均購于北京全式金公司。

設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、PCR擴增儀(Bio-RAD，Mexico)，水浴恒溫振蕩器，凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RAD，USA），DYY-12型電腦三恒多用電泳儀、DYCP-31A型電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.1.3 引物合成

針對相關(guān)文獻(xiàn)[4]的參考，通過運用南京金斯瑞生物科技有限公司合成細(xì)菌鑒定對通用引物16S rRNA基因引物，相關(guān)序列以及大小等見下表1能夠具體體現(xiàn)出來。

表1 16S rRNA基因PCR擴增引物

1.2 方法

1.2.1 病料觸片鏡檢

將肝臟和肺臟病變部位觸片酒精火焰固定之后，做革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 病原分離培養(yǎng)

將肝臟、肺臟接種于營養(yǎng)肉湯增菌；取24h的肝臟、肺臟增菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純化培養(yǎng)；純化菌落劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板、HE瓊脂平板、三糖鐵斜面、血瓊脂平板，在37℃條件下完成24h的培養(yǎng)之后，對菌落的形態(tài)進(jìn)行觀察；隨機選出疑似目標(biāo)單菌落接種于營養(yǎng)肉湯以及MH液體培養(yǎng)基，進(jìn)行24h的培養(yǎng)，涂片革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 生化鑒定

參考《獸醫(yī)微生物》第四版[5]，沙門菌屬生化特性鑒定表。將血清肉湯24h培養(yǎng)物按照《腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管說明書》（杭州微生物試劑有限公司），接種于生化反應(yīng)管，觀察反應(yīng)結(jié)果。見下表2。

表2 沙門菌屬生理生化指標(biāo)

1.2.4 16S rRNA基因PCR擴增及測序

將純化之后的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物作為參考，并依照細(xì)菌DNA進(jìn)行試驗，提取其細(xì)菌基因組，運用在PCR反應(yīng)模板中。16S rRNA基因PCR擴增體系是50μL：PCR預(yù)混酶、雙蒸水、DNA模板分別為25μL、 21μL、2μL，而上、下游引物則各為1μL。PCR擴增條件：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，需循環(huán)30次；72℃10 min。目的條帶大小為194bp，PCR產(chǎn)物的測序工作由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成，將所獲結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫里做Blast比較分析。

1.2.5藥敏試驗

藥敏試驗對Kirby—Bauer法進(jìn)行了運用。選用單個菌落接種在MH液體培養(yǎng)基中，通過對37℃的溫度實施16h的培養(yǎng)，并且還要把菌液濃度調(diào)制成0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?.0×108CFU/mL）。移取200μL，借助移液器來完成，緊接著用涂菌棒在M-H瓊脂平板上進(jìn)行勻稱涂布，待培養(yǎng)基表面干燥之后放置藥敏紙片，使之與該表面緊密相貼，在37℃的條件下進(jìn)行24h的培養(yǎng)，對抑菌圈直徑進(jìn)行測定，借助游標(biāo)卡尺來完成，并基于對杭州微生物試劑有限公司所供的藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)的參考，就分離菌對藥物的敏感性做出判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料鏡檢和糞便蟲卵檢查結(jié)果

病料當(dāng)中都能夠把革蘭氏陰性直桿菌檢測出來，散在。

2.2 病原分離培養(yǎng)及菌落形態(tài)特征

通過肺臟對株細(xì)菌進(jìn)行分離，利用營養(yǎng)瓊脂平板能夠見其成圓形隆起、濕潤、光滑、邊緣齊整、半透明光澤、灰白色菌落； HE瓊脂平板上表現(xiàn)為琥鉑色菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上表現(xiàn)為無色菌落；血瓊脂平板上呈無溶血現(xiàn)象。

2.3 生化鑒定結(jié)果

表3 分離株細(xì)菌生化鑒定試驗結(jié)果統(tǒng)計表

2.4 16S rRNA基因擴增結(jié)果

圖4 分離株細(xì)菌16S rRNA PCR擴增結(jié)果

2.5 16S rRNA基因同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

對分離菌株細(xì)菌16S r RNA基因做測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因序列在線Blast分析表明，其16S r RNA基因序列與Gen Bank上已登錄(Accession No:NR116126、NR074910、NR074799)的鼠傷寒沙門氏菌的相應(yīng)序列之間存在高度同源性（≥99.0%)。結(jié)果表明，由分離株細(xì)菌形態(tài)特點、生理生化特性、16S r RNA測序結(jié)果可以判斷其為鼠傷寒沙門氏菌。

2.6 藥敏試驗結(jié)果

結(jié)果表明，分離株鼠傷寒沙門氏菌對丁胺卡那霉素、頭孢哌酮、頭孢他啶、多粘菌素B高度敏感；對諾氟沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、環(huán)丙沙星、哌拉西林中度敏感；對青霉素、新霉素、卡那霉素、氨芐西林、克林霉素、頭孢唑啉、羧芐西林、頭孢氨芐、麥迪霉素、氯霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、苯唑西林、慶大霉素、頭孢拉定、紅霉素、萬古霉素具有耐藥性。

3 分析與討論

犢牛副傷寒病于19世紀(jì)中期在歐洲各地發(fā)生，都柏林沙門氏菌與鼠傷寒沙門氏菌混合存在，其分布比例隨年代好國家而異，在歐洲大約以都柏林沙門氏菌占多數(shù)，日本1937～1940年在東北的北部大群發(fā)生犢牛感染腸炎沙門氏菌，但其后幾乎無此病發(fā)生。然而，日本自1965年兵庫縣成群集中育肥的乳用種犢牛流行由鼠傷寒沙門氏菌引起的重癥下痢以來，本病在日本公牛犢集中肥育群中特別多發(fā)。據(jù)文獻(xiàn)報道，在上個世紀(jì)50年代，該病癥在我國牦牛產(chǎn)區(qū)廣為流傳，并且在70、80年代期間比較盛行，發(fā)病率、死亡率分別為15%～65%、30%～85%，致使養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟收益大為受損。在20世紀(jì)80年代，我省黃南州、海南州、海北州、果洛州等地報道有犢牦牛副傷寒病呈爆發(fā)流行。作為青藏高原特有的物種，牦牛是當(dāng)?shù)啬撩窠?jīng)濟收入的關(guān)鍵來源。現(xiàn)如今，在青藏高原牦牛繁殖區(qū)由沙門氏菌所致的以高熱、下痢、昏迷為特征的疾病已經(jīng)對牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了不小的干擾。自2019年6月份以來在祁連縣央隆鄉(xiāng)、野牛溝鄉(xiāng)、默勒鎮(zhèn)、峨堡鎮(zhèn)、八寶鎮(zhèn)五個鄉(xiāng)鎮(zhèn)陸續(xù)發(fā)生牦牛腹瀉癥狀，波及31個牧戶和1個牧業(yè)公司，發(fā)病率在5%～16.1%，死亡率在12.5%～35.4%。結(jié)合臨床癥狀，初步懷疑為犢牦牛副傷寒引起的腹瀉，后經(jīng)實驗室細(xì)菌分離培養(yǎng)及生化實驗等鑒定，確切診斷為因鼠傷寒沙門氏菌引發(fā)的該疾病所致。

從此次對分離株細(xì)菌的藥敏試驗結(jié)果可以看出，該分離株細(xì)菌對丁胺卡那霉素、頭孢哌酮、頭孢他啶、多粘菌素B的敏感度比較高。故而，在臨床應(yīng)用上，防制犢牦牛副傷寒應(yīng)選擇藥敏試驗敏感性藥物，交替使用。

就此次分離得到的沙門氏菌而言，引起該病的沙門氏菌不只是這一種，都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌都有可能引起牦牛致病，因此建議獸醫(yī)主管部門和科技部門引起對該病予以重視，建議設(shè)置專項研究課題，全面系統(tǒng)的進(jìn)行該病的流行病學(xué)調(diào)查和病原學(xué)診斷分析，才能全面的指導(dǎo)該病的防控工作。